Распространенность островов патогенности PAI-A и PAI-A1 среди российских штаммов стрептококков группы В

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Длительное время стрептококков группы В (СГВ) рассматривали исключительно как возбудителей мастита у коров, но позднее стало очевидно, что данный патоген способен вызывать различные заболевания и у человека, поражая самые различные органы и ткани [1].

СГВ-инфекцию новорожденных делят на раннюю (первые шесть дней жизни) и позднюю (с седьмого дня жизни до трех месяцев). При раннем инфицировании СГВ может приводить к сепсису, пневмонии, реже к менингиту, тогда как при позднем — в основном к менингиту. Частота встречаемости СГВ-инфекций у новорожденных составляет 0,53 случая на 1000 живорожденных детей, смертность среди заболевших — 9,6 % [2, 3]. Неонатальные заболевания, вызванные СГВ, широко распространены по всему миру, а частота колонизации СГВ беременных составляет от 10 до 30 % в США, от 6,5 до 36 % в Европе, от 7,1 до 16 % в Азии, от 9,1 до 25,3 % на Среднем Востоке, от 11,9 до 31,6 % в Африке [3, 4].

У беременных и молодых матерей СГВ приводят к инвазивным (инфекции кровотока, менингит, остеомиелит и эндокардит) и неинвазивным инфекциям (бактериурия, фасциит, целлюлит, эндометрит и раневые инфекции) [4].

У взрослых СГВ могут стать причиной артрита, эндокардита, пневмонии, бактериемии, инфекций мочевыводящих путей, мягких тканей, кожи и костей. К группе риска относятся люди с ослабленным иммунитетом и пожилые [4].

В настоящее время известно 10 серотипов СГВ: Ia, Ib, II–IX. Распространенность и доминирование серотипов СГВ различается в зависимости от географического региона. Так, серотипы Ia, Ib, II, III и V преобладают среди колонизирующих штаммов в США и Европе, VI и VIII — среди беременных в Японии, IV и V — среди беременных ОАЭ и Египта соответственно. Большинство случаев менингита с поздним началом у новорожденных вызвано инвазивными штаммами III серотипа, тогда как в других случаях (не у беременных) доминируют инвазивные изоляты серотипов Ia и V. Однако недавние исследования показали, что появились как инвазивные штаммы у новорожденных и взрослых, так и колонизирующие штаммы серотипа IV. В Малайзии серотип VI был обнаружен среди доминирующих колонизирующих штаммов и является вторым наиболее распространенным изолятом у взрослых с инфекциями кожи и мягких тканей, вызванными СГВ. В Египте серотип VI — общий колонизирующий серотип у женщин. Недавно в Центральном Тайване было обнаружено распространение серотипа VI среди колонизирующих и инвазивных изолятов. В нескольких исследованиях идентифицированы спорадические штаммы серотипа VIII как среди колонизирующих, так и среди возбудителей инвазивных СГВ-заболеваний. Аналогично был выявлен серотип V в США и Европе [4].

Возбудителями 97 % инвазивных В-стрептококковых инфекций новорожденных во всех географических регионах являются СГВ пяти серотипов (Ia, Ib, II, III и V), при этом доминирует серотип III [5].

Большинство случаев заболеваний взрослых, вызванных СГВ, обусловлено СГВ серотипов V, Ia, III [6].

В связи с тем что распределение по серотипам в различных географических регионах мира отличается, ученые разрабатывают многокомпонентные вакцины, которые будут защищать от СГВ преобладающих серотипов.

В настоящее время фармацевтическая компания GlaxoSmithKline (GSK) провела фазу I/II клинических испытаний трехвалентной конъюгированной вакцины CPS-CRM197 против СГВ (серотипы Ia, Ib и III) и планирует клинические испытания пятивалентной вакцины (серотипы Ia, Ib, II, III и V) [6].

Фармацевтическая компания Pfizer также объявила о клинических испытаниях пятивалентной конъюгированной вакцины (серотипы Ia, Ib, II, III и V) для оценки безопасности толерантности и иммуногенности [6].

Быстрая адаптация СГВ к различным экологическим нишам может быть объяснена множеством факторов патогенности. Некоторые из них описаны ниже.

Белок Bac взаимодействует со следующими компонентами иммунной системы человека: Fc-фрагментом иммуноглобулина А и фактором H [7].

Липопротеин ScaAB участвует в транспорте двухвалентных металлов и в процессе адгезии [8].

Сериновая протеаза С5а-пептидаза расщепляет и инактивирует компонент С5а комплемента человека [9, 10]. Она также связывает фибронектин и способствует бактериальной инвазии в эпителиальные клетки [7].

Существует еще одна сериновая протеаза CspA, которая расщепляет внеклеточный матрикс фибронектина [11].

В состав поверхностного белка SspB1 входят á-спиральные структуры, глюкан-связывающий домен и участок заякоривания в клеточной стенке LPXTG, что позволило отнести данный белок к адгезинам. Белок SspB1a является его гомологом, их идентичность на белковом уровне составляет 72 % [12]. По данным авторов, наличие генов семейства sspB значительно не влияет на течение беременности, но может вызвать развитие внутриутробной инфекции у плода и новорожденного [13]. Данные белки могут способствовать адгезии к эпителию мочеполового тракта. Наличие генов sspB коррелирует с инфекциями в урогенитальном тракте [12].

