Анализ полиморфизма гена рецептора витамина D (VDR) у женщин с наружным генитальным эндометриозом, сахарным диабетом 1-го типа и в популяции

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Термин «витамин D» объединяет группу сходных по химическому строению веществ. Современные исследования показали, что витамин D не только имеет большое значение для нормального развития и функционирования костной ткани, но и является гормоном, который вызывает различные изменения во многих тканях и органах. Активная гормональная форма витамина D — кальцитриол [1,25(ОН)₂D, 1,25-дигидроксивитамин D, 1,25-дигидроксивитамин D₃] образуется в результате двух последовательных реакций гидроксилирования, связывается со специфическими рецепторами витамина D (VDR) и оказывает разнообразные биологические эффекты, в том числе гипотензивный, липолитический, нормогликемический, анаболический, антидепрессивный, анальгетический, противовоспалительный, иммуномодулирующий, антипролиферативный, а также регулирует апоптоз и ангиогенез. Данные эффекты классифицируют как «неклассические». Рецептор витамина D кодируется геном рецептора витамина D (VDR), который имеет несколько полиморфных вариантов. Наиболее значимыми и исследованными полиморфными вариантами гена рецептора витамина D (VDR), ассоциированными с развитием ряда заболеваний, являются rs1544410 (BsmI), rs2228570 (FokI), rs731236 (TaqI), rs7975232 (ApaI) [1] (см. рисунок).

 

Рисунок. Полиморфные варианты и структура гена VDR: FokI, BsmI, ApaI, TaqI — сайты для узнавания соответствующих рестриктаз

 

Генитальный эндометриоз встречается у 10 % женщин репродуктивного возраста во всем мире. Наиболее распространенные проявления данного заболевания — болевой синдром и бесплодие. В среднем задержка с постановкой диагноза у больных наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) составляет около 8–10 лет [2]. Проблема поздней диагностики НГЭ главным образом связна с многообразием клинических проявлений, отсутствием неинвазивных высокоспецифических маркеров, определяющих наличие или отсутствие заболевания, а также необходимостью интраоперационного и морфологического подтверждения данного диагноза. Известно, что причиной развития НГЭ являются не мутации единичных генов, а, скорее, неблагоприятные сочетания аллельных вариантов нескольких разных генов (генная сеть), контролирующих процессы морфогенеза эндометрия, что характерно для мультифакторных заболеваний [3]. Предполагают, что именно за счет своих неклассических эффектов колекальциферол может непосредственно влиять на патогенез НГЭ и применяться в качестве медикаментозной терапии данного заболевания. Ряд работ как in vitro, так и на основании экспериментальных моделей на животных демонстрирует положительное влияние колекальциферола на эндометриоидные очаги [4–7]. Данные относительно влияния колекальциферола на болевой синдром, стабилизацию психоэмоционального фона и улучшение фертильности носят противоречивый характер [8–11].

Эпидемиологические данные свидетельствуют о вовлечении дефицита витамина D в патогенез СД 1-го типа. Полиморфизмы в генах, важных для метаболизма витамина D, также модулируют и риск развития СД 1-го типа. J. Cooper и соавт. выявили зависимость между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) rs10741657 и rs12794714 в гене CYP2R1 и риском развития СД 1-го типа [12]. В исследовании случай – контроль в Великобритании, участниками которого стали 7854 пациента с СД 1-го типа и 8758 здоровых людей, была выявлена связь между двумя однонуклеотидными полиморфизмами (rs10877012 и rs4646536) в гене CYPB1, кодирующими 1á-гидроксилазу витамина D и СД 1-го типа [13]. Было обнаружено, что GG-генотип CYP2R1 (SNP rs10741657) или СС-генотип CYP27B1 (SNP rs10877012) повышают риск развития СД 1-го типа [14]. У людей с сочетанием двух данных генотипов риск развития СД 1-го типа был значительно выше, чем у лиц только с одним генотипом, что указывает на потенциальный синергизм между GG-генотипом CYP2R1 и СС-генотипом CYP27B1 при определении риска СД 1-го типа. Уровень витамина D (25(ОН)D) в сыворотке крови был значительно ниже у людей с GG-генотипом CYP2R1 и CC-генотипом CYP27B1 по сравнению с уровнем у лиц с генотипами CYP2R1 AA и CYP27B1 AA. Высказано предположение о потенциальной роли полиморфизмов гена VDR в патогенезе СД 1-го типа.

Крупное исследование TEDDY было проведено в 6 штатах США и в 5 странах Европы в период c 2004 по 2010 г. [15]. Обследовано 424 788 новорожденных. В исследование было включены 8676 детей с повышенным риском развития СД 1-го типа (а/т GADA, IAA, IA-2A), имеющих родственников первой линии с СД 1-го типа и не имеющих родственников с СД 1-го типа. Исследование было начато у детей в возрасте 4 мес. Период наблюдения составил 6 лет. Проанализирован полиморфизм в генах VDR, CYP24A, CYP27B1, GC, RXR. Недостаточность витамина D на основании определения уровня 25(ОН)D в сыворотке крови обнаружена у 42 % детей и у 22–67 % детей, у которых развился СД 1-го типа. Наиболее высокие концентрации 25(ОН)D в плазме и низкий риск развития СД 1-го типа выявлены у детей при наличии минорного аллеля рецептора витамина D — VDR rs7975232 (ApaI).

G. Tapija и соавт. [16] считают, что более высокий уровень 25(ОН)D в пуповинной крови можно считать благоприятным прогностическим фактором снижения риска развития СД 1-го типа у детей, гомозиготных по генотипу VDR rs11568820 (Cdx2) G/G. N. Habibian и соавт. продемонстрировали связь между повышенным риском СД 1-го типа и некоторыми полиморфными вариантами в гене VDR (особенно BsmI и FokI). Показано, что достаточный уровень 25(ОН)D в сыворотке крови (≥30 нг/мл) в сочетании с некоторыми генотипами SNP (TaqI и BsmI) в гене VDR у пациентов с вновь выявленным СД 1-го типа способствовал сохранению функции остаточных бета-клеток поджелудочной железы [17]. Результаты исследований позволяют заключить, что SNP в генах, важных для синтеза, транспорта и действия витамина D, могут влиять на риск развития СД 1-го типа.

Цель — проанализировать ассоциацию полиморфизма гена VDR с риском развития НГЭ и СД 1-го типа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего в исследование были включены 282 женщины, из них — 129 больных генитальным эндометриозом I–IV степеней, подтвержденным интраоперационно и морфологически, 71 пациентка с СД 1-го типа и 82 женщины контрольной группы, представленной популяционной выборкой. Критериями исключения были тяжелая сопутствующая соматическая патология и онкологические заболевания.

ДНК из лимфоцитов периферической крови выделяли стандартным солевым методом с некоторыми модификациями. Методом полимеразной цепной реакции — полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР–ПДРФ) исследованы частоты аллельных вариантов гена VDR.

Для амплификации фрагмента промоторной области гена VDR использовали следующие праймеры:

• VDR rs2228570 F GTATGAGGGCTCCGAAGGCA
• VDR rs2228570 R GAAGGAGATGTGAAAAATGCAAG
• VDR rs1544410 F CCCTCACTGCCCTTAGCTCT
• VDR rs1544410 R TAACTTCCTCTTCGGCCTTT
• VDR rs731236 F 5’- GATGATCCAGAAGCTAGCCGACCT-3’
• VDR rs731236 R 5’- GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCT-3’

Условия проведения ПЦР представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Условия проведения полимеразной цепной реакции

Полиморфные варианты гена VDR	Денатурация	Денатурация	Отжиг	Синтез
		12 циклов	20 циклов
rs2228570 (FokI)	94 °С — 7 мин	96 °С — 15 с 65 °С — 20 с	96 °С — 15 с 62 °С — 20 с 76 °С — 15 с	72 °С — 5 мин
rs1544410 (BsmI)	94 °С — 7 мин	96 °С — 15 с 65 °С — 20 с	96 °С — 15 с 62 °С — 20 с 76 °С — 15 с	72 °С — 5 мин
rs731236 (TaqI)	94 °С — 7 мин	96 °С — 15 с 65 °С — 20 с	96 °С — 15 с 62 °С — 20 с 76 °С — 15 с	72 °С — 5 мин

 

Рестрикцию амплифицированных ДНК-фрагментов проводили согласно рекомендации фирмы-изготовителя («Сибэнзим»).

ПЦР-продукты гидролизировали эндонуклеазой рестрикции (табл. 2) при 37 °С в течение 16 ч в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл амплификата, 3 мкл воды, 1 мкл ×10 буфера, рекомендованного производителем для каждой рестриктазы, и 10 единиц (0,5 мкл) рестриктазы.

Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле. Изображения регистрировали с использованием системы видеогель-документации (Vilber Lourmat).

 

Таблица 2. Рестриктазы и анализ полиморфных вариантов гена VDR

Полиморфные варианты гена VDR	Размер ПЦР-продукта	Эндонуклеаза	Аллель и размер фрагментов рестрикции
rs1544410 (BsmI)	320 п. о.	HspA I	A — 320 п. о. G — 216 + 104 п. о.
rs2228570 (FokI)	429 п. о.	BstF5I	T — 101 + 91 + 237 п. о. C — 101 + 328 п. о.
rs731236 (TaqI)	360 п. о.	Taq I	T — 360 п. о. t — 248 + 112 п. о.

Примечание: п. о. — пары оснований; ПЦР — полимеразная цепная реакция.

 

Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований. Достоверность различий частот определяли с помощью точного двустороннего критерия Фишера по стандартной формуле с учетом поправки Йейтса для парных сравнений с контрольной группой и с помощью критерия хи-квардрат (÷²) по стандартной формуле с учетом поправки Йейтса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. В случае наличия достоверных отличий между контролем и исследуемой группой использовали также коэффициент отношения шансов (ОШ). Значение ОШ применительно к нашим данным показывает, во сколько раз вероятность наличия данного генотипа у больных превышает вероятность его наличия в контрольной группе или же во сколько раз выше вероятность иметь то или иное заболевание, обладая определенным генотипом.

Значение ОШ рассчитывали по формуле:

$\mathrm{ОШ} = \frac{\mathrm{a}}{\mathrm{b}} \times \frac{\mathrm{d}}{\mathrm{c}},$

где a — число индивидуумов с наличием данного маркера у исследуемой группы; b — число индивидуумов с отсутствием данного маркера в исследуемой группе; c — число индивидуумов с наличием данного маркера в контрольной группе; d — число индивидуумов с отсутствием данного маркера в контрольной группе.

ОШ указано с 95 % доверительным интервалом (ДИ). Границы ДИ вычисляли по формулам:

$\mathit{О}{\mathit{Ш}}_{\mathbf{m}\mathbf{i}\mathbf{n}}\mathbf{ }\mathbf{=}\mathbf{ }\mathit{О}{\mathit{Ш}}^{\mathbf{ }\frac{1 – 1,96}{\sqrt{x^2}}}$и   $\mathit{О}{\mathit{Ш}}_{\mathbf{m}\mathbf{a}\mathbf{x}}\mathbf{ }\mathbf{=}\mathbf{ }\mathit{О}{\mathit{Ш}}^{\mathbf{ }\frac{1+ 1,96}{\sqrt{x^2}}}$

Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В настоящем исследовании определены частоты аллелей и генотипов по полиморфным вариантам rs1544410 (BsmI), rs2228570 (FokI) и rs731236 (TaqI) гена VDR.

На основании проведенного анализа установлено, что в группе больных НГЭ наиболее часто встречался генотип G/G (47,3 %) полиморфизма rs1544410 (BsmI), С/T (45,7 %) полиморфизма rs2228570 (FokI) и T/T (49,6 %) полиморфизма rs731236 (TaqI) гена VDR. В группе пациенток с СД 1-го типа наиболее распространенными генотипами были G/A (53,5 %) полиморфизма rs1544410 (BsmI), С/T (40,9 %) полиморфизма rs2228570 (FokI) и T/t (53,5 %) полиморфизма rs731236 (TaqI), в контрольной группе — G/A (52,4 %) полиморфизма rs1544410 (BsmI), С/T (47,6 %) полиморфизма rs2228570 (FokI) и Т/t (45,1 %) полиморфизма rs731236 (TaqI) гена VDR.

В ходе статистической обработки данных выявлено, что частота аллеля G полиморфного варианта rs1544410 (BsmI) гена VDR достоверно выше в группе пациенток с НГЭ по сравнению с популяционной выборкой (p = 0,048). Установлены достоверные различия для генотипа G/G у больных НГЭ относительно группы контроля (p < 0,05) и группы больных СД 1-го типа (p < 0,05). Согласно коэффициенту ОШ риск развития НГЭ в 1,9 раза выше при данном генотипе (ОШ 1,93 ДИ 1,082–3,450; ОШ 1,892 ДИ 1,022–3,430). Сочетание генотипов A/A+ G/A достоверно чаще встречается у пациенток с СД 1-го типа (p = 0,04) и в популяции (p = 0,025) по сравнению с больными НГЭ.

На основании данных, представленных в табл. 3, при анализе rs2228570 (FokI) варианта полиморфизма гена VDR достоверных различий выявлено не было.

В ходе исследования обнаружено достоверное повышение частоты встречаемости t-аллеля полиморфизма rs731236 (TaqI) гена VDR в группе пациенток с СД 1-го типа (p < 0,05). Сочетания генотипов T/t+t/t полиморфизма rs731236 (TaqI) гена VDR у больных СД 1-го типа отмечено достоверно чаще, чем в группе пациенток с НГЭ (p = 0,017).

ОБСУЖДЕНИЕ

Всего несколько исследований в настоящее время посвящены изучению полиморфизма гена VDR у пациенток с НГЭ. Группа бразильских ученых предположила, что генетические изменения в гене VDR могут привести к важным дефектам в активации гена и, соответственно, влиять на иммунную функцию. Авторы изучили возможную взаимосвязь между эндометриозом и/или бесплодием и полиморфизмом гена VDR (ApaI, TaqI, FokI и BmsI). Полученные в ходе работы результаты свидетельствуют, что полиморфизм гена VDR не играет важной роли в патогенезе эндометриоза и/или бесплодия у исследованных бразильских женщин [18]. В другой работе этой группы авторов оценивали частоты полиморфизма FokI гена VDR у бесплодных женщин с эндометриозом и его связи с заболеванием. Результаты данного исследования показали, что полиморфизм FokI гена VDR не связан с бесплодием, вызванным эндометриозом, у бразильских женщин [19].

Группа польских ученых исследовала генетические факторы риска ассоциированного с эндометриозом бесплодия. Оказалось, что частоты генотипов и аллелей существенно не различались в основной и контрольной группах, но гаплотип A-T (BmsI-FokI) [ОШ 1,659 (1,122–2,453), p = 0,011] гена VDR был определен как фактор риска бесплодия, связанного с эндометриозом [20].

В ходе нашего исследования установлено, что генотип G/G полиморфного варианта rs1544410 (BsmI) гена VDR в 1,9 раза повышает риск возникновения НГЭ. Согласно литературным данным А-аллель данного полиморфизма связан с повышенной экспрессией гена VDR и повышает сывороточный уровень активной гормональной формы витамина D — кальцитриола по сравнению с вариантом G [21]. Среди пациенток с НГЭ, напротив, преобладает вариант G, что, вероятно, связано с пониженной экспрессией гена и сниженным сывороточным уровнем кальцитриола. Данный факт может иметь значение при выборе дозы препарата для данной категории пациенток.

В нашем исследовании было обнаружено достоверное повышение частоты встречаемости аллеля t полиморфизма rs731236 (TaqI) гена VDR в группе пациенток с СД 1-го типа (p < 0,05), что согласуется с данными литературы, хотя исследований по данной проблеме немного. А.Е. Ahmed и соавт. [22] изучали связь между однонуклеотидными полиморфизмами в гене VDR Fok I F>f (rs10753810), Bsm I B>b (rs1544410), Apa I A>a (rs7975232), Taq I T>t ( rs731236) и СД 1-го типа у детей. Полиморфизмы BsmI B и ApaI A были ассоциированы с риском развития СД 1-го типа. У пациентов с СД чаще наблюдался дефицит витамина D. При добавлении витамина D к стандартной инсулинотерапии отмечено значительное улучшение гликемического профиля. O.A. Sahin и соавт. [23] проанализировали 9 исследований, в которые было включены 1053 ребенка с СД 1-го типа, контрольная группа составила 1017 детей без СД. Результаты показали, что полиморфизмы BsmI BB, BsmI Bb, TaqI tt были ассоциированы с повышенным риском развития СД 1-го типа, тогда как такие полиморфные варианты, как BsmI bb и TaqI TT, напротив, были связаны с протективным эффектом в отношении развития заболевания.

