Endometrial stem cells expansion capability for local and systemic routes of administration in a model of experimentally injured endometrium

Full Text

Введение В настоящее время клеточные технологии активно используются в комплексной терапии различных заболеваний человека [1]. Давно описана роль стволовых клеток в физиологии и патологии репродуктивной системы [2-4], и изучение возможностей клеточных технологий в области репродуктивной медицины рассматривается в настоящее время как одно из наиболее актуальных и перспективных направлений. Терапевтическое использование стволовых клеток может иметь особое значение в приложении к патологическим состояниям эндометрия, обусловленным его функциональной недостаточностью. Несмотря на то что ткань эндометрия является источником стволовых клеток с доказанной терапевтической эффективностью [5-7], сообщения о результатах использования стволовых клеток эндометриального происхождения в репродуктивной медицине в доступной литературе отсутствуют. Целью данной работы является анализ эффективности влияния эндометриальных стволовых клеток на поврежденный эндометрий с применением различных способов введения в организм модельных животных, позволяющих получить оптимальный репаративный эффект. Методика В качестве модельных животных с поврежденным эндометрием были использованы эстрогенизированные самки кролика с имплантированными на париетальную брюшину передней брюшной стенки фрагментами аутологичного эндометрия общехирургическим методом, определяющим механический характер флогогенного фактора (Патент на изобретение RU 2533739 «Способ моделирования хронических воспалительных заболеваний женских половых органов в эксперименте») [8]. Выделение стволовых клеток из менструальной крови производилось по разработанной в Институте цитологии РАН методике [2, 9]. Использованный клеточный продукт на основе эндометриальных стволовых клеток (ЭСК) представляет собой первичную культуру ЭСК, выделенных из менструальной крови человека на 5-10 пассажах, поскольку в этот период они сохраняют свои первоначальные свойства и их можно получить в достаточном количестве для трансплантации. Для оценки направленности экспансии и репаративного влияния ЭСК использована суспензия ЭСК с итоговой концентрацией 1 ∙ 105 ЭСК в 1 мкл. Забор менструальной крови производился у обследованных женщин-доноров репродуктивного возраста на 2-3-й день менструального цикла в асептических условиях активно урогенитальным зондом типа С, вводимым трансцервикально до уровня внутреннего зева [9]. В эксперименте использовались 36 самок кроликов породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг в возрасте от 1 до 2,5 года. Модельные животные методом случайной выборки были разделены на две группы. Основную экспериментальную группу составили 20 животных, которым производилась инъекция клеточного продукта (подгруппа 1а; n = 10) или плацебо (подгруппа 1б; n = 10) локально в имплант на 7-е сутки после имплантации. Группу сравнения составили 16 животных, которым введение клеточного продукта (подгруппа 2а; n = 8) или плацебо (подгруппа 2б; n = 8) производилось внутривенно в те же сроки. Всем модельным животным клеточный продукт и раствор плацебо вводились в объеме 20-40 мкл. В качестве плацебо-контроля был использован фосфатно-солевой буфер. Перед введением и независимо от планируемого способа введения ЭСК и фосфатно-солевого буфера у модельных животных проводился частичный забор имплантов эндометрия для гистологического и иммуногистохимического исследований с целью контроля состоятельности модельных животных заданным параметрам повреждения эндометрия согласно патенту RU 2533739. С целью профилактики послеоперационных осложнений всем животным проводилась антибактериальная терапия (цефтриаксон в дозе 50 мг/кг/сут в течение 5 суток). Введение ЭСК или фосфатно-солевого буфера внутривенным путем или локально осуществлялось только через 48 часов после окончания антибактериальной терапии. Два модельных животных контрольной подгруппы 1б погибли на 3-и и 5-е сутки после локального введения плацебо в связи с развитием гнойно-септических осложнений в зоне импланта аутологичного эндометрия. Вывод животных из эксперимента и забор ткани имплантов для исследования производились на 10-й день после инъекции клеточного продукта или плацебо. От каждого экспериментального животного было получено по 3 импланта аутологичного эндометрия. Объем одного импланта эндометрия позволял использовать до 7-9 образцов ткани для последующих исследований. Морфологическая оценка состояния имплантов проводилась микроскопическим методом с окраской гематоксилином и эозином. С целью молекулярной характеристики реакции ткани на флогогенный агент в имплантах эндометрия учитывалось содержание натуральных киллерных клеток (NK-клеток), определяющих антигеннезависимую надзорную функцию: цитотоксических CD16+ клеток и клеток - регуляторов провоспалительных цитокинов CD56+. Присутствие стволовых клеток в имплантах эндометрия подтверждалось иммуногистохимическим исследованием с использованием антител к маркерам мезенхимальных стволовых клеток CD90 и CD105. Уровень экспрессии изучаемых факторов определяли с использованием специфических моноклональных антител (DAKO cytomation, Дания; ThermoScientific Lab., США). При оценке результатов иммуногистохимического окрашивания с антителами в отношении факторов CD16, CD56, CD90 и CD105 учитывалось позитивное окрашивание цитолеммы клеток. Относительная площадь экспрессии рассчитывалась как отношение площади с иммунопозитивными клетками к общей площади поля зрения с клетками, выраженное в процентах. Статистическая обработка результатов выполнялась на персональном компьютере с использованием стандартного пакета Microsoft Excel 2016 и пакета прикладных программ Statistica for Windows, версия 8.0, StatSoft Inc. (США). В ходе статистической обработки использовались методы параметрического и непараметрического анализа. Статистическую значимость различий в связи с невозможностью оценить нормальность распределения проводили с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни, χ2 и точного критерия Фишера. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05 (95 %-й уровень значимости) и р < 0,01 (99 %-й уровень значимости). Результаты исследования Макроскопическая оценка состояния имплантов животных всех групп производилась интраоперационно до введения клеточного продукта и повторно до иссечения имплантов на 10-й день после инъекции клеточного продукта или плацебо. Использовались следующие описательные характеристики: форма имплантированного фрагмента эндометрия и его отношение к поверхности брюшины, наличие гиперемии в зоне имплантации, ее распространенность и степень выраженности, наличие спаечного процесса в брюшной полости, его характер и локализация. Сравнительный анализ макроскопических характеристик имплантов эндометрия после введения клеточного продукта показал, что импланты после локального введения суспензии стволовых клеток характеризуются меньшей частотой развития выраженной гиперемии и чаще имеют правильную округлую форму. Кроме того, у модельных животных, получивших локальную инъекцию клеточного продукта, чаще наблюдалось отсутствие спаечного процесса в области имплантов (табл. 1). В качестве морфологических признаков, характеризующих наличие и динамику хронического воспалительного процесса в ткани имплантов эндометрия, использовались следующие: наличие эндометриальных желез, неравномерный щелевидный промежуток между имплантом и подлежащей брюшиной, воспалительная лейкоцитарная инфильтрация стромы и обнаружение в составе инфильтратов плазматических клеток, отек стромы, очаговый фиброз стромы, склеротические изменения стенок спиральных артерий и стаз эритроцитов. Сравнительная оценка выраженности морфологических проявлений воспалительной реакции в имплантах эндометрия при локальном и системном введении суспензии эндометриальных стволовых клеток показала, что в имплантах, полученных после локального введения клеточного продукта, с достоверно большей частотой наблюдаются воспалительные инфильтраты стромы (р = 0,0007), тогда как отек стромы (р = 0,0002), стаз эритроцитов (р = 0,015) встречались с достоверно меньшей частотой, чем при системном введении. Очаговый фиброз и склеротические изменения стенок спиральных артерий в имплантах после локального введения стволовых клеток также были менее выраженны, однако межгрупповые различия по этим признакам не были статистически значимыми (р = 0,25 и р = 0,40 соответственно) (табл. 2). При помощи иммуногистохимического метода в ткани имплантов эндометрия определялись цитотоксичные NK-клетки (CD16+, CD56+), отражающие выраженность воспалительных процессов, а также клетки, экспрессирующие маркеры CD90 и CD105 - мезенхимальные стволовые клетки. После локального введения эндометриальных стволовых клеток относительная площадь экспрессии маркеров CD16 и CD56 была со статистической достоверностью выше в сравнении с аналогичными показателями, полученными после системного введения стволовых клеток (р = 0,027 и р = 0,0025 соответственно) (табл. 3). В ходе иммуногистохимического исследования было выявлено, что клетки, экспрессирующие маркеры CD90 и CD105, обнаруживались в имплантах всех животных, получивших инъекцию суспензии стволовых клеток, как после локального (подгруппа 1а), так и после внутривенного (подгруппа 2а) введения. В имплантах эндометрия животных подгрупп 1б и 2б после соответственно локального или системного введения плацебо клетки CD90+ и CD105+ обнаружены не были (см. табл. 3). Обсуждение результатов Способность стволовых клеток к направленной миграции и экспансии в поврежденных тканях показана не только на экспериментальных моделях ряда патологических состояний, но и в нескольких преклинических исследованиях [10-13]. Механизмы, обеспечивающие миграцию и хоуминг стволовых клеток, сводятся к взаимодействию белковых лигандов, синтезирующихся поврежденными тканями, с поверхностными рецепторами стволовых клеток [14, 15]. Эндометриальные стволовые клетки, которые во многом схожи с мезенхимальными стволовыми клетками, также способны к миграции в различные поврежденные ткани [6, 16, 17]. Стремление исследователей использовать направленную миграцию стволовых клеток в терапевтических целях объясняет большое количество работ по изучению эффективности и поиску новых путей введения стволовых клеток [18]. R.J. Henning et al. (2007) на экспериментальной модели инфаркта миокарда провели сравнительный анализ эффективности нескольких путей введения клеточного продукта. Было показано, что стволовые клетки, введенные в толщу мышцы сердца, уменьшают размеры постинфарктного рубца на 93 % в сравнении с контрольным, а стволовые клетки, введенные внутривенно, - лишь на 75-77 % [19]. P.P. Panciani et al. (2012) на экспериментальной модели глиомы также показали терапевтическое преимущество локального (интракраниального) пути введения стволовых клеток перед системным введением [20]. Авторы исследования сделали вывод, что создание тканевого депо стволовых клеток является одним из преимуществ локального пути введения [20]. Для изучения направленной экспансии и репаративного эффекта клеточного продукта на основе эндометриальных стволовых клеток при различных путях введения нами была использована экспериментальная модель повреждения эндометрия. Процесс моделирования патологического состояния представлял собой имплантацию участков аутологичного эндометрия на париетальную брюшину животного с использованием общехирургической техники. Преимуществом данной экспериментальной модели является возможность неоднократного забора ткани имплантов для мониторинга морфологических и иммуногистохимических показателей в процессе развития заданного патологического состояния эндометрия. В то же время все необходимые вмешательства в зоне имплантации фрагментов эндометрия, в том числе инъекции клеточного продукта или плацебо, доступны для проведения под визуальным контролем, что позволяет максимально стандартизировать протокол эксперимента [8]. В ходе экспериментов установлено, что через 10 дней после трансплантации эндометриальные стволовые клетки обнаруживаются во всех фрагментах имплантированного аутологичного эндометрия и величина относительной площади экспрессии маркеров стволовых клеток статистически сопоставима при локальном и системном введении. Следовательно, экспансия поврежденного эндометрия стволовыми клетками эндометриального происхождения от способа введения клеточного продукта не зависит. Полученные данные могут быть использованы при планировании дальнейших экспериментальных исследований с применением эндометриальных стволовых клеток для обоснования направленного выбора способа введения клеточного продукта. Необходимо, однако, подчеркнуть безусловное преимущество системного введения в связи с его минимальной инвазивностью, что в рамках эксперимента увеличивает выживаемость модельных животных и позволяет не ограничивать период наблюдения за изучаемыми процессами. В то же время, как показали полученные результаты, при выборе способа введения клеточного продукта следует учитывать, что ожидаемый репаративный эффект при локальном и системном введении может не совпадать, несмотря на равнозначную степень экспансии поврежденного эндометрия стволовыми клетками при различных способах введения. В данном исследовании было показано, что локальное введение суспензии стволовых клеток было ассоциировано с уменьшением макроскопических проявлений продуктивного воспаления в зоне имплантации, таких как развитие рубцово-спаечного процесса и связанное с ним изменение формы имплантов. При морфологическом и иммуногистохимическом исследованиях было выявлено, что введение клеточного продукта непосредственно в толщу импланта связано со значительным уменьшением проявлений фиброзно-склеротических процессов, усилением лейкоцитарной инфильтрации ткани и значительным увеличением содержания цитотоксических клеток CD16+ и клеток - регуляторов провоспалительных цитокинов CD56+. Следует учитывать, что NK-клетки, к которым относятся CD16+ и CD56+, являясь компонентом клеточного врожденного иммунитета, проявляют антигеннезависимую цитотоксичность в отношении инфицированных, стареющих и опухолевых клеток. Увеличение содержания NK-клеток в имплантах эндометрия после локального введения клеточного продукта свидетельствует об активации факторов местного иммунитета и реактивности поврежденной ткани. В процессе исследования было показано, что после введения плацебо в образцах имплантов эндометрия клетки CD90+ и CD105+ не определяются. В связи с этим можно, очевидно, исключить возможность непосредственного влияния операционной процедуры моделирования повреждения эндометрия на активацию резидентных мезенхимальных стволовых клеток эндометрия и на миграцию аутологичных стволовых клеток неэндометриального происхождения из кровотока. Полученные данные свидетельствуют в пользу пригодности предлагаемой экспериментальной модели повреждения эндометрия для изучения терапевтических возможностей стволовых клеток эндометриального происхождения. В качестве заключения можно сделать вывод о том, что способность эндометриальных стволовых клеток к направленной миграции и экспансии поврежденного эндометрия с репаративным эффектом определяет их потенциал для терапевтического использования и открывает широкие перспективы для их применения в клинической практике.

About the authors

Elena O Usoltceva

St. Petersburg State University

Email: usolceva.elena@inbox.ru
MD. St. Faculty of Medicine, Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine

Liailia Kh Dzhemlikhanova

St. Petersburg State University

Email: office@inform.pu.ru
MD, Associate Professor of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine Department. Faculty of Medicine

Dariko A Niauri

St. Petersburg State University

Email: office@inform.pu.ru
MD, Professor, Head of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine Department

Igor Yu Kogan

D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology RAMS

Email: iagmail@ott.ru
MD, academic secretary

Alexander M Gzgzyan

St. Petersburg State University

Email: iagmail@ott.ru
MD, Professor of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine Department, Head of Reproductive Technologies Department. Faculty of Medicine

References

Supplementary files