Активность глутатионпероксидазы в эндометриоидных очагах при хирургическом моделировании эндометриоза

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Согласно данным ряда исследований развитие эндометриоза сопряжено с изменениями активности антиоксидантых ферментов в ткани эндометрия, а также с полиморфизмами их генов. При эндометриозе выявлены изменения активности каталазы [1, 2]. Получены также данные, указывающие на возможность связи полиморфизма промотора гена, кодирующего этот фермент, с риском развития эндометриоза [3]. В нашем недавнем исследовании активности каталазы в смоделированных у крыс эндометриоидных гетеротопиях с разной степенью регресса была выявлена обратная корреляция между активностью фермента и массой гетеротопий (p < 0,025) [4]. Экспрессия классической внутриклеточной формы глутатионпероксидазы (GPx1) также подвергается изменениям при эндометриозе: циклические изменения экспрессии GPx1 в эндометрии нарушены при данном заболевании [5]. Каталаза и глутатионпероксидаза (GPx) — ферменты, сходные в функциональном смысле, их роль состоит в детоксикации пероксида водорода и, соответственно, снижении уровня свободнорадикального окисления [6]. Полученные ранее данные указывают на целесообразность оценки активности антиоксидантных ферментов в гетеротопиях с разной степенью их регресса — это важно как для понимания механизмов развития и регресса эндометриоидных очагов, так и для оценки возможности прогноза течения заболевания по уровню активности этих ферментов. Настоящее исследование, в котором определяли глутатионпероксидазную активность, аналогично исследованию, проведенному ранее для каталазной активности в эндометриоидных очагах [4].

Цель — количественно оценить глутатионпероксидазную активность в ткани эндометриоидных очагов с разной степенью регресса, смоделированных на лабораторных крысах. В задачи входили оценка возможности применения разработанного ранее метода определения активности GPx для работы с тканью эндометриоидных имплантов и (при положительном ответе) оценка связи между активностью GPx и их массой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на половозрелых самках крыс линии Вистар массой 230–320 г. Все лабораторные животные были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область) и находились в регламентированных условиях вивария ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения день : ночь — 12 : 12 ч).

Подготовку животных к операции и выполнение операции по моделированию эндометриоза проводили согласно описаниям в работах [4, 7]. Все операции выполняли на стадии эструс, стандартизируя условия трансплантации фрагментов матки животных, находящихся на одинаковой стадии эстрального цикла. Осуществляли аутотрансплантацию фрагментов ткани матки размером 3 × 3 мм на участки в брюшной полости животного. Всем животным во время операции также проведена двусторонняя овариоэктомия с последующей заместительной терапией этинилэстрадиолом. Через 2 нед. выполняли диагностическую лапаротомию для подтверждения жизнеспособности имплантов, спустя еще 3 нед. животных выводили из эксперимента, используя глубокий ингаляционный наркоз. Иссеченные эндометриальные очаги замораживали и хранили при –85 °С до приготовления гомогенатов. От каждого животного использовали по одному импланту; остальные импланты применяли для других исследований.

Каждый имплант тщательно промывали в изотоническом растворе натрия хлорида и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в охлажденном 0,05 М K-Na-фосфатном буфере (рН 7,8) в течение 60 с. Общий объем буфера для приготовления гомогената составлял 50–80 мкл в зависимости от размера образца. Точный объем буфера при гомогенизации регистрировали для последующего расчета массы растворимого белка в ткани. Гомогенаты центрифугировали 6 мин при 4 °C, 1000 g. Супернатант использовали как биоматериал для определения активности GPx.

Глутатионпероксидазную активность определяли по модифицированному методу с использованием пероксида водорода в качестве субстрата [8]. Для реакционной смеси I использовали реактив А — 0,64 мМ раствор восстановленной формы глутатиона (GSH) в смеси 0,1 М трис-HCl-буфера (pH 8,5), содержащего 0,34 мМ ЭДТА, и водного раствора NaN₃ (26 мг/мл). Смесь буфера и раствора NaN₃ готовили в объемном соотношении 17 : 1. Реакцию инициировали добавлением реактива Б — 5 мМ водного раствора H₂O₂. Реактив Б готовили разведением в 4 раза водного раствора H₂O₂, имеющего поглощение при 240 нм, равное 0,872 (то есть разведением в 4 раза 20 мМ раствора пероксида водорода). Реакцию останавливали внесением 30 % (w/v) трихлоруксусной кислоты. Концентрация трихлоруксусной кислоты не должна превышать данное значение, иначе последующее окрашивание проб в реакции с реактивом Эллмана будет затруднено [9].

