Особенности регуляции функциональной активности периферических В-лимфоцитов у беременных с привычным невынашиванием беременности в анамнезе

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Невынашивание беременности до настоящего времени остается актуальной проблемой. Частота этого осложнения варьирует от 10 до 25 % [1]. При этом существует около 2–5 % супружеских пар, в котoрых потери беременности происходят неоднократно — это явление называется привычным невынашиванием беременности [2]. В последние годы внимание ученых привлекают иммунологические аспекты привычного невынашивания беременности, которые выявляют в различных звеньях иммунной системы и занимают первое место в этиологии необъяснимых репродуктивных потерь [3]. В-лимфоциты играют важную роль во время неосложненной беременности посредством реакций гуморального иммунитета и выработки антител. В то же время В-клетки могут вызывать различные акушерские осложнения, такие как самопроизвольный выкидыш, преэклампсия, задержка внутриутробного развития плода, мертворождение и преждевременные роды вследствие выработки аутоантител [4].

К 13-му члену суперсемейства факторов некроза опухоли (TNFSF) относятся два растворимых лиганда, котoрые участвуют в развитии B-лимфоцитов, BAFF (фактор активации B-клеток, или TNFSF13B) и APRIL (лиганд, индуцирующий пролиферацию, или TNFSF13). Эти два лиганда передают сигнал через три рецептора: специфичный рецептор BAFF (BAFF-R) и рецепторы, распознающие как BAFF, так и APRIL, — TACI (трансмембранный активатор-1 и модулятор кальция и лиганд циклофилина, взаимодействующий с CD267) и BCMA (антиген созревания В-клеток, CD269) [5].

Все три рецептора BAFF экспрессируются преимущественно на В-лимфоцитах, тогда как TACI присутствует как на В-клетках, так и на активированных Т-лимфоцитах. BAFF-R также может быть обнаружен на регуляторных и активированных Т-лимфоцитах. Связываясь с этими рецепторами, BAFF опосредует активацию канонического ядерного фактора каппа — усилителя легкoй цепи активированных В-клеток (NF-êB), неканонического NF-êB, N-концевой киназы c-Jun (JNK), внеклеточного сигнала регулируемой киназы (ERK) и фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) — протеинкиназы B (Akt) передачи сигналов [5].

После связывания с BAFF-R, BAFF активирует Akt и киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (Erk), в зависимости от IêB-киназы (IKK) -1 в первичных B-клетках, тем самым способствуя выживанию B-клеток [6], а также влияет на физиологическую активацию Т-клеток посредством активации сигнального пути PI3K–Akt, который отражает один из патологических механизмов аутоиммунных заболеваний, опосредованных Т-лимфоцитами [5].

BAFF поддерживает гомеостаз B-клеточного звена иммунитета, действуя как фактор выживания и адаптации для B-лимфоцитов, начиная с переходной стадии развития, в то время как APRIL действует на более поздней стадии, модулируя функцию и выживаемость B-клеток после контакта с антигеном, а также участвует в создании и выживании долгоживущих плазматических клеток в костном мозге [7]. Оба цитокина способствуют формированию гуморальных эффекторных механизмов.

Повышенные уровни BAFF и APRIL в сыворотке крови ассоциированы с аутоиммунными заболеваниями и коррелируют с их тяжестью и уровнями патогенных аутоантител [7] Так, повышенный уровень BAFF и APRIL отмечен у пациентов с такими аутоиммунными заболеваниями, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет [8], системная склеродермия и др. [9].

В настоящее время представлены лишь единичные данные о содержании BAFF при рецидивирующей потере беременности: у пациенток с повторным самопроизвольным выкидышем его уровень в децидуальной оболочке и трофобласте был существенно снижен по сравнению со здоровыми беременными [10]. Показано, что при беременности, осложненной задержкой роста плода, сывороточный уровень BAFF также был снижен [11]. Литературные данные о содержании APRIL при беременности в настоящее время отсутствуют.

Цель работы — выявить особенности регуляции функциональной активности периферических В-лимфоцитов у женщин в 5–12 недель беременности с угрожающим самопроизвольным выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На базе НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова обследованы 88 женщин в возрасте 18–40 лет на сроке 5–12 недель беременности. Основную группу составили 36 пациенток с угрожающим самопроизвольным выкидышем на момент обследования и привычным невынашиванием беременности в анамнезе, в контрольную группу вошли 28 женщин с неосложненным течением беременности, в группу сравнения — 24 первобеременные пациентки с угрожающим самопроизвольным выкидышем на момент обследования. Критерии исключения из исследования: хромосомные перестройки кариотипов супругов, установленные на прегравидарном этапе, аутоиммунные заболевания, тяжелые аллергические реакции, обострение хронических заболеваний и острые воспалительные заболевания, тяжелая экстрагенитальная патология. Материалом исследования служила периферическая венозная кровь, забор которой производили при поступлении в стационар до начала сохраняющей терапии. В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяли содержание BAFF и APRIL, методом проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител — содержание CD19⁺BAFFR⁺ В-лимфоцитов в лимфоцитарном гейте.