В связи с вариабельностью серотипов в различных регионах мира невозможно создать универсальную вакцину, поэтому перешли к созданию рекомбинантных вакцин на основе поверхностных белков.

Так, в отделе молекулярной микробиологии ФГБНУ ИЭМ разработаны пятивалентная рекомбинантная и рекомбинантная химерная вакцины (на основе пяти поверхностных белков: Bac, ScaAB, SspB1, ScpB, CspA), а также живая вакцина на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 [14–16].

Многие факторы патогенности СГВ локализованы на мобильных генетических элементах, поэтому горизонтальный перенос генов может способствовать формированию новых высоковирулентных штаммов.

В начале XXI в. у СГВ было обнаружено от 14 до 15 островов патогенности [17, 18].

Среди мобильных генетических элементов СГВ были выявлены острова патогенности PAI-A и PAI-A1, содержащие гены sspB1 и sspB1a соответственно [19–21].

Частота встречаемости генов sspB1 и sspB1a, следовательно, и островов патогенности PAI-A и PAI-A1 в Санкт-Петербурге составляет 9 и 29 % соответственно [21]. Однако анализ баз данных NCBI указывает на существенно более редкую встречаемость острова PAI-A в мире. Нет информации о распространенности исследуемых островов патогенности среди СГВ различных серотипов в других регионах России. Отсутствуют и указания на существование связи между наличием данных островов патогенности в геноме и вирулентностью штаммов СГВ.

В связи с этим целью данного исследования стало определение частоты встречаемости островов патогенности PAI-A и PAI-A1 среди клинических и колонизирующих штаммов СГВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и условия культивирования

В данное исследования вошли следующие штамммы:

1. 24 штамма, выделенные в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова в 2014–2016 гг. (клинические);
2. 43 штамма, полученные из Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовского университета) в 1987–1990 гг. (колонизирующие).

Штаммы СГВ выращивали на бульоне Todd Hewitt Broth (Pronadisa, Испания) в течение ночи при 37 °С.

Полимеразная цепная реакция

ДНК из штаммов СГВ выделяли с помощью набора «Экспресс-ДНК-Био» («Алкор Био», Россия) согласно рекомендациям производителя.

Амплификацию проводили в аппарате C1000 (BioRad, США), используя двукратный мастер-микс Dream-Taq Green (Thermo Fisher Scientific, Литва) согласно рекомендациям производителя и праймеры, представленные в табл. 1.

 

Таблица 1. Праймеры, использованные для определения генов sspB1 и sspB1a

Название праймера	Последовательность праймера	Размер продукта, н. п.	Ген
sspB1971	cgt gat att acg ttt ggc aag a	1536	Поверхностного адгезина SspB1
sspB3485	cca gtt cct gaa ccg ata aaa g
sspB1aF	tgg taa tat tct ccc cct tgg	220	SspB1a
sspB1aR	ttg cca gat gaa gca gct att

 

Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали в 1 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия с использованием ×1 буфера ТАЕ. Результаты визуализировали в трансиллюминаторе VersaDoc.

Мультиплексная полимеразная цепная реакция

Для идентификации типа СГВ по характеру полисахаридной капсулы применяли мультиплексную ПЦР [22].

Статистический анализ

Значимость отличий между коллекциями оценивали с помощью точного критерия Фишера. Для этого использовали онлайн-программу на сайте https://molbiol.kirov.ru/utilites/multitool/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение серотипов у исследуемых штаммов стрептококков группы В

Для того чтобы исследовать распространенность серотипов СГВ в различных группах населения была проведена мультиплексная ПЦР на определение генов капсульного оперона с ДНК штаммов, описанных выше [22]. Серотип одного штамма из Института Кулакова и 18 штаммов из Сеченовского университета не удалось определить данным методом. В группу клинических штаммов также вошли ранее проанализированные штаммы СГВ, выделенные в НИИ акушерства и гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта (173 штамма) и в Северо-Западном государственном медицинском университете имени И.И. Мечникова (1 штамм) [21, 23]. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Частота встречаемости серотипов (%) у исследуемых штаммов стрептококков группы В

Серотипы	Колонизирующие	Клинические
Ia	23	22
Ib	7	4
II	19*	8*
III	0*	18*
IV	0*	18*
V	2	12
VI	0	0
VII	2	1
VIII	5*	0*

* обозначены статистически достоверные отличия двух групп (p < 0,05).

 

Среди колонизирующих штаммов доминируют серотипы Ia, II и Ib, тогда как среди клинических — Ia, II, III, IV и V. В обеих коллекциях были обнаружены редкие для России серотипы VII и VIII.

