Prognostic significance of mmp-1, mmp-3, and mthfr genetic polymorphism for evaluation of uterine leiomyoma and adenomyosis progression

Full Text

Актуальность проблемы

Лейомиома матки (ЛМ), являясь доброкачественной опухолью миометрия, развивается в результате пролиферации мышечных клеток и соединительнотканных элементов [3]. При сравнении ультраструктуры коллагеновых фибрилл в ткани лейомиомы и нормальном миометрии установлено, что лейомиома содержит коллагеновые фибриллы нетипичной структуры и ориентации по сравнению с нормальным миометрием [14]. Это обстоятельство может свидетельствовать о ведущей роли матриксных металлопротеиназ (коллагеназ и желатиназ) в патогенезе лейомиомы. Причины нарушений соединительнотканного компонента могут быть обусловлены, в частности, гормональным дисбалансом у женщин [3].

Молекулярно-генетические механизмы влияния измененного гормонального фона на активность соответствующих энзимных систем в ткани матки пока мало изучены. Так, несомненно участие матриксных металлопротеиназ (ММР) в процессах ремоделинга коллагена в опухолевых тканях [12]. Известно более 20 видов ММР, которые осуществляют различные этапы деградации коллагена, эластина и других белков экстрацеллюлярного матрикса. Среди них особую роль играет матриксная металлопротеиназа-1 (ММР-1), которая осуществляет первичную деградацию молекул коллагена, после чего происходит их дальнейший распад под действием остальных ММР [12]. В последующей деградации продуктов коллагенолиза участвуют другие ММР, в частности стромелизин-1 (ММР-3).

Имеется небольшое число молекулярно-биологических исследований, которые показывают, что в миоматозных тканях происходит усиление экспрессии специфических генов цитокинов и ростовых факторов [7]. Выявлено достоверное повышение экспрессии ММР-1 (специфические мРНК и белки) при лейомиоме [6]. Возникает вопрос о причинах усиления транскрипции генов ММР у отдельных пациентов. Одним из этих факторов может быть полиморфизм регуляторных сегментов, в частности - промоторных участков генов. При этом не изменяется первичная структура и активность белкового продукта, однако существенно изменяется продукция мРНК и специфического белка. В связи с этим у носителей «гиперактивных» промоторных вариантов может усиливаться склонность к различным заболеваниям [13]. Диагностика и профилактика соответствующих состояний представляет собой одно из важных направлений новой отрасли науки — предиктивной медицины, изучающей генные механизмы предрасположенности к тем или иным клиническим состояниям [1].

Для промоторного участка ММР-1 известно 2 генных варианта - наличие 1G или 2G в позиции - 1607. При наличии варианта 2G в промоторе гена ММР-1 появляется дополнительный сайт

связывания фактора транскрипции Ets, тем самым определяя высокие уровни синтеза специфической мРНК и продукции молекул проэнзима ММР-1. Показано, что гомозиготное состояние гена ММР- 1 2G/2G связано с повышенным риском развития и диссеминацией злокачественных новообразований (например, меланомы и рака яичника) [21]. Наши исследования при трансплантации костного мозга показали взаимосвязь между наличием аллеля 2G у больных и повышенным риском развития реакции «трансплантат против хозяина» [4]. ММР-3 (стромелизин-1) осуществляет последующее разрушение коллагена. Для этого гена показан генный полиморфизм в позиции промотора-600 (5А/6А). Аллель 5А характеризуется более высоким уровнем транскрипции, нежели аллель 6А. Преобладание аллеля 5А гена ММР-3 обнаружено для женщин с метастазирующим раком молочной железы [8].

Кроме того, в ряде работ показана важность полиморфизма MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы), катализирующего синтез 5-метил- тетрагидрофолата, который используется в процессах метилирования. Вариант MTHFR С677Т сопровождается существенно сниженной активностью, что повышает гемокоагуляцию и онкологические риски у женщин - носительниц этого гена [11].

Целью настоящей работы явилась оценка возможной роли упомянутых клинически актуальных генных вариантов как факторов риска в развитии миомы матки и аденомиоза.

Материалы и методы

При выполнении настоящей работы проведено клиническое обследование 170 пациенток, имевших миому матки, в возрасте от 26 до 71 года (средний возраст 46,6 года), с морфологической верификацией диагноза у оперированных больных. У 122 (71,7 %) женщин имелась симптомная миома, проявлявшаяся гиперполименоррей, быстрым темпом роста опухоли, нарушением функции смежных органов, что потребовало хирургического лечения. У 48 (28,3 %) - миома матки была без клинических проявлений.

Комплекс обследования, помимо анамнестического и общеклинического, включал эхографическое исследование органов малого таза, морфологическое исследование эндометрия. Ультразвуковое исследование проводили в первую фазу при сохраненном менструальном цикле трансабдоминальным доступом конвексным датчиком с частотой 3,5 МГц и трансвагинальным доступом с частотой 8 МГц. При исследовании с использованием серой шкалы оценивали размеры матки, величину, число и локализацию узлов, а также состояние яичников.

Вычисление объема матки и миоматозных узлов осуществляли по предложенной Healey (1989) формуле [20], основанной на данных ультразвукового сканирования с определением продольного (А), поперечного (В) и переднезаднего (С) размеров. Темп роста узлов миомы или ее регресс оценивали в динамике по данным эхографии, проводившейся каждые шесть месяцев.

С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза миомы матки проводилось генотипирование промоторных аллелей генов ММР-1 и ММР-3, а также гена MTHFR (С677Т).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров после лизиса, иммобилизации и очистки ДНК на сорбенте, с применением набора «ДНК-Сорб» (Литех, Москва). Генотипы ММР- 1 (1G/2G), ММР-3 (5А/6А) и MTHFR (С677Т) определяли с помощью аллель-специфической ПЦР. Подбор соответствующих праймеров осуществляли с помощью программы Primer Express (Applied Biosystems, Германия), причем искомый точечный полиморфизм располагали на 3’-конце передних праймеров.

Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5х ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва); смесь дезоксинуклеотидов (MBI Fermentas, Каунас, Литва), праймеры (от 0.05 до 0.3 μМ) производства «Синтол» (Москва), ДНК- Taq полимеразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ME в пробе) и геномную ДНК (2,5 мкл на реакцию), в общем объеме 20 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе I. Cycler (Bio-Rad, США). Режимы ПЦР были следующими: 94°С, 5 мин; 40 циклов ПЦР: денатурация: 94°С, 30 с; отжиг в течение 30 с: 67°С (MTHFR), 55°С (ММР-1), 54°С (ММР- 3/5А), 49°С, (ММР-3/6А); элонгация: 72°С, 30 с (40 циклов); 72°С, 7 мин. Продукты ПЦР оценивали после электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле при окраске этидий-бромидом. Визуализацию специфических продуктов осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора. Изображения фиксировали с помощью цифровой фотокамеры Canon PowerShot А70. Статистический анализ проводился путем непараметрического анализа (тест хи-квадрат), с помощью пакета программ Winstat.

Результаты исследования

По данным анамнеза, длительность существования миомы до 5 лет отмечена у 100 женщин (58,9 %); от 6 до 10 лет - у 43 (25,2 %), более 10 лет - у 27 (15,9 %) пациенток.

Подбрюшинная локализация миоматозных узлов обнаружена у 12 (7,9 %) больных, межмышечная – у 43 (28,3 %) и подслизистая - у 9 (5,9 %) женщин. Сочетание подбрюшинной и межмышечной локализации миоматозных узлов выявлено у 88 (57,9 %) пациенток. Единичные миоматозные узлы отмечены у 42 (24,7 %) больных; по 2 миоматозных узла выявлено у 44 (25,9 %), от 3 до 5 узлов - также у 44 пациенток (25,9 %) и более 5 узлов - у 40 (23,5 %). Быстрый рост опухоли отмечен у 41 (29,3 %) пациентки, медленный - у 69 (49,3 %) и регресс миоматозных узлов - у 30 (21,4 %).

