俄罗斯B组链球菌毒力岛PAI-A和PAI-A1的流行率

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论证

长期以来，B族链球菌(GBS)被认为是奶牛乳腺炎的唯一病原体，但后来人们发现，这种病原体可引起人类多种疾病，影响多种器官和组织[1]。

GBS感染或的新生儿分为早期（生命的前六天） 和晚期（从生命的第七天到三个月）。对于早期感染，GBS可导致败血症、肺炎，脑膜炎较少见，而晚期感染可导致脑膜炎。GBS感染的新 生儿发生率为0.53例/1000活产，患病者死亡率为9.6%[2，3]。GBS引起的新生儿疾病在世界范围内广泛存在，孕妇GBS定植发生率在美国从10%到30%不等，在欧洲从6.5%到36%不等，在亚洲从7.1%到16%不等，从9.1起中东为25.3%，非洲为11.9%至31.6%[3，4]。

孕妇和年轻母亲中，GBS会导致侵袭性（血流感染、脑膜炎、骨髓炎和心内膜炎）和非侵袭性感染（菌尿、筋膜炎、蜂窝织炎、子宫内膜炎和伤口感染）[4]。

成人中GBS可引起关节炎、心内膜炎、肺炎、细菌、泌尿道、软组织、皮肤和骨骼感染。风险人群包括免疫力低下的人群和老年人[4]。

目前，已知10种GBS血清型：Ia、Ib、II–IX。GBS血清型的流行和优势因地理区域而异。因此，血清型Ia、Ib、II、III和V在美国和欧洲的定殖菌株中占优势，VI和VIII - 在日本的孕妇中，IV和V - 在阿联酋和埃及的孕妇中分别占优势。新生儿迟发性脑膜炎的大多数病例是由侵袭性血清型III菌株引起的，而在其他情况下（非孕妇），Ia和V血清型的侵袭性分离株占优势。然而，最近的研究表明，在新生儿和成人中都出现了侵入性菌株，以及IV血清型的定植菌株。马来西亚，在主要定植菌株中发现了VI血清型，它是成人中第二大最常见的由GBS引起的皮肤和软组织感染的分离株。在埃及血清型VI是女性常见的定植血清型。最近在台湾中部，在定殖和侵入性分离株中发现了VI血清型的传播。几项研究已经在定植和侵袭性GBS疾病的病原体中鉴定了散发的VIII血清型菌株。美国和欧洲也发现了类似的V血清型[4]。

所有地理区域97%的新生儿侵袭性B链球菌感染的病原体是五种血清型（Ia、Ib、II、III和V） 的GBS，其中血清型III占主导地位[5]。

大多数由GBS引起的成人疾病病例是由GBS血清型V、Ia、III引起的[6]。

由于血清型在世界不同地理区域的分布不同，科学家正在开发多组分疫苗，以预防主要血清型的GBS。

制药公司葛兰素史克（GlaxoSmithKline，GSK）已完成针对GBS（血清型Ia、Ib和III）的CPS-CRM197三价结合疫苗的I/II期临床试验，并正在计划对五价疫苗（血清型Ia、Ib、II、III和V)[6]。

制药公司辉瑞(Pfizer)还宣布了一项五价结合疫苗（血清型Ia、Ib、II、III和V）的临床试验，以评估耐受性和免疫原性的安全性[6]。

GBS对各种生态位的快速适应可以用许多致病因素来解释。其中一些描述如下。

Bac蛋白与人体免疫系统的以下成分相互作用：免疫球蛋白A的Fc片段和因子H[7]。

ScaAB脂蛋白参与二价金属的运输和粘附过程[8]。

丝氨酸蛋白酶C5a-肽酶裂解，并灭活人类补体的C5a成分[9，10]。它还结合纤连蛋白并促进细菌入侵上皮细胞[7]。

还有另一种丝氨酸蛋白酶CspA，可裂解纤连蛋白的细胞外基质[11]。

表面蛋白SspB1包括α螺旋结构、葡聚糖结合域和LPXTG细胞壁中的锚定位点，这使得将该蛋白归类为粘附素成为可能。SspB1a蛋白是其同源物；它们在蛋白质水平上的同一性为72%[12]。作者认为sspB家族基因的存在不会显着影响妊娠过程，但会导致胎儿和新生儿发生宫内感染[13]。这些蛋白质可以促进对泌尿生殖道上皮的粘附。SspB基因的存在与泌尿生殖道感染相关[12]。

由于世界不同地区血清型的变异性，不可能研制出通用疫苗，因此我们转而研制基于表面蛋白的重组疫苗。

因此，在分子微生物学系，Institute of Expe­rimental Medicine，开发了五价重组和重组嵌合疫苗（基于五种表面蛋白：Bac、ScaAB、SspB1、 ScpB、CspA），以及基于益生菌菌株屎肠球菌L3的活疫苗[14-16]。

GBS的许多致病因素都集中在可移动的遗传元件上；因此，水平基因转移有助于形成新的高毒株。二十一世纪初在GBS中发现了14到15个致病岛[17，18]。

GBS的移动遗传元件中鉴定了分别含有sspB1和sspB1a基因的致病岛PAI-A和PAI-A1[19-21]。

SspB1和sspB1a基因以及因此圣彼得堡的致病岛PAI-A和PAI-A1的出现频率分别为9%和29%[21]。然而，对NCBI数据库的分析表明，世界上PAI-A岛的出现要少得多。俄罗斯的其他地区没有关于所研究的各种血清型GBS致病性岛屿流行情况的信息GBS菌株的基因组和毒力没有迹象表明这些致病岛的存在之间存在联系。

这方面本研究的目的是确定致病岛PAI-A和PAI-A1在GBS的临床和定植菌株中出现的频率。

材料与方法

细菌菌株和栽培条件

该研究包括以下菌株：

1. 2014-2016年在库拉科夫国家妇产科和围产期医学研究中心（临床）分离出24菌株；
2. 1987-1990年（定植）在谢切诺夫大学43菌株。

37°C的夜晚在Todd Hewitt肉汤（Pronadisa，西班牙）上生长了菌株。

聚合酶链反应

根据制造商的建议，使用“Express DNA Bio”（“Express DNA Bio”）（“Express DNA Bio”）分离来自GBS菌株的DNA。

根据制造商的建议和底漆扩增进行在设备C1000（Biorad，United States）中使用双重主混合梦想 - Taq Green （Thermo Fisher Science，立陶宛）表示1。

 

表1 用于定义sspB1和sspB1a基因的引物

引物名称	序列引物	产品尺寸，bp	基因
sspB1971	cgt gat att acg ttt ggc aag a	1536	表面粘合剂 SspB1
sspB3485	cca gtt cct gaa ccg ata aaa g
sspB1aF	tgg taa tat tct ccc cct tgg	220	SspB1a
sspB1aR	ttg cca gat gaa gca gct att

 

在1％琼脂糖凝胶中评价聚合酶链反应（PCR）的结果，并使用×1缓冲液加入溴化乙锭。结果在VerseDoc旋晶铝器中可视化。

多重聚合酶链反应

为了鉴定多糖胶囊性质中GBS的类型，使用多重PCR[22]。

统计分析

使用精确的菲舍尔检验评估收集之间的差异的重要性。为此，在网站上使用在线程序https://molbiol.kirov.ru/utilites/multitool/。

结果与讨论

B组链球菌的研究菌株测定血清型

为了研究不同人群中GBS血清型的发生率，对菌株DNA胶囊蛋白基因进行了多路PCR检测，上述[22]。来自库拉科夫大学的一种菌株的血清型和谢切诺夫大学的18株无法通过这种方法确定。该组临床菌株还包括先前分析的GBS菌株，就在妇产科研究所和生殖病学研究所D.O. Ott（173株）标出和在西北I.I. Mechnikov国家医科大学（1株）[21，23]。数据如表2所示。

 

表2 B组链球菌研究菌株血清型出现频率（%）

血清型	殖民地	临床的
Ia	23	22
Ib	7	4
II	19*	8*
III	0*	18*
IV	0*	18*
V	2	12
VI	0	0
VII	2	1
VIII	5*	0*

* 表明两组之间存在统计学显著差异（p<0.05）。

 

定植菌株中血清型Ia、II和Ib占主导地位，而在临床菌株中 - Ia、II、III、IV和V。这两个收藏品中都发现了俄罗斯罕见的血清型VII和VIII。

因此，血清型Ia在两个集合中占主导地位，血清型II和VIII在定植菌株中更常见，而血清型III和IV仅对从孕妇和新生儿分离的菌株具有特征。获得的结果与文献数据一致，根据文献数据，所有地理区域的主要血清型为Ia、Ib、II、III和V。当比较临床菌株集合中的菌株时，发现来自圣彼得堡的菌株的血清型IV更为典型，来自莫斯科的菌株的血清型III更为典型。

sspB1和sspB1a基因相关的B组链球菌致病性PAI-A和PAI-A1岛的出现频率

在GBS菌株的基因组中发现了两个致病性同源岛PAI-A和PAI-A1[21]。致病岛的结构如图所示。

 

图1 B组链球菌致病岛PAI-A和PAI-A1的结构。垂直线表示同源区域

 

为了确定这些移动遗传元件的发生频率， 对sspB1和sspB1a基因进行了PCR，它们是上述致病岛的标记基因。此前发现sspB1和sspB1a基因分别位于圣彼得堡9%和29%菌株的基因组中[21]。图2显示了sspB1a基因临床菌株DNA的PCR结果。

 

图2 SspB1a：基因临床菌株聚合酶链反应产物的电泳图谱：1 - 菌株2978、2 - 菌株3093、3 - 菌株2828、 4 - 菌株3481、5 - 菌株3482、6 - 菌株2698、7 - 菌株3085、 8 - 菌株3030、9 - 阳性对照

 

8%的临床菌株的基因组中发现sspB1基因。然而，莫斯科的菌株中没有sspB1基因的菌株 （表3）。因此，具有致病性PAI-A岛的GBS菌株主要在圣彼得堡传播。

 

表3 组链球菌B研究菌株中sspB1和sspB1a基因的出现频率（%）

基因	殖民地	临床的
sspB1	0	8
sspB1a	9*	30*

* 表明两组之间存在统计学显著差异（p<0.05）。

 

PCR结果发现30%的临床菌株和9%的定植菌株的基因组中存在sspB1a基因。sspB1a基因更常见于临床菌株的基因组中。

因此，可以假设sspB家族的基因更具GBS定植孕妇和新生儿的特征。

结论

GBS临床株和定植株的主要血清型与世界各地的血清型流行数据一致。

基因组中带有PAI-A致病岛的GBS菌株主要在圣彼得堡传播。

同源致病岛PAI-A1的特点是发病率较高：与定植菌株相比，临床GBS菌株中该移动遗传元件的出现频率高3倍。

sspB家族基因在临床菌株基因组中的较高流行率非常重要，因为SspB1蛋白包含在GBS疫苗中。由于SspB1和SspB1a蛋白质的同源性为72%，因此疫苗可能作用于具有SspB1a基因的菌株。

附加信息

利益冲突。作者声明他们在编写本文时没有任何利益冲突。

资金来源。本研究得到了联邦州预算科学研究所“Insti­tute of Experimental Medicine”（代码0557-20190002， 注册号R&D AAAA-A19-119022290066-6）预算资金的支持。

作者简介

Evgenia Kuleshevich

Institute of Experimental Medicine

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ORCID iD: 0000-0002-3180-6491

Cand. Sci. (Biol.)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Yury Ilyasov

Institute of Experimental Medicine

Email: kolpino@hotmail.com
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俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Dmitry Linnik

Institute of Experimental Medicine

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俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Anastasia Malchenkova

Institute of Experimental Medicine

Email: nastya.malchenkova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2201-0472
SPIN 代码: 8957-5056
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Olga Arzhanova

Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott,
Saint Petersburg State University

Email: arjanova_olga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3059-9811

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Honored Doctor of the Russian Federation, Leading Researcher. The Department of Obstetrics and Perinatology; Professor. The Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Medical Faculty

俄罗斯联邦, 3 Mendeleevskaya Line, Saint Petersburg, 199034; 7-9 Universitetskaya emb., St. Petersburg, 199034

Nikolay Briko

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: nbrico@mail.ru
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MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Honored Scientist of the Russian Federation, Academician of the Russian Academy of Sciences

俄罗斯联邦, 8-2 Trubetskaya str., Moscow, 119991

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I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

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MD, Cand. Sci. (Med.)

俄罗斯联邦, 8-2 Trubetskaya str., Moscow, 119991

Tatyana Priputnevich

National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov

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Alexander Suvorov

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg State University

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MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences

俄罗斯联邦, Saint Petersburg; Saint Petersburg

参考

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