Pooling Endocervical Samples for Chlamydia Trachomatis Diagnosis by Polymerase Chain Reaction: Cost Saving Strategy for Epidemiological and Screening Studies

Full Text

Генитальные инфекции, вызываемые Chlamydia trachomatis, относятся к числу самых распространенных инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Отличительной особенностью хламидийной инфекции является то, что у 50-70% женщин и 30- 50% мужчин заболевание протекает бессимптомно. Наиболее тяжелые последствия хламидийной инфекции - воспалительные заболевания органов малого таза, внематочная беременность и трубное бесплодие - связывают именно с этой ее характерной особенностью, так как вовремя не установленная, и поэтому не пролеченная инфекция может вызвать поражения органов малого таза. Кроме того, инфицированные Chlamydia trachomatis мужчины и женщины служат своего рода резервуаром хламидийной инфекции, обеспечивающим ее распространение в популяции. Проведение скрининга в пределах определенной популяции с целью выявления хламидийной инфекции представляется эффективным средством контроля над этим заболеванием и предотвращения его тяжелых последствий [15, 16]. Так, реализуемые в последние годы в США и некоторых странах Европы государственные скрининговые программы приводят к снижению распространенности хламидийной инфекции [ 1, 2, 5, 7, 18]. Методы, используемые в таких программах, должны быть как чувствительными, так и недорогими. Требованиям чувствительности в полной мере отвечают методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот - полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР) и другие. Однако высокая стоимость амплифика- ционных методов делает весьма проблематичным использование их в эпидемиологических и скрининговых исследованиях.

Недавно был предложен новый подход к проведению таких исследований, способный решить проблему их высокой стоимости - пулирование. Пулирование представляет собой объединение проб от нескольких пациентов и выявление инфекционного агента в объединенной пробе (пуле) с последующим анализом каждой пробы в пуле, если он окажется положительным. Экономическая эффективность пулирования зависит от распространенности хламидий в исследуемой популяции и от размера пула. Так, в работе R. Peeling et al (1998) [14] показано, что пулирование не эффективно, когда распространенность инфекции составляет 20% и выше; напротив, экономия средств становится существенной при снижении распространенности инфекции и достигает 50% при 5%-м показателе распространенности.

Планируя данную работу, мы ставили перед собой следующие задачи:

• определить оптимальный размер пула и методику пулирования для выявления С.trachomatis методом ПЦР, которые обеспечили бы максимальную экономию средств при минимальной, по сравнению с индивидуальным тестированием, потере чувстви- тельности;
• проанализировать возможность использования пулирования для определения распространенности С.trachomatis в данной популяции;
• с учетом полученных показателей оценить целесообразность использования пулирования для скрининга данной популяции.

Материалы и методы

Клинические пробы: сбор, транспортировка и хранение. Соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала были получены от пациенток женских консультаций (n=1500), расположенных в 16 районах Ленинградской области, в возрасте от 15 до 36 лет. Пробы собирали с помощью дакроновых тампонов [6], помещали в сухие пластиковые пробирки объемом 5 мл, плотно закрывали и отправляли в лабораторию микробиологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН. В лаборатории пробы регистрировали и тестировали индивидуально и в пулах по 5 и 10 проб. До анализа пробы хранили при 4 °C до 3-7 дней.

Индивидуальное тестирование. Подготовку проб для амплификации проводили с использованием реагентов ДНК-ЭКСПРЕСС (Литех, Москва). К пробе добавляли 1 мл физиологического раствора и, после встряхивания пробы на вортексе в течение 15 с,100 мкл переносили в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл. Затем пробу центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин, супернатант отбрасывали и добавляли к осадку 200 мкл лизирующего буфера; после встряхивания осадка на вортексе пробу инкубировали при 95 °C в течение 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 с. 5мкл обработанной пробы использовали в реакции амплификации с использованием тест-систем ПОЛИМИК C.trachomatis (Литех, Москва). Амплификацию проводили в следующем температурном, режиме: 93 °C — 30 с; 93 °C — 10 с,60 °C - 10 с,72 °C-10 с (35 циклов ); 72 °C — 1 мин. Продукты амплификации анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Индикатором ингибирования реакции служило отсутствие внутреннего контроля, включенного производителями тест-систем в реакционную смесь. В случае ингибирования амплификации пробу разводили в соответствии с инструкцией производителя: 100 мкл обработанной пробы переносили в пробирку, содержащую 200 мкл лизирующего буфера, пробу встряхивали на вортексе, инкубировали 10 мин при 95 °C и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 с.

Пулирование. Пулы формировали в порядке поступления проб, объединяя аликвоты по 100 мкл от 5 и 10 проб и получая, таким образом, пулы объемом 500 мкл и 1 мл, соответственно. Пулы центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, супернатант отбрасывали, к осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера (ДНК-ЭКСПРЕСС, Литех, Москва). Следующие этапы выделения ДНК, амплификацию и электрофорез проводили в соответствии с процедурой, описанной выше (см. Индивидуальное тестирование).

Определение распространенности C.trachomatis с использованием методики пулирования. Для определения распространенности хламидий в исследуемой популяции, основываясь на данных пулирования, использовали следующие формулы [10]:

• р={1-[1-(s/n)]¹// × 100%
• SD={{s/n[1 - (s/n)]^1/с}/с²n}^0,5 × 100%
• 95%CI=р±(2√SD),

где р — распространенность хламидий, SD — стандартное отклонение,95% CD — 95% доверительный интервал, s — количество положительных пулов, п — общее количество пулов, с — количество проб в пуле.

Анализ экономии средств. Процент экономии средств, связанной с уменьшением количества тестов при пулировании по сравнению с индивидуальным тестированием, рассчитывали с применением следующей формулы [11]:

CS=п - (Р + рр)/п × 100%,

где Р - общее количество пулов, рр - количество тестов, необходимых для идентификации положительных проб во всех положительных пулах, п — общее количество тестов. Стоимость расходных материалов и оплаты труда лабораторных работников в расчет не принимались.

Результаты и обсуждение

При индивидуальном анализе 1500 цервикальных проб методом ПЦР установлена частота встречаемости Chlamydia trachomatis, равная 6,6%. Результаты исследования, приведенные в таблице, показали, что пулирование не повлияло на чувствительность и специфичность анализа цервикальных проб методом ПЦР. Так, сопоставляя результаты индивидуального тестирования и тестирования пулированных проб, мы не выявили ни одного как ложно- положительного, так и ложноотрицательного пула. Было зарегистрировано только 2 случая ингибирования амплификации при индивидуальном тестировании. Интересно отметить, что при анализе пулов, в том числе тех, которые содержали пробы, ингибирующие ПЦР при индивидуальном тестировании, не было зарегистрировано ни одного случая ингибирования; объяснить этот факт можно разбавлением ингибиторов при пулировании. В целом, такой низкий показатель ингибирования, по нашему мнению, является результатом выбранных нами условий проведения исследования, а именно, процедур сбора, хранения и подготовки проб к амплификации. С одной стороны, такие условия, как хранение тампонов с цервикальными соскобами в сухих пробирках при 4 °C до 7 дней, ресуспендирование в физиологическом растворе непосредственно перед анализом и центрифугирование суспензий, были выбраны нами для того, чтобы сделать работу по транспортировке и хранению проб менее громоздкой, а аликвоты, отобранные для индивидуального тестирования и пулирования, равноценными. С другой стороны, некоторые процедуры обработки проб, такие как длительное хранение (до 3-7 дней) при 4 °C перед амплификацией и ре суспендирование соскобов клеток в физиологическом растворе с последующим центрифугированием клеточных суспензий, уменьшают количество случаев ингибирования и, таким образом, повышают чувствительность ПЦР, как показано в некоторых работах [3, 4, 9, 12, 13, 17]. Авторы приведенных здесь исследований объясняют это тем, что, во-первых, использование только осадка клеток после центрифугирования клеточной суспензии уменьшает влияние на реакцию растворимых ингибиторов. Во-вторых, ингибирующая активность некоторых нестабильных соединений, таких как гормоны и ферменты, может со временем снижаться.

Распространенность хламидийной инфекции в определенной популяции является предпосылкой для анализа целесообразности использования пулирования в скрининге данной популяции. Пу- лирование может служить экономичным средством точной и быстрой оценки распространенности хламидий [8]. В исследуемой нами популяции показатель распространенности хламидий, определенный индивидуальным тестированием, составил 6,6%, что находится в пределах 95% доверительных интервалов (95% СІ), определенных пулированием по 5 проб - 6,1%о (95СІ: 4,4-7,7) и по 10-6% (95%СІ: 4.3-7.7). Кроме того, в результате использования пулирования в качестве методики определения распространенности хламидий количество тестов, и, следовательно, расход средств, уменьшилось на 80% (300 вместо 1500), когда пробы пулировали по 5, и на 90% (150 вместо 1500), когда пробы пулировали по 10.

 

Таблица 1. Результаты пулирования цервикальныхсоскобов для выявления методом C. trachomatisПЦР

	Пулирование проб		Индивидуальное определение C. trachomatis
	по 5	по 10
Количество проб	1500	1500	1500
Количество пулов	300	150	—
Количество положительных пулов	80	69	—
Чувствительность	100%	100%	—
Специфичность	100%	100%	—
Распространенность хламидийной инфекции (95% СІ)	6,1(4,5-7,7)	6,0(4,3-7,7)	6,6%
Экономия средств для выявления индивидуальных случаев хламидийной инфекции	53,3%	44,0%	—
Экономия средств для оценки распространенности хламидий	80%	90%

 

Наше исследование показало, что пулирование цервикальных проб по 5 и 10 не повлияло существенным образом ни на качество диагностики хламидий, ни на точность оценки распространенности хламидий в исследуемой популяции. Пулирование по 5 и 10 проб снизило расход средств для выявления Chlamydia trachomatis методом ПЦР с целью диагностики на 53,3% и 44%, с целью оценки распространенности хламидий - на 80% и 90%, соответственно. Учитывая приведенные выше показатели, можно заключить, что оптимальный размер пула для использования пулирования с целью диагностики хламидий - 5 проб, для оценки распространенности хламидий -10 проб.

Таким образом, принимая во внимание ограниченность бюджетного финансирования медицинских учреждений, в обязанности которых входит контроль над ИППП, можно утверждать, что пулирование проб представляет собой эффективный диагностический подход к осуществлению контроля над некоторыми ИППП, в частности, над хламидийной инфекцией и может быть рекомендовано для проведения как обширных эпидемиологических исследований, так и скрининговых программ.

About the authors

E. V. Shipitsina

Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Ott, Russian Academy of Medical Sciences; Institute of Clinical Bacteriology, Uppsala University Sweden

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg; Uppsala

A. M. Savitsheva

Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Ott, Russian Academy of Medical Sciences; Institute of Clinical Bacteriology, Uppsala University Sweden

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg; Uppsala

M. A. Bashmakova

Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Ott, Russian Academy of Medical Sciences; Institute of Clinical Bacteriology, Uppsala University Sweden

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg; Uppsala

К. V. Shalepo

Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Ott, Russian Academy of Medical Sciences; Institute of Clinical Bacteriology, Uppsala University Sweden

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg; Uppsala

M. Domeika

Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Ott, Russian Academy of Medical Sciences; Institute of Clinical Bacteriology, Uppsala University Sweden

Email: info@eco-vector.com
Sweden, Saint Petersburg; Uppsala

References

Supplementary files