При морфологическом исследовании эндометрия у 72 (42,3 %) женщин выявлено его соответствие фазе менструального цикла, у 33 (19,5 %) - обнаружена железистая или железисто-кистозная гиперплазия, у 46 (27,2 %) - полип эндометрия и у 18 (10,6 %) - гипопластический или атрофичный эндометрий.

Репродуктивная функция обследованных женщин характеризовалась большим количеством беременностей, значительная часть которых закончилась искусственным и/или самопроизвольным прерыванием.

Из гинекологических заболеваний наиболее часто миоме матки сопутствовал аденомиоз, выявленный у 93 больных (54,7 %). Доброкачественные опухоли яичников (кисты) обнаружены у 23 (13,8%) обследованных больных.

При изучении состояния молочных желез патологические изменения выявлены у 144 (84,7 %) больных миомой матки. В 66,1 % наблюдений обнаружена диффузная кистозно-фиброзная мастопатия, узловая форма фиброзно-кистозной мастопатии отмечена у 2,4 % больных, аденоз - в 12 % случаев, фиброаденома - у 3,2 % пациенток.

Преморбидным фоном лейомиомы матки являлись заболевания сердечно-сосудистой системы (артериальная гипертензия, миокардиодистрофия, приобретенные и врожденные пороки сердца), отмеченные у 107 пациенток (62,9 %).

Ожирение и сахарный диабет выявлены у 60 женщин (35,2 %), заболевания желудочно-кишечного тракта и гепато-билиарной системы (хронический холецистит, дискинезии желчевыводящих путей, желчекаменная болезнь,

звенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, хронический гастрит и гастродуоденит) - у 67 (39,4 %), варикозное расширение вен нижних конечностей у 38 (22,3 %) пациенток.

 

Таблица 1. Распределение генных вариантов ММР-1, ММР-З и MTHFR среди больных лейомиомой в Санкт-Петербурге

Исследованные гены	Доля генотипов в выборке
ММР-1-1607 1G/2G	1G/1G	1G/2G	2G/2G
	26,5 % (45/170)	51,2 % (87/170)	22,4 % (38/170)
ММР-З-500 5А/6А	5А/5А	5А/6А	6А/6А
	20,5 % (35/170)	54,1 % (92/170)	25,2 % (43/170)
MTHFR С677Т	СС	СТ	ТТ
	37,1 % (63/168)	41,7 % (71/168)	20,2 % (34/168)

 

Анализ распределения изученных генных вариантов показал высокую частоту встречаемости альтернативных аллелей генов ММР-1, ММР-З, и MTHFR в обследованной группе больных (табл. 1). Частоты аллелей этих генов в данной группе достоверно не отличались от ранее опубликованных выборок для населения Европы. При этом распределение промоторных аллелей генов ММР-1 и ММР-З практически соответствовало классическому «менделевскому» варианту (50 % гетерозигот и по 25 % гомозигот обоих видов). При анализе промоторного полиморфизма гена MTHFR в выборке отмечена тенденция к преобладанию носителей аллеля 677С.

При анализе результатов по клиническим подгруппам выявлено, в частности, что у больных с отсутствием роста или регрессом опухоли отмечается повышенная встречаемость генотипа 1G/1G гена ММР-1, тогда как быстрый рост миомы ассоциировался с пониженной частотой данного аллеля (табл. 2, рисунок).

 

График

Корреляция темпов роста лейомиомы с наличием генотипа 1G/1G (р = 0,02). По оси абсцисс - темпы роста лейомиомы (1 - регресс или отсутствие роста, 2 - медленный рост, 3 - быстрый рост). По оси ординат - частота встречаемости генотипа 1G/1G гена ММП-1.

 

Таблица 2. Взаимосвязи между частотами промоториых аллелей гена ММР-1 и темпами роста лейомиомы 

Группы больных/генотипы ММП-1	1G/1G	1G/2G	2G/2G
Суммарная выборка	28,6 % (40/140)	48,6 % (68/140)	22,9 % (32/140)
Отсутствие роста миомы или регресс	46,7 % (14/30)	36,7 % (11/30)	16,7% (5/30)
Медленный рост	27,5 % (19/69)	46,4 % (32/69)	26,1 % (18/69)
Быстрый рост миомы	17,1 % (7/41)	61,0% (25/41)	22,0 % (9/41)
Уровни достоверности различий	р = 0,023	р = 0,11	р = 0,58

Примечание. Приведены данные по группе из 140 больных, для которых имелась информация о динамике роста миомы. Приводятся различия между клиническими подгруппами.

 

Среди больных с медленным ростом опухоли этот показатель имел промежуточное значение. Указанные различия были достоверными при р = 0,02, что говорит о существенной связи между наличием низкоактивного аллеля ММР-1 и темпами роста новообразования.

Кроме того, обнаружена достоверная ассоциация между наличием аллеля 1G ММР-1 (генотипы 1G/1G и 1G/2G), и частотой встречаемости аденомиоза (р = 0,008). Как показано в табл. 3, частота генотипа 1G/1G существенно ниже у больных с аденомиозом, что, возможно, связано с его протективной ролью в отношении эктопической пролиферации клеток эндометрия.

Частота 1 G/lG гена матриксной металлопротеиназы-1 (ММР-1) оказалась в среднем менее высокой у больных с многоузловой формой миомы матки (р = 0,01, табл. 4). Можно предположить, что наличие гиперактивного аллеля 2G, напротив, предполагает усиленную склонность к диссеминации данного новообразования у больных с лейомиомой и, соответственно, к возникновению многоузловой формы лейомиомы.

В описанном контингенте больных нами также изучались частоты аллелей 5А и 6А гена ММР-3, тесно сцепленного с геном ММР-1 на хромосоме 11, а также гена MTHFR (С677Т). По данным аллелям не было выявлено статистически достоверных различий между подгруппами с различной клиникой. Этот результат подчеркивает особую значимость взаимосвязей между гомозиготным состоянием 1G/1G гена ММР-1 и клиническими характеристиками лейомиомы матки.

Обсуждение

В нашем исследовании участвовала репрезентативная группа женщин с лейомиомой матки. Их распределение по возрасту (в среднем 47 лет) соответствовало встречаемости симптомного заболевания у населения. На основании данных анамнеза и клинического обследования больные были классифицированы по темпам роста, количеству, локализации и размерам новообразований матки, а также сопутствующей патологии.

При анализе результатов выявлено, что быстрый темп роста миомы коррелирует с низкой частотой встречаемости у больных генотипа 1G/1G гена ММР-1. Количество миоматозных узлов также было существенно меньше у носителей генотипа 1G/1G.

 

Таблица 3. Частоты аллелей ММР-1 у больных с аденомиозом

Группы больных/генотипы ММП-1	1G/1G	1G/2G	2G/2G
Больные с аденомиозом	18,3% (17/93)	58,1 % (54/93)	23,7 % (22/93)
Больные без выявленного аденомиоза	36,4 % (28/77)	42,9 % (33/77)	20,8 % (16/77)
Уровни достоверности различий	р = 0,008	р = 0,048	р = 0,65

Примечание. Приведены данные обработки выборки из 170 больных лейомиомой матки.

 

Эта зависимость указывает на протективную роль менее активного аллеля 1G гена ММП-1, что подтверждает специфическую функцию ММП-1 в модификации межклеточного матрикса в зонах опухолевого роста. Можно предположить, что гиперактивный аллель 2G, напротив, способствует росту лейомиомы и увеличению количества узлов. Исследования [6] показали, что локальная экспрессия антигена ММР1 отмечается при лейомиоме в 90 % случаев. Inagaki N et al. (2003) выявили повышенный уровень активности ММР-1 и некоторых ростовых и провоспалительных цитокинов при лейомиоме и аденомиозе [10]. Эти данные предполагают сочетанное действие различных ростовых факторов в усилении коллагенолиза и ремоделинге ткани миомы, что должно вести к интенсивной пролиферации клеток опухоли, соединительнотканных клеточных элементов и, соответственно, усилению темпов роста лейомиомы. В ряде работ показан повышенный уровень транскрипции ММР-1 при 2G-варианте промотора [21]. Следовательно, полученные нами результаты согласуются с общепринятыми воззрениями на биологию опухолевого роста in vivo.

 

Таблица 4. Частоты аллелей гена ММП-1 у больных с различным количеством узлов лейомиомы

Количество узлов миомы	1G/1G	1G/2G	2G/2G
1 -2 узла	33,7 % (29/86)	47,7% (41/86)	18,6% (16/86)
3-4 узла	25,0% (11/44)	52,3 % (23/44)	22,7% (10/44)
5 и больше узлов	12,5 % (5/40)	57,5 % (23/40)	30,0% (12/40)
Достоверность различий	р-0,01	р = 0,86	р-0,14

 

 

Роль отдельных генных вариантов в патогенезе эндометриоза была впервые установлена отечественными исследователями несколько лет назад [2]. В частности, авторами показана ассоциация между генетически обусловленным дефицитом продукции энзимов детоксикации («нуль-аллель» GSTM и др.) и повышенным риском развития аденомиоза. Дальнейшее совершенствование генетического прогноза подобных мультигенных заболеваний возможно на путях поиска их ассоциаций с другими генными вариантами.

В настоящей работе нами показано, что у больных с аденомиозом снижена частота встречаемости генотипа 1G/1G гена ММР-1. Можно предположить, что больные гомозиготные по данному генотипу составляют группу сниженного риска по развитию этого осложнения. Напротив, больные-носители гиперактивного аллеля 2G (гомо- и гетерозиготы) попадают в группу повышенного риска и нуждаются в более тщательном мониторинге. Действительно, в недавнем исследовании, проведенном в Китае [19], было установлено, что у женщин, гомозиготных по аллелю 2G гена ММР-1, чаще встречается аденомиоз, чем у остальных пациенток, что подтверждает существенную роль аллеля 2G гена ММР-1 при данной патологии. Можно допустить, что при наличии у больных аллеля 2G наблюдается более активная продукция проэнзима матриксной металлопротеиназы-1, что приводит к активации коллагенолиза и облегченной миграции клеток эндометрия в зоны эктопического роста. Ramon et al. показали, что для женщин с эндометриозом характерен высокий уровень экспрессии мРНК ММР в ткани эндометрия [18].

Кроме того, важна роль неоангиогенеза в патогенезе как миомы, так и эндометриоза [5]. Матриксные металлопротеиназы участвуют в процессах деградации матрикса при росте тканей, тем самым формируя пространство для прорастания в межклеточном матриксе новых капилляров, которые обеспечивают питание новообразований. Исходя из этого, одним из методов лечения аденомиоза является использование ингибиторов ангиогенеза и матриксных металлопротеиназ [15].

Заключение

Динамика роста лейомиомы матки и развитие аденомиоза могут быть ассоциированы с гиперактивностью гена ММР-1 и перестройками межклеточного матрикса. Судя по известной нам литературе, этот факт обнаружен впервые и, тем самым, обнаружена связь между генным полиморфизмом в системе матриксных металлопротеиназ и развитием доброкачественных новообразований. Этот физиологический механизм следует учитывать в изучении патогенеза и выбора лечения этих состояний. Следовательно, больные, у которых выявлен генотип 1G/1G гена ММР-1, составляют группу пониженного риска по развитию симптом- ной миомы матки (быстрый темп роста опухоли, множественное узлообразование, большие размеры опухоли), а также сочетанию миомы с аденомиозом. Полученные результаты способствуют индивидуальному прогнозированию развития миомы с целью использования консервативных и малоинвазивных методов терапии (эмболизация или лапароскопическая перевязка маточных артерий) до клинического проявления заболевания.

About the authors

Е. В. Morozova

State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

А. B. Chukhlovin

State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education

Email: info@eco-vector.com

Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

N. V. Kulagina

State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education

Email: info@eco-vector.com

Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

А. А. Totolian

State Medical University named after acad. I.P. Pavlova; Medical Academy of Postgraduate Education

Email: info@eco-vector.com

Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine of the Ministry of Health of the Russian Federation

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

References

Supplementary files