 

Таблица 3. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов гена VDR у больных наружным генитальным эндометриозом, сахарным диабетом 1-го типа и пациентов контрольной группы

Полиморфный вариант гена VDR			Наружный генитальный эндометриоз		Сахарный диабет 1-го типа		Контрольная группа		p
			n	%	n	%	n	%
rs1544410 (BsmI)	Генотипы	A/A	16	12,4	10	14,1	13	15,9
		G/A	52	40,3	38	53,5	43	52,4
		G/G	61	47,3	23	32,4*	26	31,7**	<0,05* ОШ 1,892 ДИ 1,022–3,430 0,05** ОШ 1,932 ДИ 1,082–3,450
		A/A+G/A	68	52,7	48	67,6*	56	68,3**	0,04* 0,025** ОШ 0,52 ДИ 0,29–0,92
		Всего	129	100	71	100	82	100
	Аллели	A	84	32,6	58	40,8	69	42,1
		G	174	67,4	84	59,2	95	57,9	0,048
rs2228570 (FokI)	Генотипы	C/C	37	28,7	28	39,4	22	26,8
		C/T	59	45,7	29	40,9	39	47,6
		T/T	33	25,6	14	19,7	21	25,6	>0,05
		Всего	129	100	71	100	82	100
	Аллели	С	133	51,6	85	59,9	83	50,6
		Т	125	48,4	57	40,1	81	49,4	>0,05
rs731236 (TaqI)	Генотипы	T/T	64	49,6	23	32,4	33	40,3
		T/t	51	39,5	38	53,5	37	45,1
		t/t	14	10,9	10	14,1	12	14,6	>0,05
		T/t+t/t	65	50,4	48	67,6	49	59,7	0,017
		Всего	129	100	71	100	82	100
	Аллели	T	179	69,4	84	59,2	103	62,8
		t	79	30,6	58	40,8	61	37,2	<0,05

Примечание. Полужирным шрифтом выделены значения, при сравнении которых были обнаружены статистически значимые различия.

 

Целью метаанализа и системного обзора, которые объединили 40 исследований, была оценка ассоциаций между полиморфизмами FokI (rs2228570), TaqI (rs731236), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) гена VDR и предрасположенностью к развитию СД 1-го типа. Авторам не удалось выявить значимой связи SNP гена VDR с риском развития СД 1-го типа в популяции [24]. Однако при анализе данных ассоциаций в различных подгруппах была обнаружена значительная связь между полиморфизмами FokI и BsmI и риском СД 1-го типа в африканской и американской популяциях.

Полиморфизмы генов, которые участвуют в синтезе витамина D и кодируют его гидроксилазы, VDBR и VDR, способны повышать риск развития СД 1-го типа, поэтому необходимы дополнительные исследования для оценки их влияния на статус витамина D и оказываемые им эффекты. Это позволит идентифицировать группы больных, которым необходимы более высокие дозы витамина D для достижения желаемых целевых значений 25(ОН)D в сыворотке крови, для профилактики и лечения СД 1-го типа. Дальнейшие исследования VDR, помимо генетических и традиционных факторов риска развития СД 1-го типа, дадут возможность выявить новые критические факторы, которые в дальнейшем можно будет применить в персонализированной медицине для диагностики и более качественного и оптимизированного лечения таких пациентов.

Таким образом, полученные данные имеют значение для оценки риска развития НГЭ и СД 1-го типа и разработки новых стратегий профилактики и лечения данных заболеваний, но нужны дальнейшие исследования в этом направлении.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках НИР фундаментальных научных исследований НИОКТР: АААА-А19-119030490009-6, АААА-А19-119030490046-1.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн, написание текста, редактирование — Т.Э. Иващенко, М.И. Ярмолинская. Сбор и обработка материала — А.С. Денисова, А.А. Шагина, Е.В. Мишарина. Статистическая обработка данных — Т.Э. Иващенко, А.С. Денисова. Написание текста — А.С. Денисова, Е.В. Мишарина.

Об авторах

Александра Сергеевна Денисова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: al.ser.denisova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3607-2420

MD

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3

Татьяна Эдуардовна Иващенко

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: tivashchenko2011@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8549-6505
Scopus Author ID: 7004724202

доктор биологических наук, профессор

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3

Мария Игоревна Ярмолинская

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта; Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6551-4147
SPIN-код: 3686-3605
Scopus Author ID: 7801562649
ResearcherId: P-2183-2014

доктор медицинских наук, профессор, профессор РАН

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Анна Алексеевна Шагина

Диагностический центр (медико-генетический)

Email: zero_18@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-2276-6803
Россия, Санкт-Петербург

Елена Владимировна Мишарина

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Автор, ответственный за переписку.
Email: mishellena@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0276-7112

кандидат медицинских наук

Россия, 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3

Список литературы

Дополнительные файлы