Заполнение проб и ход определения

Реакцию проводят при 37 °С на водяной бане в пробирках «Эппендорф». Аликвоты реактива А объемом 90 мкл аккуратно вносят на дно пробирок, избегая образования капель, отделившихся и осевших на стенках пробирки. Преинкубируют пробирки несколько минут на водяной бане. Затем вносят реактивы согласно четырем схемам постановки реакции.

SUM: вносят одновременно 4 мкл реактива Б и 10 мкл биоматериала, затем инкубация 40 с, внесение 20 мкл трихлоруксусной кислоты.

NEO: вносят одновременно 4 мкл реактива Б и 10 мкл растворителя биоматериала (в данном случае — фосфатного буфера), затем инкубация 40 с, внесение 20 мкл трихлоруксусной кислоты.

Х: вносят 10 мкл биоматериала, инкубируют 40 с, одновременно добавляют 4 мкл реактива Б и 20 мкл трихлоруксусной кислоты.

ST: вносят 10 мкл растворителя биоматериала, инкубируют 40 с, одновременно добавляют 4 мкл реактива Б и 20 мкл трихлоруксусной кислоты.

При одновременном внесении реактивов их предварительно не смешивают. Для этого заранее наносят 4 мкл реактива Б на стенку пробирки выше уровня реактива А и затем вносят биоматериал (по схемам SUM и NEO) или трихлоруксусную кислоту (по схемам X и ST), тщательно пипетируя, перемешивая и споласкивая стенки смесью реактивов.

Если позволяет объем биоматериала, можно использовать пропорционально увеличенные объемы реактивов (рис. 1): 180 мкл реактива А, 20 мкл биоматериала, 8 мкл реактива Б и 40 мкл раствора трихлоруксусной кислоты.

 

Рис. 1. Одновременное внесение пероксида водорода и биоматериала в реакционную смесь: 1 — реактив А (180 мкл); 2 — 5 мМ H2O2 (8 мкл); 3 — биоматериал (20 мкл). Фото А.Д. Юшиной

 

После терминации реакции пробы центрифугируют при комнатной температуре 10 мин при 1000 g. Реакционную смесь II для каждой пробы собирают следующим образом: к 108 мкл каждого супернатанта, содержащего остаточный GSH, последовательно добавляют 1160 мкл 0,1 М трис-НСl-буфера с 0,34 мМ ЭДТА (рН 8,5) и затем через те же промежутки времени в каждую пробу (в той же последовательности проб) вносят 9 мкл раствора 5,5’-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), или реактива Эллмана (4 мг на 1 мл абсолютного метанола). Наблюдается желтое окрашивание смеси. При добавлении реактива в каждую следующую пробу с интервалом в полминуты за 7,5 мин можно провести реакцию в 15 пробах. Поглощение при 412 нм регистрируют через следующие 7–8 мин, по очереди фотометрируя каждую пробу через тот же самый промежуток времени, через который вносили реактив Эллмана. Окрашивание проб и измерение оптической плотности проводят при комнатной температуре. Для точной оценки концентрации GSH поглощения измеряют против пробы, в которую вместо 108 мкл супернатанта от реакционной смеси I вносят 108 мкл смеси, предварительно собранной аналогичным образом, но без GSH (90 мкл трис-HCl-буфера с NaN₃ и ЭДТА + 10 мкл фосфатного буфера + 4 мкл раствора H₂O₂ + 20 мкл раствора трихлоруксусной кислоты). Однако, поскольку для дальнейших расчетов ферментативной активности имеет значение разница между величинами поглощения для разных проб, измерение можно проводить против дистиллированной воды.

Общий объем фотометрируемого раствора по данной методике составляет 1277 мкл, поэтому для измерения в обычной спектрофотометрической кювете с длиной оптического пути 1 см и таким же расстоянием между ее боковыми стенками применяют спектрофотометр DU-65 (Beckman Coulter, США). При работе на спектрофотометре Lambda 25 (PerkinElmer, США) рекомендовано использовать «микрокювету» с длиной оптического пути 1 см и вогнутыми боковыми стенками (расстояние между ними — 0,45 см) либо в случае обычной кюветы пропорционально увеличить объемы всех реактивов (например, в 2 раза).