Концентрированную популяцию CD19⁺ В-лимфоцитов получали методом прямой магнитной сепарации с использованием магнитных частиц DETACHABEAD CD19 (Invitrogen). Из CD19⁺ В-лимфоцитов выделяли тотальную РНК стандартным феноловым методом, затем РНК переводили в комплементарную ДНК с помощью коммерческого набора производства ООО «Фрактал Био» (Санкт-Петербург, Россия). В полученных образцах определяли уровень экспрессии мРНК Akt методом обратно-транскрипционной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Все результаты по экспрессии изучаемых генов представлены как нормализованное относительно уровня экспрессии мРНК гена домашнего хозяйства (â₂-микроглобулин) количество копий пар специфического гена в образце ×10⁴/мкл.

Все обследуемые подписывали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено на заседании локального этического комитета ФГБОУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» от 21.11.2018.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи прикладных лицензионных программ: Microsoft Office 2010, Statistica for Windows 13.0. Данные на нормальность распределения проверяли с применением критериев Колмогорова и Шапиро – Уилка. Количественное описание величин производили в виде средней величины и стандартной ошибки средней (М±m). Статистически значимые различия оценивали по критерию Стьюдента и Мана – Уитни, различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследуемые женщины были сопоставимы по возрасту, экстрагенитальной патологии, становлению менструальной функции. Женщины с угрожающим самопроизвольным выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе в структуре экстрагенитальной патологии чаще имели заболевания щитовидной железы и анемию, а также состояли в браке с супругом более старшего возраста (p < 0,05) по сравнению с остальными обследуемыми. При анализе детских заболеваний оперативных (экстрагенитальных и генитальных) вмешательств, аллергических реакций в анамнезе среди женщин обследуемых групп значимые различия выявлены не были. У женщин основной группы по сравнению с остальными обследованными в анамнезе чаще отмечены хронический эндометрит, инфекции, передаваемые половым путем, выскабливания полости матки, неразвивающиеся беременности, самопроизвольные выкидыши (p < 0,05) во всех случаях. У женщин с угрожающим спорадическим выкидышем в анамнезе чаще наблюдалось первичное и вторичное бесплодие по сравнению с остальными обследуемыми. Клинические проявления угрожающего самопроизвольного выкидыша были более выражены у первобеременных с угрожающим самопроизвольным выкидышем: частота кровянистых выделений среди обследуемых основной группы составила 8,5 %, а группы сравнения — 70,8 % (p < 0,05). При этом признаки отслойки плодного яйца по данным ультразвукового исследования органов малого таза встречались в 18,2 % случаев в основной группе и в 50 % в группе сравнения. Расширение внутреннего зева цервикального канала зафиксировано только среди женщин группы сравнения (13,04 % случаев).

 

Таблица. Характеристика показателей функциональной активности В-лимфоцитов у женщин с угрожающим самопроизвольным выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе

Показатель	Контрольная группа (n=28)	Основная группа (n=36)	Группа сравнения (n=24)
BAFF-R, %	95,3±0,5	97,89±0,30 p1 = 0,0001	95,41±0,94 р2 = 0,02
BAFF, нг/мл	1,5±0,1	1,3±0,05 p1 = 0,03	1,9±0,21 р2 = 0,01
APRIL	1,2±0,8	0,34±0,06	0,31±0,43
мРНК Akt	0,10±0,06	1,39±0,92 р1 < 0,05	0,24±0,06 р2 < 0,05

Примечание: p₁ — уровень статистической значимости различий между основной и контрольной группами; р₂ — уровень статистической значимости различий между группой сравнения и контрольной группой.

 

Анализ данных иммунологического обследования показал, что у женщин с угрожающим самопроизвольным выкидышем на момент обследования и привычным невынашиванием беременности в анамнезе увеличено содержание рецепторов к BAFF на периферических CD19⁺ В-лимфоцитах по сравнению с пациентками контрольной группы и первобеременными с угрозой прерывания (см. табл.). Сывороточный уровень BAFF, напротив, оказался ниже у пациенток основной группы по сравнению со здоровыми беременными и первобеременными с угрожающим спорадическим выкидышем. Разница в сывороточной концентрации BAFF между группой сравнения и контрольной группой была статистически значимой. Значимых различий в содержании APRIL в периферической крови в исследуемых группах выявлено не было, но наблюдалась выраженная тенденция к снижению уровня APRIL у пациенток основной группы и группы сравнения относительно показателя здоровых беременных во всех случаях.

