DIAGNOSTICS OF CHROMOSOMAL ABBERATIONS BY arrayCGH

Full Text

Введение Метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах (array CGH) позволяет с высокой эффективностью выявлять различные виды хромосомного дисбаланса. При этом с одинаковой эффективностью обнаруживаются как численные аномалии кариотипа (исключая полиплоидии) и крупные структурные перестройки хромосом, выявляемые при стандартном кариотипировании, так и микроделеции и микродупликации, затрагивающие лишь отдельные сегменты хромосом [3, 8]. До недавнего времени для диагностики аномалий кариотипа использовались преимущественно кариотипирование и метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Стандартное кариотипирование с использованием дифференциальной окраски хромосом позволяет идентифицировать многие хромосомные аномалии, но его разрешающая способность недостаточна для того, чтобы идентифицировать перестройки размером менее 4 миллионов п. о. Метод FISH обладает гораздо более высокой чувствительностью, но нацелен на исследование заранее выбранных локусов и не подходит для комплексного сканирования всего генома. Сравнительная геномная гибридизация, называемая иногда «молекулярным кариотипированием», в значительной степени расширила диагностические возможности при проведении медико-генетического консультирования, а также в значительной степени изменила наши представления о генетической природе таких патологий, как задержка психомоторного развития, умственная отсталость, множественные врожденные пороки развития, аутизм [1, 7]. Для проведения сравнительной геномной гибридизации используют микроматрицу, в ячейках которой иммобилизованы ДНК-зонды. Ячейки строго упорядочены, про каждую из них известно, какой именно зонд в ней находится, и какому участку генома он соответствует. В качестве зондов могут выступать клонированные в бактериальных искусственных хромосомах фрагменты ДНК человека (чипы на основе BAC — bacterial artificial chromosome) или синтетические олигонуклеотиды (олигочипы). При постановке эксперимента используют две пробы ДНК — опытная (ДНК пациента) и контрольная (ДНК здорового индивидуума). Опытный и контрольный образцы ДНК метят разными флуоресцентными красителями (например, Су5 и Су3 соответственно), затем смешивают и проводят гибридизацию смеси меченых ДНК с зондами на микроматрице. Результаты гибридизации оценивают с помощью сканера, снимающего количественные показатели флуоресценции для каждой ячейки микроматрицы по двум каналам (длина волны 532 и 635 нм). В том случае, если в опытном образце имеется делеция какого-либо фрагмента ДНК, мы будем наблюдать преимущественную флуоресценцию Су5 (сигнал от контрольной ДНК) в соответствующих ячейках. Если, напротив, в тестовом образце имеется дупликация какого-либо участка, в определенных ячейках мы сможем зарегистрировать преимущественно сигнал флуорофора Су3. С помощью программного обеспечения производится математическая обработка полученных данных, по результатам которой может быть построен виртуальный кариотип — цифровой аналог реального кариотипа, содержащий информацию о возможных делециях и дупликациях генетического материала. Разрешающая способность молекулярного кариотипирования зависит от типа используемого чипа и может достигать 200 п. о. при использовании олигочипов высокого разрешения [6, 8]. В данной статье описаны результаты, полученные при использовании ВАС-чипов CytoChip 3.0 и 4.0 и программы OneClickCGH производства компании PerkinElmer. Применение метода аCGH для диагностики хромосомных аномалий 1. Идентификация маркерной хромосомы и природы добавочного генетического материала, выявляемого при стандартном кариотипировании на какой-либо хромосоме, может быть довольно затруднительной. Стандартным методом уточняющей диагностики в такой ситуации является FISH, но для ее проведения может понадобиться большое число раундов гибридизации или работа с многоцветными цельнохромосомными зондами. Метод сравнительной геномной гибридизации позволяет легко решить эту проблему, при этом могут быть получены дополнительные сведения о характере хромосомной перестройки. На рисунке 1 приведены результаты анализа методом aCGH у двух пациентов с выявленными ранее аномалиями кариотипа. У пациента К. при кариотипировании был обнаружен добавочный материал неизвестного происхождения на хромосоме 13; сравнительная геномная гибридизация позволила идентифицировать присутствие в геноме дополнительной копии участка длинного плеча q14.11-q34 хромосомы 13 (рис. 1 а). У пациентки Е. был выявлен дополнительный материал на хромосоме 8. При проведении анализа методом aCGH была выявлена сложная хромосомная перестройка. Установлена крупная интерстициальная дупликация участка короткого плеча p11.23-p24 в сочетании с концевой делецией участка p23.2–23.3 короткого плеча хромосомы 8 (рис. 1 б). 2. Уточнение границ хромосомных перестроек, выявленных при стандартном кариотипировании. На рисунке 2 представлены стандартный и виртуальный кариотипы пациентки М., проходившей обследование по поводу вторичного бесплодия и планирования беременности с применением вспомогательных репродуктивных технологий. При кариотипировании была выявлена делеция двух сегментов длинного плеча хромосомы Х, либо Хq23q24, либо Хq25q26. Сравнительная геномная гибридизация позволила уточнить границы делеции длинного плеча q25q26.3 хромосомы Х и правильно подобрать зонды для проведения преимплантационной диагностики методом FISH. 3. Выявление несбалансированных хромосомных перестроек. Одной из сложнейших проблем при медико-генетическом консультировании является решение вопроса о сбалансированости хромосомных перестроек. В отдельных случаях разрешающая способность стандартного кариотипирования недостаточна для того, чтобы выявить возможный хромосомный дисбаланс. Для решения этой задачи можно использовать диагностику методом FISH, однако в этом случае практически каждый пациент нуждается в индивидуальном подборе нескольких зондов, которые позволяют маркировать точки разрыва. Подобная диагностика весьма трудоемка и может не дать необходимой информации. Метод сравнительной геномной гибридизации в этом случае оказывается оптимальным — он позволяет выявить любой существующий хромосомный дисбаланс в пределах разрешающей способности микроматрицы. Пример такой диагностики приведен на рисунке 3. У пациентки Р. была выявлена неунаследованная транслокация 46,Х,t(X;7)(q21; q10), по данным кариотипирования — сбалансированная. Однако у пациентки наблюдались низкий рост, множественные кисты внутренних органов и ряд микроаномалий, что заставляло усомниться в сбалансированности кариотипа. При проведении сравнительной геномной гибридизации была выявлена делеция подсегмента q21.31 хромосомы Х размером 3,5 млн п. о. и не было выявлено изменений копийности последовательности хромосомы 7. Таким образом, была установлена частичная моносомия по подсегменту q21.31 хромосомы Х, расположенному в точке разрыва. 4. Микроаномалии хромосом при МВПР и нормальном кариотипе. Сравнительно недавно была выделена новая группа наследственной патологии — микроцитогенетические синдромы, связанные с небольшими делециями и дупликациями отдельных сегментов хромосом. Во многих случаях их клиническая диагностика не вызывает сомнений, а способом подтверждающей диагностики является FISH. Однако в ряде случаев (например, при ранней диагностике) клиническая картина заболевания может быть не типична, а индивидуальные фенотипические особенности пациента могут затруднять диагностику. Кроме того, к МВПР и врожденной патологии могут приводить не только сравнительно распространенные аномалии, но и редкие и уникальные микроперестройки, не идентифицируемые при стандартном кариотипировании. На рисунке 4 представлены результаты aCGH анализа пациентки К. в возрасте 1 месяца. У девочки отмечалась задержка внутриутробного развития, порок сердца, задержка психомоторного развития, дизморфичный фенотип, что не формировало клиническую картину, специфичную для какого-либо известного наследственного синдрома. При проведении анализа была выявлена делеция сегмента q11.23 хромосомы 7 размером 1,1 млн п. о., что позволило установить диагноз синдрома Вильямса. Дальнейшее наблюдение за пациенткой, действительно, позволило увидеть формирование типичной картины данного микроделеционного синдрома. Заключение Метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах позволяет обнаружить большинство несбалансированных хромосомных аномалий, таких как численные хромосомные аномалии, делеции и дупликации участков хромосом размером от 200 п. н. (при использовании олигонуклеотидных микроматриц) и от 0,5 млн п. н. (при использовании чипов на основе BAC). Возможно выявление мозаичных анеуплоидий, если доля аномального клона не ниже 10 % [2]. При проведении aCGH невозможно установление сбалансированных хромосомных перестроек (инверсий и транслокаций, в т. ч. робертсоновских), полиплоидии, однородительской дисомии (ОРД) и точковых генных мутаций. Применение олигонуклеотидных микроматриц, которые позволяют тестировать SNP и одновременно проводить сравнительную геномную гибридизацию дает возможность расширить диагностические возможности метода aCGH и выявлять полиплоидию, ОРД и мажорные генные мутации. В постнатальной диагностике причин МВПР, умственной отсталости, ЗПМР, расстройств аутического спектра сравнительная геномная гибридизация является наиболее информативным методом, позволяющим выявить причину патологии в 15–20 % случаев [1, 3, 4]. Метод aCGH начинает все шире применяться при преимплантационном генетическом скрининге на клетках трофэктодермы, заметно повышая эффективность ЭКО [5]. Метод aCGH также применяется при проведении пренатальной диагностики, однако его повсеместное внедрение ограничивают трудности интерпретации полученных данных и достаточно высокая стоимость микрочипов. Применение метода aCGH может быть исключительно полезным при проведении медико-генетического консультирования для уточнения диагноза и выявления причин заболевания. Этот подход имеет намного более высокую разрешающую способность, чем стандартное кариотипирование, и гораздо более универсален, чем диагностика методом FISH. Применение его ограничено высокой стоимостью оборудования и расходных материалов, Однако во многих случаях только aCGH может дать информацию о причинах заболевания и сделать возможной эффективную пренатальную диагностику.

About the authors

Olga Viktorovna Malysheva

City Diagnostic center of medical genetics

Email: omal99@mail.ru
geneticist, PhD

Aleksandr Nikolayevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: alexbar@mail.ru
senior researcher, PhD

Anna Andreyevna Pendina

City Diagnostic center of medical genetics

Email: pendina@mail.ru
cytogenetics, PhD

Yelena Sergeyevna Shabanova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: le_shaja@mail.ru
regular doctor geneticist

Vladislav Sergeyevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: baranov@VB2475.spb.edu
MD, professor, Head of laboratory for Prenatal Diagnosis

References

Supplementary files