Таким образом, серотип Ia преобладает в обеих коллекциях, серотипы II и VIII чаще встречаются в колонизирующих штаммах, тогда как серотипы III и IV характерны только для штаммов, выделенных у беременных и новорожденных. Полученные результаты соответствуют литературным данным, согласно которым преобладающими серотипами во всех географических регионах являются Ia, Ib, II, III и V. При сравнении штаммов внутри коллекции клинических штаммов обнаружено, что серотип IV более характерен для штаммов из Санкт-Петербурга, а серотип III — для штаммов из Москвы.

Частота встречаемости островов патогенности PAI-A и PAI-A1 стрептококков группы В, ассоциированных с генами sspB1 и sspB1a

В геноме штаммов СГВ обнаружено два гомологичных острова патогенности — PAI-A и PAI-A1 [21]. Структура островов патогенности представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Структура островов патогенности PAI-A и PAI-A1 стрептококков группы В. Вертикальные линии обозначают гомологичные участки

 

С целью определения частоты встречаемости данных мобильных генетических элементов была проведена ПЦР на гены sspB1 и sspB1a, являющиеся маркерными генами описанных выше островов патогенности. Ранее было установлено, что гены sspB1 и sspB1a локализованы в геномах 9 и 29 % штаммов из Санкт-Петербурга соответственно [21]. На рис. 2 представлены результаты ПЦР с ДНК клинических штаммов на ген sspB1a.

 

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов полимеразной цепной реакции с клиническими штаммами

на ген sspB1a: 1 — штамм 2978, 2 — штамм 3093, 3 — штамм 2828, 4 — штамм 3481, 5 — штамм 3482, 6 — штамм 2698, 7 — штамм 3085, 8 — штамм 3030, 9 — положительный контроль

 

Ген sspB1 обнаружен в геномах 8 % клинических штаммов. Однако штаммы с геном sspB1 отсутствовали в штаммах из Москвы (табл. 3). Следовательно, штаммы СГВ с островом патогенности PAI-A циркулируют преимущественно в Санкт-Петербурге.

 

Таблица 3. Частота встречаемости генов sspB1 и sspB1a (%) у исследуемых штаммов стрептококков группы В

Гены	Колонизирующие	Клинические
sspB1	0	8
sspB1a	9*	30*

* обозначены статистически достоверные отличия двух групп (p < 0,05).

 

В результате ПЦР установлено, что ген sspB1a встречается в геномах 30 % клинических штаммов и 9 % — колонизирующих. Ген sspB1a чаще обнаруживается в геномах клинических штаммов в отличие от колонизирующих.

Таким образом, можно предположить, что гены семейства sspB более характерны для СГВ, колонизирующих беременных и новорожденных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Преобладающие серотипы среди клинических и колонизирующих штаммов СГВ соответствуют данным по распространенности серотипов по всему миру.

Штаммы СГВ, в геномах которых присутствует остров патогенности PAI-A, циркулируют преимущественно в Санкт-Петербурге.

Гомологичный остров патогенности PAI-A1 характеризуется большей распространенностью: частота встречаемости данного мобильного генетического элемента в 3 раза выше в клинических штаммах СГВ по сравнению с колонизирующими штаммами.

Более высокая распространенность генов семейства sspB среди геномов клинических штаммов имеет огромное значение, так как белок SspB1 входит в состав вакцины против СГВ. В связи с тем что гомология белков SspB1 и SspB1а составляет 72 %, возможно, вакцина будет действовать и на штаммы с геном sspB1a.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.

Источник финансирования. Данное исследование было поддержано за счет бюджетных средств ФГБНУ «ИЭМ» (шифр 0557-2019-0002, регистрационный номер НИОКТР АААА-А19-119022290066-6).

Об авторах

Евгения Владимировна Кулешевич

Институт экспериментальной медицины

Email: k-zh-v@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3180-6491

кандидат биологических наук

Россия, Санкт-Петербург

Юрий Юрьевич Ильясов

Институт экспериментальной медицины

Email: kolpino@hotmail.com
SPIN-код: 2204-1677
Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Сергеевич Линник

Институт экспериментальной медицины

Email: linnikdm@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8046-9743
Россия, Санкт-Петербург

Анастасия Алексеевна Мальченкова

Институт экспериментальной медицины

Email: nastya.malchenkova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2201-0472
SPIN-код: 8957-5056
Россия, Санкт-Петербург

Ольга Николаевна Аржанова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: arjanova_olga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3059-9811

доктор медицинских наук, профессор, засл. врач РФ, ведущий научный сотрудник отдела акушерства и перинаталогии, профессор кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3; 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7–9

Николай Иванович Брико

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Email: nbrico@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6446-2744
SPIN-код: 2992-6915

доктор медицинских наук, профессор, засл. деят. науки РФ, академик РАН

Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2

Екатерина Владимировна Глушкова

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Email: ekaterina-1801@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6997-7598
SPIN-код: 2336-3176

кандидат медицинских наук

Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 2

Татьяна Валерьевна Припутневич

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова

Email: priput1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4126-9730
SPIN-код: 8383-7023

доктор медицинских наук, зав. отделением микробиологии и клин. фармакологии

Россия, 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

Александр Николаевич Суворов

Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: alexander_suvorov1@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2312-5589
SPIN-код: 8062-5281

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий отделом молекулярной микробиологии

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы