Bacterial communities forming the vaginal micro-ecosystem in norm and in bacterial vaginosis

Full Text

Введение

Бактериальный вагиноз (БВ) — нарушение микробиоты влагалища, выражающееся в замещении лактобацилл анаэробными бактериями и проявляющееся специфическими вагинальными выделениями. Термин «бактериальный вагиноз» начали применять относительно недавно, около 30 лет назад, хотя впервые это состояние было описано больше 100 лет назад. Долгое время считалось, что БВ — это относительно безобидный избыточный рост анаэробных микроорганизмов, который можно легко подавить метронидазолом или клиндамицином. Однако исследования последних лет показывают, что БВ — это заболевание, которое ассоциировано с рядом заболеваний урогенитального тракта женщины, а также может приводить к осложнениям беременности [1–3]. Заболевание часто принимает рецидивирующую форму. Так, у 60 % женщин наблюдаются рецидивы БВ в течение 12 месяцев после лечения [4]. В то же время у большого числа женщин (до 60 %) заболевание протекает бессимптомно [5].

Несмотря на существенный прогресс в области изучения этиологии, патогенеза и путей передачи этого заболевания, многие вопросы до сих пор остаются открытыми. Во многом это связано с тем, что БВ ассоциирован с огромным спектром бактерий. Эти бактерии принадлежат четырем бактериальным типам, а именно Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria [6], и существенно различаются по биохимическим, морфологическим, тинкториальным характеристикам, а также по чувствительности к антибактериальным препаратам. Это разнообразие в значительной степени усложняет не только выявление патогенетических механизмов заболевания, но и поиски эффективных способов диагностики и лечения БВ. Одним из методологических подходов к поиску общих закономерностей при изучении какого-либо аспекта полимикробного заболевания, каким является БВ, представляется группирование всех бактериальных сообществ влагалища в кластеры — типы микробиоце ноза, объединяющие схожие по определенным признакам бактериальные сообщества, и изучение их клинико-диагностической значи мости.

Целью данного исследования было определение и сравнительный анализ кластеров бактериальных сообществ, формирующих микроэкосистему влагалища в норме и при БВ.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие женщины репродуктивного возраста, обратившиеся с жалобами на дискомфорт и/или выделения из половых путей в поликлиническое отделение ФГБНУ «Научно-исследовательский инсти тут акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» и СПб ГБУЗ «Городская поликлиника № 34». Критериями исключения являлись беременность и применение антибактериальных препаратов в течение последних четырех недель.

Клиническим материалом для исследования служило отделяемое влагалища, которое получали с помощью двух дакроновых тампонов. Содержимое одного тампона наносили на предметное стекло для микроскопического исследования. Содержимое второго тампона использовали для молекулярно-биологического анализа микрофлоры влагалища.

Диагностику БВ проводили путем исследования отделяемого влагалища с применением метода Нуджента [7]. В окрашенных по Граму препаратах определяли следующие бактериальные морфотипы: крупные грамположительные палочки (морфотип лактобациллы), небольшие грамвариабельные кокки и коккобациллы (морфотип Gardnerella и Bacteroides) и грамвариабельные изогнутые палочки (морфотип Mobiluncus). В зависимости от суммы баллов образцы расценивали как нормальную микрофлору (число баллов от 0 до 3), промежуточную микрофлору (число баллов от 4 до 6) и БВ (число баллов от 7 до 10).

Для включения в кластерный анализ оценивали клинические критерии Амселя [8]: рН влагалища (представляли в количественной шкале), наличие специфических выделений из влагалища, положительный аминный тест, наличие ключевых клеток при микроскопическом исследовании отделяемого влагалища (в окрашенном по Граму препарате).

Исследование микрофлоры влагалища проводили с использованием теста Фемофлор-16 (ДНК-Технология, Москва). Тест основан на методе количественной ПЦР в реальном времени и предназначен для выявления дисбиотических состояний влагалища. С помощью теста определяют тотальную концентрацию бактериальной ДНК — общую бактериальную массу (ОБМ) — и концентрацию (абсолютную и относительную) следующих видов/родов микроорганизмов: Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Streptococcus, Staphylococcus, Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas, Eubacterium, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium, Corynebacterium/Mobiluncus, Peptostreptococcus, Atopobium vaginae. Кроме того, оценивается абсолютная концентрация Mycoplasma hominis, Ureaplasma и Candida. ПЦР-анализ осуществляли согласно инструкции производителя. Количественное содержание анализируемых микроорганизмов представляли в виде соотношения концентрации их ДНК к ОБМ в долях единицы.

Статистический анализ результатов осуществляли с использованием пакетов для статистического анализа GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) и SPSS (IBM). Для группирования бактериальных сообществ в кластеры использовали метод неиерархического двухэтапного кластерного анализа. Неиерархические методы, в отличие от иерархических, характеризуются более высокой устойчивостью к шумам и выбросам, неоднородностью переменных, присутствием незначимых переменных в наборе, участвующих в кластеризации, и не имеют ограничений в объеме данных. Принцип метода двухэтапного кластерного анализа заключается в том, что на первом этапе работы объекты предварительно кластеризуются в большое количество субкластеров. На втором этапе полученные субкластеры группируются в необходимое количество кластеров. Данный метод кластеризации позволяет использовать как количественные, так и категориальные переменные.

Количественное содержание бактерий/групп бактерий в составе вагинальной микрофлоры всех пациенток представляли в виде тепловой карты. Для характеристики совокупности объектов в пределах каждого кластера использовали медиану, нижний и верхний квартили, минимальное и максимальное значения, которые представляли графически. Сравнительный анализ кластеров по количественным и категориальным признакам осуществляли путем их попарного сравнения с применением теста Манна – Уитни и точного критерия Фишера соответственно.

Результаты

Всего в исследование было включено 280 женщин в возрасте от 20 до 45 лет (29 ± 5,7 года). С использованием метода Нуджента 172 образца были причислены к категории нормальной микрофлоры, 27 — промежуточной микрофлоры, 81 — БВ.

Образцы отделяемого влагалища от всех женщин были протестированы при помощи теста Фемофлор-16. Результаты 10 проб были признаны невалидными ввиду низкого значения контроля взятия материала и исключены из анализа. Таким образом, в кластерный анализ было включено 270 проб.

Особенностью неиерархической кластеризации является то, что она требует предположения о числе кластеров. При выборе числа кластеров мы руководствовались следующими соображениями. Известно, что основная микробиологическая характеристика БВ — низкое содержание лактобацилл. Однако это свойство присуще не только БВ, но и так называемому аэробному (неспецифическому) вагиниту, который характеризуется замещением лактобацилл бактериями кишечной группы. Далее, микрофлора при БВ включает широкий спектр анаэробных бактерий, среди которых можно выделить факультативно-анаэробные (Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae) и облигатно-анаэробные (бактероиды, фузобактерии, клостридии) бактерии. Таким образом, мы предположили, что все изучаемые случаи могут быть разделены на четыре кластера, или типа микробиоценоза, в зависимости от доминирования тех или иных групп бактерий: с преобладанием лактобацилл, аэробных бактерий (семейства Enterobacteriaceae, стафилококков и стрептококков), факультативно-анаэробных бактерий и облигатно-анаэробных бактерий.

Кластеризацию проводили по микробиологическим (количественное содержание бактерий в образцах) и клиническим (значение рН влагалища, наличие или отсутствие выделений, положительный или отрицательный аминный тест, наличие или отсутствие ключевых клеток) признакам. Были включены следующие бактерии/группы бактерий: Lactobacillus/ОБМ, Enterobacteriaceae/ОБМ, Streptococcus/ОБМ, Staphylococcus/ОБМ, Gardnerella vaginalis/Prevotellabivia/Porphyromonas/ОБМ, Eubacterium/ОБМ, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium/ОБМ, Megasphaera/Veillonella/Dialister/ОБМ, Lachnobacterium/Clostridium/ОБМ, Corynebacterium/Mobiluncus/ОБМ, Peptostreptococcus/ОБМ, Atopobium vaginae/ОБМ, Mycoplasma hominis/ОБМ (в тесте Фемофлор-16 количество ДНК M. hominis выражается в абсолютных единицах концентрации, однако для кластерного анализа количественное содержание этих бактерий было представлено в относительном выражении). Микроорганизмы родов Ureaplasma и Candida в кластерный анализ не включили, так как в нашем предыдущем исследовании, посвященном разработке критериев диагностики БВ с применением теста Фемофлор-16 и выполненном на этой же выборке пациенток [9], мы не выявили их корреляции с количественными показателями БВ (числом баллов по шкале Нуджента, числом положительных критериев Амселя, значением рН влагалища). Необходимо отметить, что группа бактерий Corynebacterium/Mobiluncus также не показала корреляции с БВ в вышеупомянутой работе, что может быть связано с отсутствием связи между БВ и бактериями рода Corynebacterium. Несмотря на это, данный параметр также был включен в кластерный анализ ввиду того, что Mobiluncus spp. традиционно рассматривается как важный компонент БВ.

В результате анализа все случаи были отнесены к одному из четырех кластеров (рис. 1). Кластер 1, самый многочисленный (n = 171), включал случаи, когда вагинальная микрофлора состояла преимущественно из лакто бацилл. В кластер 2, самый малочисленный (n = 11), вошли случаи доминирования аэробной микрофлоры: Enterobacteriaceae, Streptococcus и Staphylococcus. К кластерам 3 (n = 57) и 4 (n = 31) были отнесены случаи доминирования факультативно-анаэробной (Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae) и облигатно-анаэробной (Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium) микрофлоры соответственно. Полученная модель кластеризации была оценена как «хорошее разделение кластеров».

 

Рис. 1. Бактериальные сообщества влагалища, сгруппированные в четыре кластера. Каждый столбец представляет собой соотношение концентрации ДНК определенных бактерий/групп бактерий и общей бактериальной массы (ОБМ). Каждый ряд (тонкая горизонтальная линия) представляет собой состав микрофлоры влагалища каждой из 270 женщин

 

Распределение частоты представителей разных кластеров в зависимости от числа баллов по шкале Нуджента изображено на рис. 2. Подавляющее большинство представителей кластера 1 (160 из 171, 94 %) вошли в категорию нормальной микрофлоры по шкале Нуджента. Большая часть случаев из кластера 2 (7 из 11, 64 %) попала в категорию промежуточной микрофлоры. Представители кластеров 3 и 4 распределились, главным образом, в категории БВ по шкале Нуджента, при этом большинство представителей кластера 3 (35 из 57, 61 %) вошли в подкатегории с числом баллов 7 и 8, тогда как большинство представителей кластера 4 (24 из 31, 77 %) — в подкатегории с числом баллов 9 и 10.

Обращает на себя внимание гетерогенность промежуточной микрофлоры по шкале Нуджента. Большая часть подкатегории с числом баллов 4 состояла из случаев нормальной микрофлоры. Подкатегория с числом баллов 5 включала практически в равных долях представителей кластеров нормальной, аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры. Подкатегория с числом баллов 6 делилась поровну на представителей аэробного и факультативно-анаэробного кластеров (рис. 2).

 

Рис. 2. Распределение бактериальных кластеров влагалища в зависимости от числа баллов по Нудженту

 

Кластерный анализ относится к так называемым разведочным типам анализа, и результаты кластеризации не имеют достаточного статистического обоснования. С целью статистической интерпретации полученных результатов мы провели попарное сравнение всех кластеров по всем признакам, включенным в анализ. Результаты сравнительного анализа кластеров по количественным показателям (соотношение ДНК бактерий/групп бактерий к ОБМ и значение рН влагалища) представлены на серии графиков (рис. 3). Приведены медиана, нижний и верхний квартили, минимальное и максимальное значения показателей, а также значения р, полученные при сравнении показателей с применением теста Манна –Уитни.

 

Рис. 3. Сравнительный анализ бактериальных кластеров влагалища по содержанию Lactobacillus (1), Enterobacteriaceae (2), Streptococcus (3), Staphylococcus (4), Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas (5), Eubacterium (6)

 

Рис. 3. Сравнительный анализ бактериальных кластеров влагалища по содержанию Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium (7), Megasphaera/Veillonella/Dialister (8), Lachnobacterium/Clostridium (9), Corynebacterium/Mobiluncus (10), Peptostreptococcus (11), Atopobium vaginae (12)

 

Рис. 3. Сравнительный анализ бактериальных кластеров влагалища по содержанию Mycoplasma hominis (13), значению рН влагалища (14)

 

Содержание лактобацилл в кластере 1 значительно превышало содержание лактобацилл в остальных кластерах (рис. 3.1). Кластеры 2, 3 и 4 не различались между собой по данному показателю. Кластер 2, как и ожидалось, значительно превосходил кластеры 1, 3 и 4 по содержанию энтеробактерий, стрептококков и стафилококков (рис. 3.2–3.4). Кластеры 1 и 2 значительно отличались от кластеров 3 и 4 по содержанию Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas, при этом содержание данной группы бактерий в кластерах 3 и 4 было примерно одинаковым (рис. 3.5). Похожая картина наблюдалась также для показателя Atopobium vaginae/ОБМ (рис. 3.12). Содержание облигатно-анаэробных бактерий (группы Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonel la/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium) было значительно выше в кластере 4, чем в остальных кластерах (рис. 3.7–3.9). Все кластеры значительно различались между собой по значению рН влагалища, при этом самые высокие показатели наблюдались для кластера 4 (рис. 3.14).

Кроме рН влагалища, мы исследовали различия между кластерами по их связи с другими клиническими признаками, такими как наличие выделений, результаты аминного теста и наличие ключевых клеток (рис. 4). Женщины с доминированием лактобацилл значительно реже имели вагинальные выделения (13 %), чем женщины с доминированием аэробной (91 %), факультативно-анаэробной (82 %) и облигатно-анаэробной (97 %) микрофлоры. Все женщины с доминированием лактобацилл и аэробной микрофлоры предсказуемо имели отрицательный результат аминного теста, и ни у одной из них не выявлялись ключевые клетки. Из двух кластеров, ассоциированных с БВ, кластер с преобладанием облигатных анаэробов был связан с более высокой частотой выделений, положительного аминного теста и выявления ключевых клеток, однако статистической значимости данные различия не достигли.

 

Рис. 4. Сравнительный анализ бактериальных кластеров влагалища по наличию выделений, результатам аминного теста и наличию ключевых клеток. Нв — критерий не вычислялся, так как значения переменной в обеих группах равны нулю

 

Обсуждение результатов

Впервые кластеризация микробных сообществ влагалища, охарактеризованных с использованием технологий глубокого секвенирования ДНК, была проведена в 2011 г. J. Ravel et al. [10]. Изучая микробиоту влагалища у здоровых женщин репродуктивного возраста (n = 396), исследователи выделили пять основных групп. Группы отличались друг от друга по значению рН отделяемого влагалища. Четыре группы характеризовались доминированием одного из четырех видов лактобацилл — Lactobacillus crispatus (рН 4,0 ± 0,3), L. iners(рН 4,4 ± 0,6), L. gasseri (рН 5,0 ± 0,7) или L. jensenii (рН 4,7 ± 0,4). Микрофлора пятой группы была представлена факультативными или облигатными анаэробами с рН влагалища 5,3 ± 0,6. Такой «нелактобациллярный» тип микробиоценоза выявлялся почти у трети всех женщин, при этом его доля составляла около 10 % среди женщин европейской, 20 % — азиатской и 40 % — афроамериканской и латиноамериканской этнических/расовых групп. У женщин с «нелактобациллярным» типом микробиоценоза были обнаружены представители бактериальных родов Gardnerella, Atopobium, Prevotella, Megasphaera, Dialister, Peptoniphilus, Sneathia, Eggerthella, Aerococcus, Finegoldia и Mobiluncus, при этом доминирования какого-либо определенного бактериального таксона в этом типе микробиоценоза авторы не наблюдали. Важно подчеркнуть, что обследуемую популяцию составляли здоровые женщины, то есть женщины без симптомов БВ (выделений из влагалища и/или специфического запаха). Большинство женщин с «нелактобациллярным» типом микробиоценоза предсказуемо имели число баллов по шкале Нуджента ≥ 7 и высокие значения рН отделяемого влагалища (> 4,5), тем не менее они не имели вульво-вагинальных симптомов. Позднее P. Gajer et al. (2012) модифицировали классификацию J. Ravel et al. [9], разделив «нелактобациллярную» группу бактериальных сообществ на две подгруппы [11]. В первой подгруппе, наряду с умеренным количеством лактобацилл, выявлялись представители видов Anaerococcus, Corynebacterium, Finegoldia или Streptococcus. Вторая подгруппа характеризовалась присутствием большого количества представителей родов Atopobium, Prevotella, Parvimonas, Sneathia, Gardnerella, Mobiluncus Peptoniphilus и некоторых других. Авторы исследовали динамику изменения различных типов вагинальной микрофлоры в течение 16 недель и показали, что наиболее стабильными были типы микробиоценоза с доминированием L. crispatus и L. gasseri. Среди остальных типов микробиоценоза единообразия не наблюдалось: в одних случаях видовой и количественный состав претерпевал существенные изменения, в других — оставался стабильным в течение всего периода наблюдения. В нескольких последующих работах было проведено похожее разделение бактериальных сообществ влагалища на кластеры с тем различием, что в некоторых работах не выявляли групп с доминированием L. gasseri или L. jensenii, так как это группы малочисленные и при выборке небольшого размера могут не выявляться [12–14].

S. Srinivasan et al. (2012) показали, что среди женщин без БВ во влагалище доминируют лактобациллы (L. crispatus или L. iners), тогда как при БВ вагинальная микрофлора исключительно разнообразна, и только четыре бактериальных таксона, а именно BVAB1 (bacterial vaginosis associated bacteria — бактерии, ассоциированные с бактериальным вагинозом), Prevotella spp., Sneathia sanguinegens, Leptotrichia amnionii, имели тенденцию доминировать в качестве единственного таксона [15]. В недавней работе J.A. Dols et al. (2016) было выявлено два кластера у здоровых женщин: один с доминированием L. iners, другой — L. crispatus [16]. У женщин с БВ бактериальные сообщества были сгруппированы в три кластера. Один из них характеризовался доминированием G. vaginalis и L. amnionii, второй — доминированием представителей семейства Lachnospiraceae. Третий кластер отличался высоким уровнем видового разнообразия, тем не менее доминирующими видами были S. sanguinegens и G. vaginalis. Авторы не выявили ассоциации индивидуальных кластеров с возрастом, наличием урогенитальных инфекций и воспалительными заболеваниями органов малого таза.

Основной целью нашей работы было изучение бактериальных сообществ нарушенной микрофлоры влагалища, в связи с чем видоспецифический анализ лактобацилл не проводился. В результате кластеризации мы разделили бактериальные сообщества влагалища на группы, характеризующиеся доминированием лактобацилл (кластер 1), аэробных бактерий — Enterobacteriaceae, Streptococcus и Staphylococcus (кластер 2), факультативно-анаэробных бактерий — G. vaginalis и A. vaginae (кластер 3) и облигатно-анаэробных бактерий — Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonel la/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium (кластер 4). Необходимо отметить, что термины «аэробные бактерии» или «анаэробные бактерии» были использованы нами скорее с номинальной целью (обозначить кластер), чем с целью акцентировать внимание на типе дыхания бактерий и их отношении к свободному кислороду. Известно, что большинство бактерий кишечной группы (как и большинство лактобацилл), строго говоря, являются факультативными анаэробами, тем не менее их традиционно называют аэробными бактериями.

При распределении кластеров по шкале Нуджента практически все представители кластера 1 предсказуемо вошли в категорию нормальной микрофлоры. Большинство представителей кластера 2 попали в категорию промежуточной микрофлоры. Это согласуется с данными G. Donders (2002), свидетельствующими о том, что категория промежуточной микрофлоры по Нудженту включает в себя микрофлору, свойственную аэробному вагиниту [17]. Представители кластеров 3 и 4 вошли преимущественно в категорию БВ по шкале Нуджента. Интересно отметить, что большинство представителей кластера 3 имели число баллов 7 и 8, тогда как большинство представителей кластера 4 — 9 и 10. Объяснить это можно тем, что представители кластера 4 содержали как гарднереллы, так и другие БВ-ассоциированные бактерии, так как получить максимальное число баллов по Нудженту (9 или 10) можно только в том случае, если в образце наряду с морфотипом небольших грамвариабельных кокков и коккобацилл присутствует морфотип грамвариабельных изогнутых палочек и при этом отсутствует морфотип лактобацилл.

В нашем исследовании оба кластера БВ-ассоциированных бактериальных сообществ (3 и 4) содержали G. vaginalis и A. vaginae, при этом их количество в обоих кластерах было примерно одинаковым. Однако если в кластере 3 эти бактерии доминировали, то в кластере 4 преобладали Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium. Результаты нашего исследования свидетельствуют в пользу гипотезы, рассматривающей БВ как полимикробную биопленочную инфекцию, в которой G. vaginalis является инициатором патологического процесса, ведущего к развитию БВ [18–21]. Биопленка — это микробное сообщество, в котором клетки прикреплены к какой-либо поверхности и/или друг к другу и заключены в межбактериальный матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. Полагают, что G. vaginalis первыми прикрепляются к вагинальному эпителию, выступая в роли «первичного колонизатора», и затем служат своего рода каркасом для прикрепления других бактерий [18, 19]. J.L. Patterson et al. (2010) показали, что G. vaginalis по вирулентности, а именно адгезивным свойствам, цитотоксичности и способности формировать биопленки, превосходит другие ассоциированные с БВ бактерии [19]. Позднее P. Alves et al. (2014) выделили около 30 видов бактерий, ассоциированных с БВ, и в модельных экспериментах продемонстрировали, что большинство бактерий имеет тенденцию расти как биопленки, однако не обладает такой же способностью, как G. vaginalis, образовывать первичные биопленки на эпителии влагалища [22]. J. Schellenberg et al. (2011) по результатам своей работы сформулировали концепцию, заключающуюся в том, что доминирование G. vaginalis в микробиоте влагалища — это переходное состояние между физиологическим, представленным лактобациллами, микробиоценозом и БВ, характеризуемым кодоминированием гарднерелл, бактероидов и клостридий [23].

Если роль G. vaginalis в развитии БВ изучается много лет, то ассоциация A. vaginae с БВ была описана относительно недавно [24]. A. vaginae, наряду с G. vaginalis, обнаруживаются у большинства женщин с БВ и предположительно участвуют в формировании биопленок. Так, в недавнем исследовании L. Hardy et al. (2015) биопленки были обнаружены у половины женщин, включенных в исследование. G. vaginalis присутствовали в 82 % всех биопленок, A. vaginae — в 54 %, при этом практически во всех случаях выявления A. vaginae обнаруживали также G. vaginalis. Авторы предположили, что симбиоз этих двух микроорганизмов играет важную роль в формировании биопленки и развитии БВ [25].

Отдельного внимания заслуживают результаты тестирования вагинального отделяемого на Eubacterium — грамположительные бактерии семейства Eubacteriaceae порядка Clostridiales. Мы выявили этот микроорганизм практически у всех женщин с БВ, причем его содержание в некоторых образцах было довольно высоким (до 60 % общей массы бактерий). В нашей предыдущей работе по разработке критериев диагностики БВ с использованием теста Фемофлор-16 мы показали, что эти бактерии имеют значимую ассоциацию с БВ [9]. Наши данные не соответствуют результатам работ, проведенных с применением технологий глубокого секвенирования ДНК, согласно которым бактерии рода Eubacterium выявляются в незначительном числе образцов и их содержание относительно невелико [10, 11, 15]. Объяснением этому может служить то, что род Eubacterium отличается исключительной гетерогенностью, включая целый ряд видов с различающимися фенотипами. Многие виды этого рода по мере их детальной характеристики относят к другим родам (например, родственному роду Clostridium) и даже перемещают в другие более крупные таксоны, такие как тип Actinobacteria [26]. Можно предположить, что род Eubacterium включает виды, существенно различающиеся по ассоциации с БВ, и тест Фемофлор-16 выявляет вид/виды, связанные с БВ в высокой степени.

Содержание остальных бактерий/групп бактерий, а именно Corynebacterium/Mobiluncus, Peptostreptococcus, M. hominis, в исследованных образцах было относительно невысоким, в связи с чем их место в каком-либо типе микробиоценоза сложно определить. Что касается группы Corynebacterium/Mobiluncus, трудности интерпретации связаны еще и с тем, что, хотя оба рода бактерий принадлежат порядку Actinomycetales (тип Actinobacteria), Mobiluncus spp. ассоциирован с БВ, а Corynebacterium spp. нет.

Ограничением данного исследования является то, что G. vaginalis — факультативный анаэроб, представитель порядка Bifidobacteriales (тип Actinobacteria) — в тесте Фемофлор-16 выявляется в совокупности с Prevotella bivia и Porphyromonas spp. — облигатными анаэробными бактериями порядка Bacteroidales (тип Bacteroidetes). Известно, что бактероиды (в первую очередь, превотеллы) имеют высокие показатели распространенности и количественного содержания при БВ. Однако с применением технологий глубокого секвенирования ДНК было показано, что P. bivia не единственный распространенный при БВ вид превотелл, часто также выявляются P. timonensis, P. amnii, P. melaninogenica, P. disiens [15, 23]. Так, в работе J. Shellenberg et al. (2011) самым распространенным видом превотелл были P. timonensis, встречавшиеся практически у всех женщин и отвечавшие за 8 % общего содержания бактерий во всех исследованных образцах [23]. В исследовании S. Srinivasan et al. (2012) P. timonensis, P. bivia, P. amnii выявлялись у 76, 64, 50 % женщин с БВ соответственно, а совокупный вклад этих трех видов в общее содержание бактерий у женщин с БВ составлял 12 %, по 4 % каждого вида [15]. Для сравнения: G. vaginalis встречались у 98 % женщин с БВ с показателем содержания 14 %. Что касается другого представителя Bacteroidales — Porphyromonas spp., наиболее часто при БВ встречаются виды P. asaccharolytica и P. uenonis, и их распространенность и количественное содержание существенно ниже соответствующих показателей для превотелл [15, 23]. Эти данные, в совокупности с хорошо задокументированным фактом практически повсеместного присутствия G. vaginalis во влагалище у женщин с БВ, дают основания полагать, что в большинстве случаев при выявлении группы бактерий Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas доминирующими бактериями были G. vaginalis. С другой стороны, из-за того, что представители порядка Bacteroidales в тесте Фемофлор-16 обнаруживаются вместе с гарднереллами, нам не удалось определить, к какому кластеру принадлежал этот важный бактериальный таксон. Логично предположить, что бактероиды относятся к кластеру облигатных анаэробов.

В нашем исследовании все кластеры значительно различались по значению рН влагалища. Известно, что низкое значение рН при физиологическом состоянии микробиоценоза влагалища обеспечивается за счет продукции молочной кислоты и перекиси водорода лактобациллами. В нашем исследовании низкое содержание лактобацилл в «нелактобациллярных» бактериальных сообществах (кластеры 2, 3 и 4) было связано с намного более высокими значениями рН. Интересно отметить, что, хотя кластер аэробной микрофлоры, как и кластеры анаэробной микрофлоры, характеризуется низким содержанием лактобацилл, он значительно уступает им по этому показателю. Более того, для кластера с преобладанием облигатных анаэробов характерно значительно более высокое значение рН, чем для кластера факультативных анаэробов. Это говорит о том, что высокое значение рН при БВ обеспечивается не только за счет снижения содержания лактобацилл, но и за счет особенностей метаболизма доминирующих бактерий. Так, продукция анаэробными бактериями полиаминов, таких как путресцин и кадаверин, ассоциирована не только с неприятным запахом выделений при БВ, но и с повышенными значениями рН влагалища, так как данные соединения являются сильными основаниями [27].

При изучении других характерных для БВ клинических признаков — наличие выделений, положительный аминный тест, наличие ключевых клеток — мы не выявили статистически значимых различий между двумя ассоциированными с БВ кластерами. Предметом следующих исследований может стать вопрос о связи определенных бактериальных кластеров с клинически выраженным БВ, а также с рецидивирующим БВ.

Таким образом, бактериальные сообщества влагалища группируются в четыре основных кластера, или типа, вагинальной микрофлоры. Кластер нормальной микрофлоры состоит преимущественно из лактобацилл. Кластер аэробной микрофлоры характеризуется преобладанием энтеробактерий, стрептококков или стафилококков. Кластеры с доминированием факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры ассоциированы с БВ. Описанные кластеры принадлежат разным категориям по шкале Нуджента и различаются по значению рН влагалища.

About the authors

Veronika V. Nazarova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: iagmail@ott.ru

bacteriologist, Laboratory of Microbiology

Russian Federation, St. Petersburg

Elena V. Shipitsyna

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: iagmail@ott.ru

PhD, Leading Researcher, Laboratory of Microbiology

St. Petersburg

Kira V. Shalepo

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: iagmail@ott.ru

PhD, Senior Researcher of Laboratory of Microbiology

Russian Federation, St. Petersburg

Alevtina M. Savicheva

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: savitcheva@mail.ru

PhD, MD, Professor, Head of Laboratory of Microbiology

Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files