Особенности митотической активности клеток цитотрофобласта хориона у эмбрионов первого триместра беременности

Полный текст

Введение Цитотрофобласт ворсинчатого хориона (ЦТБ) представляет собой камбиальный слой синцитиотрофобласта и обладает высокой спонтанной митотической активностью. Известно, что пролиферативная активность клеток ЦТБ хориона достигает максимума в первом триместре и постепенно снижается по мере прогрессирования беременности [1; 16]. Одним из подходов к анализу пролиферации клеток является определение митотического индекса (МИ), величина которого характеризует долю клеток, находящихся в митозе [6]. Эти исследования можно дополнить путем определения общей продолжительности клеточного цикла (КЦ). Данные, полученные в экспериментах по изучению общей продолжительности КЦ и отдельных его фаз, а также МИ в клетках ЦТБ человека, скудны и противоречивы [2; 3; 30; 24; 40]. Кроме того, в работах, посвященных анализу особенностей пролиферации ЦТБ хориона, отсутствует четкое разделение исследуемого материала на образцы, полученные от эмбрионов при физиологически нормальной или неразвивающейся беременности. При этом известно, что нарушения пролиферации и дифференцировки клеток цитотрофобласта могут приводить не только к функциональной недостаточности плаценты, расстройствам трофики и дыхания, но и к остановке развития плода. Поэтому особый интерес представляет исследование спонтанной митотической активности клеток ЦТБ хориона при физиологически нормальной и неразвивающейся беременности. В этой связи целью настоящего исследования явился анализ особенностей митотической активности клеток цитотрофобласта хориона человека в I триместре при нормальной и неразвивающейся беременности. Материалы и методы Материалом исследования служили образцы ворсинчатого хориона, полученные после прерывания беременности в срок 5/6–10 недель по медицинским показаниям (диагноз «неразвивающаяся беременность», группа НБ, 8 образцов) и по желанию женщины (группа ФБ, физиологическая беременность, 6 образцов). Продолжительность КЦ оценивали методом «меченых» митозов (Епифанова, 2003), используя в качестве аналога азотистого основания 5-бромдезоксиуридин (БДУ). Образцы ворсин хориона инкубировали в среде RPMI 1640 («Биолот») с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки («Биолот») и БДУ (конечная концентрация 10–15 мкг/мл) в течение 24, 48 и 72 ч. По окончании времени инкубации готовили препараты метафазных хромосом как описано в [14]. В качестве контроля использовали препараты, приготовленные из ворсин, инкубированных в среде, не содержащей БДУ, а также из ворсин, не подвергавшихся предварительному инкубированию [1]. Препараты окрашивали 0,01 % акридиновым оранжевым (АО), приготовленным на натрий-фосфатном буфере (рН = 7,0), либо проводили иммуноцитохимическую детекцию БДУ c помощью моноклональных антител [1]. Принадлежность метафазной пластинки к первой, второй или третьей генерации (т. е. прохождение клетками одного, двух или трех циклов репликации ДНК) определяли по дифференциальной окраске сестринских хроматид [15; 34]. Анализ препаратов проводили на микроскопе LEICA DMLS, оборудованного цветной камерой Leica DFC320, блоком светофильтров I3 и программным обеспечением для анализа изображений. МИ рассчитывали по формуле: (1) МИ = (количество митозов/10000 ядер) × 100 % Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «In Start Graph Pad Prism» и формул [4]. Результаты и обсуждение Массовые исследования спонтанных абортов показали ограниченные возможности традиционного цитогенетического анализа, обусловленные трудностями культивирования клеток из тканей абортусов, подвергшихся аутолизу [9; 10], или отсутствием спонтанных митозов в ЦТБ хориона [17]. Использование полупрямого метода приготовления препаратов (то есть после непродолжительного инкубирования ворсин хориона в питательной среде) зачастую оказывается неэффективным. Как и при прямом методе (исключающем этап культивирования) число делящихся клеток в ЦТБ, пригодных для хромосомного анализа, редко достигает уровня, предъявляемого к препаратам из клеточных культур [1]. Согласно международным стандартам [21], уровень успешных цитогенетических исследований ворсин хориона при прямом методе составляет 90 %, а продуктов зачатия и частей плода материала — 60 %. Учитывая актуальность цитогенетического анализа при неразвивающейся беременности, нами было предпринято сравнительное исследование митотического потенциала клеток ЦТБ в образцах хориона в группах НБ и ФБ. Информацию о вступлении клеток в деление получали, регистрируя митозы с «мечеными» хромосомами через различные промежутки времени после однократного введения БДУ при постановке клеточной культуры [7]. Идентификацию «меченых» митозов проводили с помощью окраски АО, при которой участок хромосомы, включивший БДУ, флуоресцирует в красной области спектра, не включивший — в желто-зеленой. После одного раунда репликации ДНК в присутствии БДУ плечи всех хромосом окрашиваются равномерно в желто-зеленый цвет, а для хромосом 1, 9, 16, акроцентрических хромосом и длинного плеча Y-хромосомы характерна ассиметричная латеральная окраска гетерохроматиновых районов (ГХР) [15]. После двух раундов репликации отмечается дифференциальная окраска сестринских хроматид и сестринские хроматидные обмены (СХО), после трех — хромосомы с сестринскими хроматидами трех типов (с одинаковой и с дифференциальной окраской, а также с СХО) [34]. Однако в собственных экспериментах в ГХР хромосом 1, 9, 16 и Y мы наблюдали одинаковую красную флуоресценцию АО на обеих сестринских хроматидах независимо от времени инкубирования образца (рис. 1 а), что не позволяло идентифицировать метафазы после одного раунда репликации ДНК. Следует отметить, что и после двух раундов репликации одновременно с дифференциальной окраской сестринских хроматид мы также обнаружили необычную красную флуоресценцию ГХР (рис. 1 б). Данный факт, по-видимому, обусловлен особой организацией ГХР в ЦТБ. Поэтому для определения метафаз после одного раунда репликации, использовали иммуноцитохимический метод детекции БДУ с помощью специфических антител [38; 39]. Исходя из красной флуоресценции ГХР при окрашивании препаратов АО, мы ожидали, что сайты включения антител будут более представлены в районах 1qh, 9qh, 16qh и Yqh. Однако только в 2 из 119 проанализированных метафаз в обеих группах, независимо от времени инкубирования образцов, хромосомы полностью прошли один раунд репликации (рис. 2). Также были зарегистрированы метафазные пластинки, окраска хромосом в которых указывала, что на момент добавления БДУ они находились во второй половине S-фазы. При этом в 6 из 10 метафаз не было зарегистрировано сигнала антител в ГХР (рис. 3), что можно объяснить асинхронной репликацией гомологов при более раннем начале репликации одного из них. Возможно, к моменту добавления БДУ репликация гомологичных ГХР уже была завершена. Как было показано [19], С-блоки хромосом имеют как минимум два подтипа позднореплицирующегося ГХ. Один из этих подтипов начинает репликацию раньше, а второй подтип — самым последним, завершая репликацию всего генома. Кроме того, в ранние сроки беременности репликация ГХР хромосом в ЦТБ может происходить одновременно с некоторыми R-сегментами хромосом, то есть в первой половине S-фазы [12]. Ранняя репликация ГХ показана также у дрожжей [31], дрозофилы [28], мыши [37]. Особый интерес представляли метафазные пластинки, в которых отсутствовал сигнал антител к БДУ в ГХ районах хромосом 1, 9, 16 при относительно равномерном распределении сигнала по плечам всех хромосом, что свидетельствует о прохождении клеткой одного полного раунда репликации (рис. 4). О том, что это явление не является методическим артефактом, свидетельствует отсутствие сигнала на 3 из 4 ядер (рис. 3) и на 2 из 3 ядер (рис. 4), очевидно находящихся в стадии покоя. Известно, что метод иммуноцитохимической детекции БДУ имеет ограничение, связанное с различной доступностью хроматина для антител после денатурации ДНК [23; 22]. Структура хроматина, в свою очередь, может зависеть и от того, на какой стадии S фазы (поздней или ранней) БДУ был доступен для клеток [22]. Причиной отсутствия сигнала может быть также недорепликация ГХ, которая описана для интеркалярного ГХ политенных хромосом, образующихся вследствие нескольких раундов репликации без вступления клетки в митоз, у дрозофилы. Возможно, что недорепликация прицентромерного ГХ и, как следствие — эндомитоз — является одним из механизмов полиплоидизации, которая регулярно происходит в клетках трофобласта у млекопитающих и человека [8; 27]. Это предположение подтверждается относительно частой регистрацией эндомитозов при рутинном цитогенетическом анализе клеток ЦТБ при нормальной и неразвивающейся беременности [1]. Известно также, что в случае незавершения репликации клетка может вступить в апоптоз, что также характерно для клеток ЦТБ хориона. Однако связано ли наблюдаемое нами в некоторых клетках явление с ранней репликацией или недорепликацией ГХР хромосом 1, 9, 16, либо с недоступностью участков, содержащих БДУ, для антител, остается неясным. Таким образом, ни с помощью АО, ни моноклональных антител к БДУ нам не удалось четко идентифицировать метафазы, хромосомы в которых завершили один раунд репликации и вступили во второе деление. Исходя из предположения, что митотический потенциал клеток ЦТБ может снижаться при НБ, мы провели сравнительный анализ числа клеток, прошедших 2 раунда репликации (табл. 1). Частота клеток, прошедших 2 раунда репликации, варьировала в широких пределах во всех образцах (табл. 1). Эта вариабельность обусловлена, в первую очередь, гетерогенностью клеточной популяции [29; 32]. Следует отметить, что при проведении экспериментов в работе нами не были использованы синхронизирующие агенты, поэтому клетки ЦТБ в момент добавления БДУ находились на разных стадиях клеточного цикла. Кроме того, известно, что митотическая активность клеток хориона в различных ворсинах неодинакова. Межиндивидуальная вариабельность в обеих исследованных группах также может быть обусловлена особенностями кариотипа [11; 5; 9; 10; 13], сроками беременности и стадией, на которой произошла остановка развития [3]. Несмотря на существенные отличия в частоте «меченых» митозов в пределах группы, обращала на себя внимание тенденция к задержке вступления клеток в митоз в группе НБ. Так, после 24-часовой инкубации встречались единичные метафазные пластинки 2-й генерации только в группе ФБ (3,1 ± 3,1 %). При увеличении времени инкубирования до 48 ч. две S-фазы прошли 36,1 ± 16,0 % клеток в группе ФБ по сравнению с 10,5 ± 4,2 % в группе НБ. Возможно, это связано с нарушением параметров КЦ после «шока», который испытывают клетки ЦТБ в момент биопсии хориона [1], и для вступления клеток в митоз необходим некий «лаг-период». Для ЦТБ группы ФБ он, по-видимому, короче, чем для группы НБ. Вместе с тем, на сохранение пролиферативной активности клеток ЦТБ в условиях in vitro указывает значительный прирост клеток 2-й генерации при увеличении времени инкубации до 72 ч. — в 1,5 раза в группе ФБ и в 5 раз в группе НБ. При этом различия между группами существенно нивелируются (табл. 1). С одной стороны не наблюдается значительного повышения доли клеток 2-й генерации в образцах группы ФБ, что можно было ожидать, ориентируясь на результаты инкубации в течение 48 ч; с другой стороны наблюдается рост митотической активности ЦТБ в группе НБ. Следует отметить, что нами ни в одном случае не было зарегистрировано клеток 3-й генерации. Незначительное число таких метафаз было обнаружено и в аналогичных исследованиях [40]. Эти результаты свидетельствуют о «лимите деления», т. е. ограниченном числе циклов, которое проходит клетка в условиях in vitro. Согласно полученным данным, этот лимит не превышает 2–3 последовательных циклов. По-видимому, ограниченное число делений в условиях in vitro является характерным для клеток ЦТБ не только в условиях органной культуры. В первичных клеточных культурах клетки трофобласта также быстро утрачивают способность к митотическому делению, вступают в апоптоз или дифференцируются [26]. В условиях in vivo клетки в тканях организма после выхода из цикла как после окончания митоза, так и по завершению синтеза ДНК в S-фазе, могут вступить в состояние пролиферативного покоя [7]. Особое значение это состояние имеет для стволовых клеток, в том числе и стволовых клеток ворсинчатого ЦТБ, которые на протяжении всей беременности обладают способностью к самоподдержанию и сохраняют возможность дифференцироваться в функционально специализированные клетки [18; 29]. Наиболее высокой митотической активностью обладают клетки ЦТБ, которые концентрируются на вершинах и в местах ветвления ворсин, образуя так называемые «клеточные столбики» [32]. Смена периодов покоя и активной пролиферации клеток является основой координированного роста и регуляции численности и размеров клеточных популяций в пределах ткани и органа. При этом для вступления клеток, находящихся в состоянии пролиферативного покоя, необходимы определенные стимулы [7]. Адекватными подходами для оценки влияния различных факторов на митотическую активность клеток в клеточной популяции могут служить гистохимические методы с использованием антител к белкам-маркерам пролиферации и апоптоза, а также определение МИ на цитогенетических препаратах. Поэтому на следующем этапе данной работы мы провели сравнительный анализ величины МИ в нативных и инкубированных при различных условиях образцах хориона. Как видно из данных представленных в таблице 2, величина МИ в нативных образцах хориона в обеих группах существенно варьирует независимо от срока развития, а также наличия и типа аномалии кариотипа в ЦТБ. Основной причиной этой вариабельности является, по-видимому, различная интенсивность роста и рамификации ворсин [32]. Большинство исследователей сходятся во мнении, что степень васкуляризации, наличие терминальных ворсин и другие особенности строения хориона, не коррелируют с величиной митотического индекса на «прямых» препаратах из ворсин хориона [36; 33]. Как и другие авторы [2; 24], мы обратили внимание на тенденцию к увеличению частоты митозов в условиях in vitro в большинстве образцов (табл. 2). Как было показано, на пролиферацию ЦТБ в условиях in vitro могут влиять такие факторы, как продолжительность инкубирования образца [2; 24], концентрация кислорода и эмбриональной телячьей сыворотки [25; 24]. Известно также, что наличие в питательной среде БДУ может изменять общую продолжительность КЦ и его отдельных фаз [15; 20; 40], что в свою очередь может снижать МИ. Однако, по-видимому, вследствие выраженных различий МИ в разных ворсинах, полученных из одного хориона, а также в образцах хориона от разных эмбрионов, нам не удалось выявить значимого влияния длительности инкубирования (коэффициент регрессии, недостоверно отличался от нуля, Р > 0,05, табл. 2), а также наличия БДУ в питательной среде. Только для двух образцов № 5 и № 6, группы ФБ из 6 исследованных (табл. 2), были обнаружены статистически значимые различия (t = 4,914, Р< 0,05; t = 6,286, Р< 0,05). Таким образом, в результате исследования нами отмечена тенденция к замедленному вступлению в митоз клеток ЦТБ в группе НБ, что свидетельствует о сниженном пролиферативном потенциале клеток ЦТБ при НБ. Однако способность к пролиферации клеток ЦТБ хориона при НБ повышается в условиях in vitro и не зависит от наличия БДУ в питательной среде. Полученные нами данные свидетельствуют, что использование полупрямого метода приготовления препаратов хромосом с инкубированием образцов хориона в течение 24–72 ч в сочетании с методом дифференциальной окраски RBA, предполагающем использование БДУ, может повысить результативность и разрешающую способность цитогенетической диагностики при анализе причин неразвивающейся беременности. Кроме того, нами выявлены особенности организации прицентромерных ГХР хромосом 1, 9 и 16, которые выражались в необычной окраске флуорохромом АО и особенностях репликации. Следует подчеркнуть, что в настоящее время прицентромерному ГХ отводится важная роль в регуляции функций генома в развитии [35]. Однако вклад ГХР хромосом 1, 9 и 16, а также значение полиморфизма по этим районам продолжают оставаться загадочными.

Об авторах

Ирина Леонидовна Трофимова

ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН

Email: irina311@inbox.ru
научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней

Ева Валерьевна Евдокименко

Санкт-Петербургский государственный университет

студентка кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета

Татьяна Владимировна Кузнецова

ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН

Email: tkuznetzova@mail.ru
д. б. н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней

Список литературы

Дополнительные файлы