Local cytokine production in patients with external genital endometriosis

Full Text

Эндометриоз, по определению В. П. Баскакова [1], - опухолевидное гормонозависимое заболевание, сущность которого заключается в разрастании ткани, сходной по своему строению и функции с эндометрием, но находящейся за пределами границ нормального расположения слизистой оболочки матки, развивающееся на фоне нарушения иммунного гомеостаза.

По меткому выражению M. R. Cohen ( 1982) «Эндометриоз является почти эпидемией XX века от менархе до менопаузы».

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) не относится к классическим онкологическим заболеваниям, но представляет собой весьма удобную модель для изучения нарушений иммунитета при патологическом разрастании тканей, особенно эктопически расположенных.

Важная роль иммунитета в контроле пролиферации и дифференцировки клеток является одной из основных догм фундаментальной иммунологии. Это позволяет рассматривать неопластические процессы как результат «поломки» надзорных функций иммунной системы. Такие представления дают возможность не только улучшения диагностики, но и развития методов терапии, связанных с изменениями функций различных компонентов иммунной системы, определяющих противоопухолевый иммунитет. В этом плане большой интерес представляет изучение различных компонентов иммунной системы у больных эндометриозом. Исходя из предположения, что эндометриоз является заболеванием с нарушением «надзорных» функций иммунной системы [2], ранее нами были изучены изменения некоторых основных ее компонентов, определяющих противоопухолевый иммунитет. В частности было показано, что у больных НГЭ значительно снижены цитотоксическая активность NK-клеток и способность лимфоидных клеток к секреции б/в и г-интерферонов.

Однако несмотря на несомненную важность определения системных изменений иммунитета, можно предполагать, что основное значение имеет местное взаимодействие компонентов иммунной системы и патологически измененных клеток. Именно в очаге локализации эндометриоидных гетеротопий происходят те драматические события, которые определяют пути развития заболевания — или в сторону его прогрессирования, или в направлении регресса (лизирования имплантов). В этом плане огромное значение может иметь динамика и интенсивность продукции различных цитокинов в области разрастаний патологических очагов, а также клетками микроокружения.

Цитокины являются посредниками межклеточных взаимодействий, регулируют кроветворение, иммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Имеющиеся литературные данные относительно продукции цитокинов у больных НГЭ немногочисленны и противоречивы, что диктует необходимость дальнейшего изучения этой проблемы. Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных компенсаторно-приспособительных реакций в тканях с участием различных клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев с формированием типичной воспалительной реакции [3].

Целью наших исследований было изучение спектра и интенсивности продукции некоторых цитокинов эндометриоидными гетеротопиями в условиях органотипического культивирования, в сопоставлении с секреторной активностью клеток перитонеального эксудата и тканью эндометрия у женщин с наружным генитальным эндометриозом.

 

Рисунок 1. Содержание IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий

 

Рисунок 2. Содержание IL-2, TNF и IL-10 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий

 

Материалы и методы исследований

Проведено обследование 34 пациенток с НГЭ в возрасте от 19 до 35 лет. Диагноз генитального эндометриоза у всех больных верифицирован при лапароскопии и подтвержден данными гистологического исследования. Степень распространения наружного генитального эндометриоза определялась в баллах по пересмотренной классификации Американского Общества Фертильности R-AFS [5], оценивающей глубину инвазии, площадь эндометриоидных очагов и выраженность спаечного процесса.

Согласно этой классификации из 34 больных I степень НГЭ была диагностирована у 7 пациенток, II степень у 10, III степень у 8 и IV степень у 9 пациенток.

В контрольную группу вошли 15 здоровых женщин репродуктивного возраста, у которых была выполнена хирургическая стерилизация.

Во время лапароскопии были произведены заборы эндометриоидных гетеротопий, эндометрия и перитонеальной жидкости.

Для оценки локальной продукции цитокинов тканями проводилось органотипическое культивирование эндометриоидных гетеротопий и эндометрия. Использовалась методика J. Hirata [4] с нашими модификациями. Эндометриоидные гетеротопии и ткань эндометрия после получения незамедлительно помещались в стерильный раствор Хэнкса, трижды отмывались стерильным раствором PBS и помещались в стерильную пробирку, содержащую 1 мл RPM1 1640 с 10% ЭТС и антибиотиками (100 ME/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Далее проводилась инкубация в CO₂ инкубаторе (при t=37,0 °C,5% CO₂) в течение 1,5 часов. Затем надосадочная жидкость удалялась, к ткани добавлялся 1 мл RPMI 1640 без ЭТС и помещался в CO₂-инкубатор на 24 часа. После этого супернатант отбирался и замораживалсяся в стерильных полипропиленовых пробирках при t=-20 °C.

В полученных супернатантах эндометриоидных гетеротопий и эндометрия определяли содержание фактора некроза опухоли (TNF), интерлейкина-1ß (IL-1ß), IL-2, IL-6 и IL-8. Концентрацию цитокинов в культуральных средах оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем для определения TNF («Віотаг Diagnostic Systems»), IL-1ß, IL-2, IL-6 и IL-8 («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Уровни указанных цитокинов также определены в перитонеальной жидкости, взятой во время проведения лапароскопии у больных НГЭ и для сравнения у женщин контрольной группы.

Результаты исследования

При анализе содержания цитокинов в супернатантах культур эндометриоидных гетеротопий были получены следующие результаты: наиболее высоким установлено содержание IL-8, которое составило в среднем 1360,7 пг/мг ткани. Значение IL-6 составило 326,6 пг/мг ткани. Содержание IL-1(3, IL-2 и TNF в абсолютном выражении было невелико (рис. 1,2).

Изменения содержания в зависимости от степени распространенности НГЭ выявлены в отношении IL-1ß (рис. 3). Так, при I степени НГЭ уровень IL-1(3 составил 1,8 пг/мг, при НГЭ II

 

степени - 2,96 пг/мг, при НГЭ III степени - 8,4 пг/мг и при НГЭ IV степени - 6,18 пг/мг. IL-1 является одним из главных медиаторов, ответственных за развитие местной воспалительной реакции. Местная воспалительная реакция хотя и усиливается при переходе от «малых» форм НГЭ к более тяжелым, но, возможно, является недостаточной для регресса болезни.

 

Рисунок 3. Содержание интерлейкина-1ß в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространененности НГЭ

 

Рисунок 4. Содержание IL-8 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ

 

Рисунок 5. Содержание IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ

 

Уровень IL-8 зависел от степени распространенности НГЭ и составил при I степени - 254,43 пг/мг, при II степени НГЭ - 910,7 пг/мг, при III степени НГЭ - 3059 пг/мг и при НГЭ IV степени - 789 пг/мг (рис. 4). Такое прогрессивное повышение выработки IL-8 от малых степеней НГЭ к более тяжелым, указывает на усиление пролиферативных процессов, так как именно IL-8 играет ключевую роль в пролиферативной активности эпителиальных клеток и ангиогенезе очага эндометриоза. В то же время снижение уровня IL-8 при IV степени НГЭ может свидетельствовать об уменьшении или истощении резервных секреторных возможностей иммунокомпетентных клеток.

Подобная динамика отмечалась и при определении уровня IL-6. Содержание IL-6 при НГЭ I степени составило 64 пг/мг, при НГЭ II степени - 311,8 пг/мг, при НГЭ III степени - 1029 пг/мг и при НГЭ IV степени -613,2 пг/мг. На рис. 5 отражено, что наиболее высокие значения содержания IL-6 были отмечены при III и IV степенях НГЭ, что свидетельствует об усилении воспалительной реакции в эндометриоидном очаге при прогрессировании заболевания.

При определении содержания IL-2 показано его достоверное повышение, зависисящее от степени тяжести заболевания (минимальное значение при I степени, максимальное при IV степени НГЭ). Так, значение IL-2 при НГЭ I степени составило 4,73 пг/мг, при НГЭ II степени -6,8 пг/мг, при НГЭ III степени - 10,47 пг/мг и при НГЭ IV степени - 26,3 пг/мг. Прогрессивное возрастание продукции IL-2 в зависимости от степени распространенности НГЭ можно расценивать как защитную реакцию иммунной системы, так как основной биологический эффект IL-2 заключается в стимуляции лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью, усиление продукции IFN-γ и противоопухолевой активности.

Достоверных различий в содержании TNF у пациенток с различной степенью эндометриоза нами обнаружено не было. В среднем его содержание составило 2,31 пг/мг ткани.

 

Рисунок 6. Содержание IL-2 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий в зависимости от степени распространенности НГЭ

 

С целью выявления соответствия продукции цитокинов эндо метриоидными гетеротопиями и тканью эндометрия, произведено изучение цитокинового профиля ткани эндометрия больных НГЭ.

У всех женщин исследование проводилось во второй фазе менструального цикла. Так, максимальные значения установлены в отношении содержания IL-8 - 2340,5 пг/мг ткани. Выявлены различия в количественном содержании исследуемых цитокинов (IL-1ß, IL-2, IL-6, IL-8 и TNF) в образцах эндометрия (рис. 6). Уровень IL-6 составил 463,2 пг/ мг ткани, IL-2 - 11,8 пг/мг ткани, IL-1ß - 3,85 пг/мг и TNF - 4,66 пг/мг ткани (рис. 7,8).

 

Рисунок 7.Содержание IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больных НГЭ

 

Рисунок 8. Содержание IL-2, TNF и IL-1ß в супернатантах эндометрия больных НГЭ

 

Среднее содержание IL-8 в супернатантах эндометрия от женщин, больных НГЭ, составило 2340,5 пг/мг, тогда как в контрольной группе 1287,66.

Среднее содержание IL-6 в супернатантах эндометрия составило 463,16 пг/мг, а в контрольной группе 172,04 пг/мг ткани (рис. 9).

 

 

Рисунок 9. Содержание IL-8 IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больныхНГЭ и контрольной группы

 

Существенных различий в содержании IL-1(3, IL-2 и TNF в супернатантах эндометрия больных НГЭ и здоровых женщин отмечено не было (рис. 10).

 

Рисунок 10. Содержание IL-ip, IL-2 и TNF в супернатальных эндометрии больных НГЭ и контрольной группы

 

При анализе образцов перитонеальной жидкости больных НГЭ и женщин контрольной группы, выявлены достоверные отличия в содержании IL-1 ß, TNF, IL-6,IL-8 и IL-6 в супернатантах эндометрия больных НГЭ и контрольной группы

 

Рисунок 11. Содержание IL-1ß, IL-6 и IL-8 в перитонеальной жидкости

 

Рисунок 12. Содержание IL-2 и TNF в перитонеальной жидкости больных

 

НГЭ и контрольной группы в то же время при сравнении уровней IL-2 и IL-8 больных НГЭ с аналогичными показателями контрольной группы, достоверных отличий выявлено не было (рис. 11,12).

Интересно отметить, что концентрация IL-1ß в перитонеальной жидкости больных эндометриозом более чем в два раза превышала концентрацию IL-1ß в перитонеальной жидкости здоровых женщин.

Уровень TNF в перитонеальной жидкости больных эндометриозом превышал в 7 раз, а IL-6 в два раза по сравнению с аналогичными показателями здоровых женщин.

Обсуждение результатов исследования

При анализе полученных данных выяснено, что при развитии эндометриоза повышен уровень провоспалительных цитокинов как в перитонеальной жидкости, так и в строме эндометрия.

Возможно, определенную роль в прогрессировании эндометриоза играет IL-8, как важный ангиогенный фактор, способствующий васкуляризации эктопических эндометриальных внедрений.

При изучении зависимости концентрации IL-8 от степени распространенности процесса, выявлено его максимальное значение при III-ей степени заболевания, т. е. при переходе от начальной стадии в более тяжелую, при которой усиливаются пролиферативные процессы. В то же время снижение уровня IL-8 при IV степени НГЭ может свидетельствовать о снижении или истощении резервных секреторных возможностей иммунокомпетентных клеток.

При изучении уровня IL-8 в супернатантах эндометрия выявлено увеличение его концентрации в 2 раза в эндометрии женщин с генитальным эндометриозом по сравнению с эндометрием здоровых женщин. Возможно, именно стимулирующее действие IL-8 на адгезию клеток эндометрия к брюшине вносит вклад в возникновение эктопических очагов эндометрия, а изменение концентрации этого цитокина отражает выраженность пролиферативного процесса.

При анализе содержания IL-6 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий также обращает на себя внимание его повышение в зависимости от степени распространения процесса. Известно, что IL-6 - мультифункциональный цитокин, регулирующий иммунный ответ, острофазную воспалительную реакцию. Этот цитокин отсутствует в сыворотке крови в нормальных: физиологических условиях, но количество его резко повышается при многих иммунологических реакциях, воспалении или повреждениях ткани. Максимальный уровень IL-6 установлен при III степени НГЭ. Можно предположить, что повышение IL-6 при переходе от «малых» форм (I и II степени НГЭ) к более тяжелым (III и IV степени) связано с усилением воспалительной реакции в ответ на повреждение. Парадоксальная реакция в отношении снижения продукции ИЛ-6 при переходе от III к IV степени распространения НГЭ также может быть объяснена достижением при III степени НГЭ максимальной активности клеток, продуцирующих IL-6, и истощением их компенсаторных возможностей при IV степени.

Повышение более чем в 2 раза продукции IL-1ß и TNF в перитонеальной жидкости больных НГЭ свидетельствует о высоком уровне активности мононуклеарных фагоцитов (о достижении максимального уровня их активации).

Учитывая тот факт, что IL-6 является антагонистом IL-1ß и TNF, синхронное повышение продукции этих цитокинов можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на снижение уровня продукции про- воспалительных цитокинов, попытку сохранения баланса в цитокиновой сети.

С нашей точки зрения, повышение продукции IL-6 иммунокомпетентными клетками, участвующих в осуществлении воспалительной реакции и иммунного ответа в перитонеальной жидкости у больных НГЭ, можно расценивать как компенсаторную реакцию в ответ на повышение продукции TNF и IL-1ß.

Выявленные соответствия в изменении продукции провоспалительных цитокинов тканями эндометриоидных гетеротопий, эндометрия и клетками перитонеального эксудата могут свидетельствовать о системных изменениях регуляции продукции цитокинов в процессе развития НГЭ. Не совсем ясно, почему активированные макрофаги не фагоцитируют эндометриальные клетки, как в здоровом организме, а продолжают выделять интерлейкины, TNF, отсутствующие в таком большом количестве у здоровых женщин. По мнению Dmowski W.P. [6], «переключение» фагоцитарной активности на секреторную перитонеальных макрофагов зависит от «перегрузки» иммунной системы брюшной полости вследствие поступления большого количества эндометриальных клеток, или скорее является проявлением специфических нарушений клеточно-опосредованного иммунитета у больных эндометриозом.

При анализе содержания IL-2 в супернатантах эндометриоидных гетеротопий, отмечено прямое возрастание его концентрации в зависимости от тяжести заболевания. Такое повышение содержания IL-2 в очагах эндометриоза можно объяснитъ как защитную реакцию со стороны иммунной системы, направленную на стимуляцию главным образом функций Т-лимфоцитов и макрофагов, что приводит к развитию клеточного типа ответа. Однако отсутствие ожидаемого повышения уровня IL-2 в супернатантах эндометрия и перитонеальной жидкости больных НГЭ, может свидетельствовать о системных дефектах Т-клеточного звена иммунитета при эндометриозе.

Таким образом, изучение цитокинового профиля супернатантов эндометрия, эндометриоидных гетеротопий, а также перитонеальной жидкости больных НГЭ позволяет конкретизировать механизмы иммунных нарушений на локальном уровне при эндометриозе. Возможно, именно изменения местного иммунитета создают условия для возникновения и развития очагов эндометриоза.

Дальнейшие исследования в этой области позволят расширить диагностические возможности и выбрать необходимую патогенетически обоснованную терапию, в частности, с использованием генноинженерных аналогов естественных цитокинов.

About the authors

S. A. Selkov

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. L. Kramareva

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

O. V. Pavlov

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

М. I. Yarmolinskaya

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files