При анализе экспрессии мРНК Akt в периферических CD19⁺ В-лимфоцитах установлено, что для женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе и угрожающим самопроизвольным выкидышем на момент обследования характерно повышение его уровня по сравнению со здоровыми беременными и первобеременными пациентками с угрозой прерывания беременности.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее время появились единичные данные, что В-лимфоциты могут играть непосредственную роль в патогенезе привычного невынашивания [12]. Способствуя выживанию и созреванию В-клеток, BAFF активно участвует в гомеостазе всего пула В-лимфоцитов в физиологических условиях. В то же время представлены данные, что повышенная активация В-клеток ведет к избыточному образованию плазматических клеток и потенцированию гуморальных реакций, что может способствовать развитию аутоиммунных заболеваний [13]. Кроме того, взаимодействие BAFF/BAFF-R активирует сигнальный путь PI3K-Akt, что обусловливает повышение жизнеспособности и активации Т-лимфоцитов, которые, как было доказано, непосредственно вовлечены в механизмы развития привычного невынашивания. Таким образом, BAFF не только задействован в поддержании гомеостаза В-клеточного звена иммунитета, но и является важным фактором патогенеза привычного невынашивания беременности.

Повышенный уровень BAFF-R у женщин с угрожающим самопроизвольным выкидышем и привычным невынашиванием беременности может отражать усиленную готовность к дифференцировке В-лимфоцитов, а одновременное снижение сывороточной концентрации BAFF может свидетельствовать либо об ускоренном связывании лиганда с рецептором, либо о нарушении гомеостаза как В-, так и Т-клеточного звена иммунитета. Снижение сывороточного уровня APRIL у женщин с угрожающей потерей беременности (как у первобеременных, так и в группе привычного невынашивания), вероятно, указывает на пониженную выживаемость зрелых высокоэффекторных форм В-лимфоцитов.

Путь PI3K/AKT в последнее время привлекает к себе все большее внимание исследователей, поскольку он играет решающую роль в регуляции различных клеточных функций, включая метаболизм, рост, пролиферацию, выживание, транскрипцию и синтез белка. [14]. Известно, что благополучная беременность ассоциирована с достаточным уровнем релаксина, вырабатываемом желтым телом, маткой, децидуальной тканью, плацентой. Недостаток данного гормона связан с угрозой прерывания как первой, так и повторной беременности за счет некроза и апоптоза цитотрофобласта [15]. Повышенная экспрессия мРНК Akt в периферических CD19⁺ В-лимфоцитах у женщин с привычным невынашиванием беременности, зарегистрированная нами, может являться отражением усиления функциональной активности В-клеток, связанной с реакцией на плодовые антигены, попадающие в кровоток матери. Схожие, однако, менее выраженные изменения происходили и при угрожающем выкидыше у первобеременных.

В то же время при нормальной беременности описана гормонально обусловленная В-клеточная лимфопения, сопровождающаяся меньшим количеством BAFFR и, соответственно, повышенным уровнем циркулирующего BAFF, необходимого для дифференцировки незрелых переходные В-клеток в наивные зрелые [16]. По нашим данным, у женщин с угрожающим самопроизвольным спорадическим и привычным выкидышем отмечались В-клеточный лимфоцитоз наряду с выраженным снижением доли зрелых наивных В-лимфоцитов, что может отражать повышенную экспрессию BAFFR и сниженную сывороточную концентрацию BAFF. Зрелые наивные В-клетки дают начало высокоэффекторным субпопуляциям, клеткам памяти и плазматическим клеткам. Возможный дефицит плазмоцитов как основных продуцентов антител может быть обусловлен в том числе и дефицитом APRIL и, вероятно, приводит к недостаточному обеспечению иммунной толерантности материнского организма в ответ на полуаллогенный плод.

Таким образом, угрожающий привычный выкидыш у женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе ассоциирован с нарушением регулирующего влияния BAFF и APRIL, что выражается в изменении В-клеточного гомеостаза и ослаблении регуляции гуморальных эффекторных механизмов.

Об авторах

Анна Ивановна Малышкина

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова

Email: anna_im@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1145-0563

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Иваново, ул. Победы, д. 20

Наталья Юрьевна Сотникова

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова

Email: niimid.immune@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0608-0692

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Иваново, ул. Победы, д. 20

Дмитрий Николаевич Воронин

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова

Email: niimid.immune@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2836-8694

кандидат биологических наук

Россия, Иваново, ул. Победы, д. 20

Алена Валерьевна Куст

Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова

Автор, ответственный за переписку.
Email: avkMD@yandex.ru
Россия, Иваново, ул. Победы, д. 20

Список литературы

Дополнительные файлы