Убыль GSH в реакционной смеси I рассчитывают по разнице величин поглощения при 412 нм в реакционных смесях II. Для этого используют коэффициент миллимолярного поглощения продукта реакции GSH c реактивом Эллмана при 412 нм (14,15 мМ^–1 см^–1) [10] и разведения реакционной смеси. Реактив А с 0,64 мМ GSH (90 мкл) разбавляется до полностью собранной реакционной смеси (104 мкл) в 1,15(5) раза до концентрации GSH, равной 0,55385 мМ (то есть рабочей концентрации GSH), и затем при добавлении трихлоруксусной кислоты (до общего объема смеси 124 мкл) — в 1,1923 раза. Затем супернатант разводится реакционной смесью II в 11,824 раза (1277 мкл/108 мкл). Общее разведение реакционной смеси I составляет (124/104)(1277/108) = 14,09793, что приблизительно равно коэффициенту миллимолярного поглощения продукта реакции GSH c реактивом Эллмана. На 1 ммоль GSH образуется 1 ммоль окрашенного продукта. Соответственно, 1 единица поглощения (1,000) реакционной смеси II при 412 нм соответствует приблизительно 1 мМ GSH (точно — 0,9963201 мМ GSH) в реакционной смеси I. Применяемой в настоящем исследовании рабочей концентрации GSH в реакционной смеси I соответствует оптическая плотность реакционной смеси II, равная 0,556. Таким образом, арифметические действия со значениями оптических плотностей при 412 нм для разных проб будут хорошо отражать изменения концентраций GSH в реакционной смеси I.

Ферментативную активность рассчитывают по формуле, основанной на определении убыли концентрации GSH в разных процессах, протекающих в ходе аналитической процедуры:

ΔA_GPx = [(A_ST – A_SUM) – (A_ST – A_NEO) – (A_ST – A_Х)] · 1,5,

где ΔA_GPx — разность поглощений при 412 нм и численно равная ей убыль концентрации GSH в ферментативном окислении за 1 мин, выраженная в мМ (мкмоль/мл).

Таким образом, из суммарной убыли GSH (A_ST – A_SUM) вычитают убыль в неферментативной реакции (A_ST – A_NEO) и убыль при окислении глутатиона биоматериалом без участия GPx (A_ST – A_Х). Разность в последней части формулы (A_ST – A_Х) может иметь отрицательный знак, если биоматериал не окисляет GSH без участия GPx, а, напротив, содержит добавочное количество свободных сульфгидрильных групп. Коэффициент 1,5 служит для выражения активности за 1 мин (60 с / 40 с).

Концентрацию белка в супернатанте гомогенатов в настоящей работе определяли по упрощенной турбидиметрической процедуре [11] с помощью нескольких различающихся разведений одного и того же биоматериала. В качестве стандарта использовали раствор сывороточного альбумина человека (Cormay, Польша). Концентрацию белка в реакционной смеси вычисляли с учетом разведения биоматериала реакционной смесью (104 мкл/10 мкл). Для расчета удельной активности GPx (в микромолях GSH в минуту на 1 мг белка) убыль концентрации GSH в ферментативном окислении за 1 мин (мкмоль/мин/мл) делили на значение концентрации белка в реакционной смеси (мг/мл).

Пропорциональность скорости реакции содержанию биоматериала в реакционной смеси оценивали с помощью коэффициента детерминации (R²), для оценки корреляции между удельной активностью GPx и массой биоматериала применяли ранговый коэффициент корреляции Спирмена (rho). Расчеты выполняли в программной среде R (версия 3.4.0) [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При хирургически индуцированном эндометриозе у крыс в гетеротопиях обнаруживается высокий, хорошо определяемый уровень глутатионпероксидазной активности. Диапазон значений удельной активности Gpx составил 2,43–6,45 мкмоль GSH, израсходованного в ферментативной реакции, в пересчете на 1 мин и на 1 мг белка (n = 7).

Скорость ферментативной реакции (после вычета скорости неферментативного окисления GSH пероксидом и скорости окисления глутатиона биоматериалом без участия GPx и пероксида) для одних и тех же гетеротопий пропорциональна содержанию их белка в реакционной смеси. Показатель линейности этой зависимости (R²) для пяти отдельных очагов варьировал в пределах от 0,9943 до 1, что соответствует высокой и очень высокой степени линейности. В случае одного и того же образца это означает, что удельные активности, определяемые при разных концентрациях белка, будут идентичны. Это указывает на то, что сравнение величин удельной активности фермента, полученных при разных концентрациях белка для разных образцов ткани, является корректным.

Вклад неферментативного окисления GSH пероксидом (A_ST – A_NEO) в общую реакцию при концентрациях белка в реакционной смеси, равных 57–125 мкг/мл, составил всего 12–16 %. Вклад (A_ST – A_X) в общую реакцию близок к нулю. Таким образом, основной расход GSH в вышеописанных условиях в реакционной смеси происходит вследствие ферментативной активности GPx.

Масса растворимого белка в смоделированных эндометриоидных гетеротопиях составила 47–415 мкг. Это означает, что сформировавшиеся очаги подверглись существенно разной степени регресса у разных животных. Между удельной активностью GPx в гетеротопиях и их массой, косвенно оцененной по количеству содержащегося в них растворимого белка, выявлена статистически значимая отрицательная корреляция: rho = –0,93, p = 0,006746 (рис. 2).

 

Рис. 2. Обратная корреляция между удельной активностью глутатионпероксидазы в смоделированных эндометриоидных очагах и их массой: log (gpx) — натуральный логарифм глутатионпероксидазной активности (мкмоль/мин на 1 мг белка); log (mcg) — натуральный логарифм массы всего растворимого белка в очаге (в микрограммах), экстрагированного при гомогенизации

 

Исходя из данных, представленных на рис. 2, можно предположить, что эндометриоидным имплантам изначально свойственен определенный ненулевой уровень удельной активности GPx независимо от их размера (что вполне понятно, так как исходно это нормальная ткань эндометрия), который, однако, увеличивается в дальнейшем в случае их регресса.

Выбранный нами способ представления этих данных показывает, что, как и в случае с каталазной активностью [4], мы рассматриваем активность GPx в качестве вероятного компонента механизма регресса эндометриоидных очагов; соответственно, мы помещаем активность фермента на горизонтальную ось графика, а массу гетеротопий рассматриваем как зависимую переменную [4]. Полученный результат по оценке корреляции дает основание полагать, что очаги могут подвергаться регрессу вследствие дополнительной индукции GPx и, наоборот, рост эндометриоидного очага может быть обусловлен снижением активности GPx. В то же время авторы отдают себе отчет в том, что наличие корреляции не доказывает причинно-следственную связь — повышенная активность GPx в уменьшенных очагах может лишь отражать реакцию антиоксидантной системы на работу других, основных механизмов, обусловливающих регресс эндометриоидных образований.

В общем полученные данные согласуются с выводом, сделанном ранее другими авторами [1, 2], о вовлеченности окислительного стресса в механизм прогрессирования эндометриоза. Проверку вклада GPx в подавление окислительного стресса в эндометриоидной ткани и в регресс эндометриоидных очагов целесообразно выполнить в экспериментах с применением соединений селена, который, как известно, необходим для биосинтеза GPx и потребление которого увеличивает определяемую активность этого фермента в тканях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Информация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Информация о финансировании. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках фундаментального исследования по теме: «Разработка стратегий диагностики, терапии генитального эндометриоза и опухолей женского репродуктивного тракта» (регистрационный номер: АААА-А19-119030490009-6).

Вклад авторов. А.В. Разыграев — биохимическое исследование, статистическая обработка данных, написание статьи. Е.В. Базиян — постановка модели эндометриоза и сбор материала. Л.С. Полянских — постановка модели эндометриоза и сбор материала. М.А. Петросян — дизайн экспериментальной модели эндометриоза и ее постановка, редактирование статьи.

Об авторах

Алексей Вячеславович Разыграев

Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет; Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта,

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.v.razygraev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0544-9398
SPIN-код: 8623-7923

канд. биол. наук

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3; Санкт-Петербург

Елена Владимировна Базиян

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: waz2107gen@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7837-3315
SPIN-код: 2232-9914

MD

Россия, Санкт-Петербург

Людмила Сергеевна Полянских

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: polyanskikh-83@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9994-8341
SPIN-код: 2501-8880

MD

Россия, Санкт-Петербург

Мария Анатольевна Петросян

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта; Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова

Email: mariya@labpharm.spb.ru
ORCID iD: 0000-0001-7347-6104
SPIN-код: 5329-5420

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы