Анализ клинических штаммов стрептококков группы в на наличие генов потенциальных адгезинов, локализованных на «островах патогенности»
- Авторы: Суворов А.Н.1, Савичева А.М.2, Глушанова А.В.1, Оганян К.А.2, Грабовская К.Б.1, Алайцева О.В.1, Зациорская С.Л.2, Ферретти Д.1, Аржанова О.Н.2
-
Учреждения:
- Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
- Научно—исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта
- Выпуск: Том 54, № 2 (2005)
- Страницы: 50-55
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 01.10.2005
- Статья одобрена: 05.10.2021
- Статья опубликована: 01.10.2005
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/81945
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD81945
- ID: 81945
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В работе осуществлен генетический анализ коллекции штаммов стрептококков группы В (СГВ) на наличие потенциальных генов адгезии
и агрегации. Наличие генов, обозначенных как sspB1 и sspB2, в геноме СГВ проверялось посредством ПЦР и ДНК гибридизации. Установлено, что штаммы СГВ существенно отличаются по содержанию и количеству в геноме данных генов, а сами гены гетерогенны. Установлена корреляция содержания генов sspB1 и sspB2 в геноме с развитием тяжелых СГВ патологий, сопровождающихся поражением мочевых путей. Корреляции наличия исследуемых генов с определенным серотипом СГВ не было обнаружено.
Ключевые слова
Полный текст
Стрептококки группы В (СГВ), впервые обнаруженные в качестве возбудителей заболеваний крупного рогатого скота, стали рассматриваться в качестве патогенов человека относительно недавно [1, 2]. Однако исследования последних лет показали, что инфекция, вызванная СГВ, является наиболее частой причиной инфекционных заболеваний новорожденных, сопровождающейся такими осложнениями, как сепсис и менингит [6, 11]. В ряде стран мира СГВ вызывают смерть новорожденных чаще, чем другие бактериальные патогены [5]. Все это обусловливает интерес исследователей как к самому возбудителю, так и к путям предотвращения инфекции, вызванной СГВ. Одной из существенных проблем СГВ патологии является высокий процент бессимптомного носительства данного микроба во влагалище у женщин, который, по разным данным, варьирует от 30 до 60 [2]. Обнаружение СГВ в ампуле прямой кишки вообще рассматривается как вариант нормы. Причины, по которым в определенных случаях в организме новорожденных развертывается специфический инфекционный процесс, неизвестны. Этим вызван интерес исследователей к изучению микробных факторов, которые способствуют возникновению заболевания. Исторически основным фактором патогенности СГВ считается полисахаридная капсула [7]. Доказана роль капсулы в обеспечении защиты микроба от фагоцитоза. Продемонстрирована также корреляция между принадлежностью СГВ к определенному серотипу по капсульному антигену (чаще всего III) и частотой возникновения инфекционных процессов у новорожденных. Однако наличие капсульного полисахарида определенного типа не может объяснить причин, по которым баланс взаимоотношений паразит—хозяин сдвигается в сторону тяжелой патологии. Изучение белковых факторов патогенности СГВ, таких как бета— и альфа—антигены и С5а—пептидаза, показало, что данные факторы, при всей своей значимости в формировании вирулентного фенотипа микроба не являются определяющими, так как либо содержатся у всех представителей стрептококков группы В (как С5а—пептидаза) [3], либо с их наличием не коррелирует степень тяжести СГВ патологий (как в случае с присутствием в геноме СГВ бета—С—белка) [1].
Проведенные в начале XXI века исследования по полному секвенированию геномов трех штаммов СГВ различных серотипов позволили обнаружить значительное количество ранее неизвестных поверхностных белков стрептококков, потенциально важных для реализации вирулентных свойств микроорганизма [8, 15]. Неожиданностью явилось то, что большинство генов, кодирующих синтез данных белков, локализовались на «островах патогенности» — генетических структурах, которые за счет концевых повторяющихся последовательностей могут либо перемещаться из одного участка генома в другой, либо передаваться другим микроорганизмам.
В настоящей работе приводятся данные исследования клинических штаммов СГВ, на предмет содержания в их геноме двух генов потенциальных адгезинов, расположенных на «островах патогенности» sspB1 и sspB2.
Материалы и методы исследования
В исследовании анализировались клинические штаммы стрептококков группы В, выделенные из влагалища и мочи беременных женщин, различных участков кожи или абортного материала, разных локусов новорожденных детей (носоглотка, конъюнктива, подмышечные впадины, поверхность кожи вокруг пупка, кал и др.). Всего в работе исследовано 118 штаммов СГВ. Большинство клинических штаммов СГВ, использованных в работе, были получены из клиники НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, 7 штаммов — из коллекции отдела молекулярной микробиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН. 9 штаммов были получены из Пражского института микробиологии (6 инвазивных штаммов и 3 штамма от носителей). Штамм СГВ O9OR использовался в качестве положительного контроля на наличие генов sspB1 и sspB2. Штаммы СГВ выращивались на кровяном агаре на основе среды Todd—Hewitt (TH), Oxoid, США, после чего выращивались на TH бульоне. Культивирование микроорганизмов проводилось при 37 °C.
Все проанализированные штаммы СГВ проверялись на наличие группового полисахаридного антигена, а затем серотипировались. Распределение штаммов по наиболее распространенным серотипам СГВ представлено в табл. 1.
Таблица 1. Серотипы штаммов СГВ, использованных в работе
*Источник получения штаммов | Серотип 1 (а и в) | Серотип II | Серотип III | Серотип V и нетипируемые штаммы |
НИИ акушерства и гинекологии 1 | 5 | 3 | 13 | 1 |
НИИ акушерства и гинекологии 2 | 3 | 1 | 6 | 1 |
НИИ акушерства и гинекологии 3 | 6 | 6 | 9 | 3 |
НИИ акушерства и гинекологии 4 | 12 | 7 | 14 | 12 |
Институт микробиологии (Прага) | 3 | 1 | 3 | 2 |
НИИЭМ | 3 | 1 | 2 | 1 |
Итого | 32 | 19 | 47 | 20 |
* — Штаммы из НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта получались в разное время и анализировались партиями |
Для выделения ДНК штаммы СГВ выращивались в TH бульоне, после чего ДНК выделялась фенол—хлороформым методом по [12] либо методом экспресс—ПЦР [13]. ДНК праймеры, использованные для анализа штаммов методом полимеразной цепной реакции, представлены в табл. 2. ПЦР проводилась в аппаратах MJ Research (США) или Perkin Elmer (США) при условиях оптимизированных для каждой пары праймеров.
Таблица 2.ДНК праймеры, использованные для ПЦР анализа штаммов СГВ
Название праймеров | Последовательность нуклеотидов 5—3 | Ожидаемый размер продукта амплификации н.п.* |
р420 р1202 | ACAGGCCTATGAAACGAATATTAAGGTTACATCACGCAAAG | 782 |
sspB1d sspB1r | GCGAACCAAGAAAAACAAAAACTTATGATTGAGTGACGAGTGGG | 643 |
sspB2—1d sspB2—1r | ACAACTACTGATGCACAAGCTGAAGCCATCCTTGTTAGGAACATAA | 786 |
sspB2—2d sspB2—2r | ATTGATGAAGCAGGTCAATCTGTTATCCATTCCCAAAATCAATC | 466 |
sspB2—3d sspB2—3r | CCATTAACAGATTGACCTGCTTCTTATGTTGCTAACAAGGATGGCT | 677 |
metR metD | GCTTAGCTATCGCTCCTGTGATTCCTGAAACCAAAGAGGTCATT | 503 |
tralr trald | AGCGATTCTTTCTCCTTCCCGCAGAAAGTCTTGGTCCAGC | 255 |
* — При расчетах размеров ПЦР продуктов указаны данные, соответствующие нуклеотидной последовательности генома штамма NEM 316 [8] |
Результаты ПЦР оценивались после электрофореза в 1,2%—м агарозном геле в ультрафиолетовом освещении. Для документации результатов и обработки изображений пользовались системой видеозахвата UVP, (США) и программой Digi DocIt.
Для подтверждения результатов ПЦР осуществлялась ДНК гибридизация с зондами, полученными на основе ПЦР продуктов контрольной ДНК СГВ, помеченных дигоксигенином (La Roche, США). Перенос ДНК на фильтры и постановка гибридизации осуществлялась по [12].
Результаты и их обсуждение
Появление электронных банков данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов в последнее десятилетие обеспечило прорыв в понимании строения бактериальных и вирусных геномов. Появились и принципиально новые подходы к изучению механизмов патогенеза инфекционных заболеваний, основанные на знании структуры генома. Однако с появлением огромного массива новых данных о генетических структурах бактерий, принципиальных изменений в понимании ключевых звеньев патогенеза не произошло. Причина данного явления состоит в существовании пропасти между наличием информации в электронных банках данных и доказательствами ее биологической значимости. Данная ситуация вполне применима по отношению к исследованиям патогенеза заболеваний, вызванных стрептококками группы В. В банке данных нуклеотидных последовательностей GenBank в настоящее время присутствует информация о полных нуклеотидных последовательностях штаммов СГВ серотипа III NEM 316 и серотипа V 2603 [8, 15]. Имеется также частичная информация о геноме штамма первого серотипа 0909. За три года с момента публикации данных секвенирования концепция основных факторов патогенности СГВ не изменилась. Все так же основным фактором патогенности СГВ считается полисахаридная капсула, а из белковых факторов выделяют С5а— пептидазу, бета—гемолизин, альфа— и бета—С—протеины [10]. При этом данные выводы о факторах патогенности никак не соотносятся с клинико—эпидемиологическими исследованиями, посвященными изучению заболеваний, вызванных различными штаммами СГВ. В частности, широко известно, что наибольшее количество заболеваний новорожденных обусловлено III серотипом СГВ. При этом среди штаммов данного серотипа не обнаруживается бета—С—протеин [10], а С5а—пептидаза идентична таковой в СГВ других серотипов. Все это обусловливает необходимость поиска новых потенциально значимых факторов патогенности, значение которых в формировании эпидемически актуальных штаммов еще не исследовалось. В работе, посвященной секвенированию генома СГВ серотипа V [15], проводилось исследование экспрессии поверхностных белков СГВ. В результате было обнаружено более 300 белков, многие из которых кодируются генами, локализованными на так называемых «островах патогенности».
Задачей настоящего исследования явилось изучение клинических штаммов СГВ на предмет присутствия в геномах двух генов потенциальных адгезинов, условно обозначенных sspB1 и sspB2. Ген sspB1 был первоначально обнаружен нами в геноме штамма O9OR в результате анализа вычитающей библиотеки генов СГВ [14]. Причиной выбора данного гена и гена sspB2 для молекулярно—эпидемиологического анализа, а также их обозначения, явился тот факт, что обнаруженные белки СГВ гомологичны белкам SspA, и SspB S. gordonii [4]. Позднее было выяснено, что данные белки также гомологичны широкому спектру бактериальных адгезинов и факторов аггрегации: SpaP S. mutans, SpaA, S. sobrinus, поверхностному адгезину А, белкам Asal и ASP1 E.faecalis, РРаА S. criteri, Pas S. intermedius и ряду других белков. Учитывая важность процесса адгезии в инициации инфекционного процесса, наличие разнообразных адгезинов может быть критичным для распространения СГВ, которые помимо ампулы прямой кишки и влагалища в ряде случаев способны колонизировать уретру, мочеточник, ротовую полость и конъюнктиву. Другой, не менее важной особенностью адгезинов, гомологичных анализируемым белкам СГВ, является их участие в формировании секреторных путей V типа. Данный тип секреторных путей у ряда микроорганизмов участвует в активном транспорте биологических молекул возбудителя (в первую очередь токсинов) в организм хозяина [9]. Анализ нуклеотидной последовательности генома СГВ NEM 316 позволил обнаружить одну копию гена sspB1 и 3 копии sspB2. В геноме штамма серотипа V 2603 обнаруживалась только одна копия гена sspB2 и отсутствовал sspB1. Учитывая возможное наличие гетерогенности отдельных областей генов sspB1 и sspB2, для получения объективной картины ПЦР были использованы 2 пары праймеров, соответствующих гену sspB1, и три пары праймеров, соответствующих гену sspB2 (рис. 1).
Рис. 1. Схема локализации ДНК праймеров на последовательности генов sspB1 и sspB2
Проведенный анализ позволил установить, что из общего количества штаммов СГВ ген sspB1 был обнаружен в 24 (20,3 %) штаммах из 118, а ген sspB2 в 61 (51,6 %) штамме. При этом частота обнаружения данных генов мало зависела от серотипа СГВ. Ген sspB1 с одинаковой частотой (28 %) обнаруживался в штаммах серотипов I и III и несколько реже среди нетипируемых штаммов
и штаммов серотипа II. Наибольшая частота обнаружения гена sspB2 была отмечена в штаммах серотипа III (58 %), однако, учитывая тот факт, что в ряде случаев микробный материал был выделен из различных участков одного и того же пациента, данные отличия скорее характеризуют тенденцию, чем истинную корреляцию определенного серотипа СГВ с наличием исследуемых генов. Применение группы праймеров в данном исследовании основывалось на предположении, что гены предполагаемых адгезинов характеризуются гетерогенностью. Данное предположение подтвердилось полностью. Так, например, при анализе первой партии штаммов из НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН с обеими парами праймеров на ген sspB1, выбранными для анализа, прореагировали лишь 2 штамма из 16 положительных, а со всеми тремя парами праймеров на ген sspB2— только 5 из 28. При этом в результате амплификации с праймерами на ген sspB2 во многих случаях образовывалось более одного фрагмента ДНК, отражающих присутствие нескольких копий данного гена (табл. 3).
Таблица 3. Штаммы СГВ из 1—й партии штаммов НИИ акушерства и гинекологии, содержащие ген sspB2
№ | № в коллекции | Праймеры SspB 2—1 | Размер ДНК фрагмента | Праймеры SspB 2—3 | Размер ДНК фрагмента | Праймеры SspB 2—2 | Размер ДНК фрагмента |
1 | 090R | + | 600, 780 | + | 670 | + | 460 |
2 | 10244—д1 | + | 600 | + | 670 | + | 460 |
3 | 7129эн | + | 600 | + | 670 | + | 460 |
4 | 277 | + | 600 | + | 670 | + | 460 |
5 | 11471—Д1 | + | 600, 780 | + | 670 | + | 460 |
6 | 92—эн | + | 600 | + | 670 | — |
|
7 | 11806 | + | 780 | + | 670 | — |
|
8 | 3540—д2 | + | 600, 780 | + | 670 | — |
|
9 | 10470—Д1 | + | 600, 780 | + | 600 | — |
|
10 | 11982 | + | 780 | + | 900, 670, 300 | — |
|
И | 12583—д1 | + | 600, 780 | + | 900, 670, 300 | — |
|
12 | 10270—Д1 | — |
| + | 670 | + | 840 |
13 | 11360 | — |
| + | 670 | + | 460 |
14 | Зсек | + | 600 | — |
| — |
|
15 | 238 | + | 600 | — |
| — |
|
16 | 7293 | + | 600 | — |
| — |
|
17 | 273 | + | 600 | — |
| — |
|
18 | 12243—Д1 | — |
| — |
| + | 460 |
19 | 3751 | — |
| — |
| + | 460 |
20 | 4306—до | — |
| + | 900, 700, 300 | — |
|
21 | 3445—Д1 | — |
| + | 900, 700, 300 | — |
|
22 | 123376—д1 | — |
| + | 670 | — |
|
23 | 714—Д1 | — |
| + | 670 | — |
|
24 | 7130эн | — |
| + | 600 | — |
|
25_ | 11312—д1 | — |
| + | 670 | — |
|
26 _ | 7380 | — |
| + | 670 | — |
|
27 | 7294 | — |
| + | 670 | — |
|
28 | 1828 | — |
| + | 670 | — |
|
Данное наблюдение также подтвердили и результаты гибридизации, указывающие на наличие нескольких копий данного гена в геноме (рис. 2, 3).
Рис. 2.
Гибридизация ДНК зонда, полученного в результате ПЦР с геном sspB2 (праймеры SspB2— 3rd) с хромосомыми ДНК СГВ различных серотипов после гидролиза хромосомных эндонуклеазой EcoRl. ДНК зонд метили дезоксигенином La Roche, США. Детекцию фрагментов осуществляли при помощи набора Genius, La Roche. Треки 1, 2, 3, 4 соответствуют участкам нанесения хромосомных ДНК II, III, IIIR и IV серотипов
Рис. 3.
ДНК гибридизация хромосомной ДНК СГВ различных серотипов, гидролизованной эндонуклеазой E.coRI с геном sspB2. Номера треков (1, 2, 3, 4) соответствуют нанесенным ДНК СГВ II, III, IIIR и IV серотипа. В качестве ДНК зонда использовался ПЦР продукт амплификации ДНК СГВ 090R с праймерами sspB2—3rd.
Наиболее интересной частью исследования явилось сопоставление диагноза и места выделения СГВ с частотой присутствия генов в геноме. Оказалось, что из штаммов, выделенных из мочевых путей или мочи, 38 % содержали ген sspB1 и 63% содержали ген sspB2, что существенно превышало частоту выделения штаммов, полученных от носителей. Единственный штамм СГВ, выделенный из фасций (предположительно «некротический фасциит»), содержал в геноме оба исследуемых гена. Аналогичная тенденция наблюдалась и при анализе штаммов, полученных из Чехии. Гены sspB1 и sspB2 обнаруживались только в случае инвазивных штаммов, выделенных из крови, и в одном случае при выделении с конъюнктивы.
Полученные результаты анализа клинических штаммов СГВ позволяют сделать предположение о неслучайном характере распределения генов потенциальных адгезинов СГВ sspB1 и sspB2, а также о возможной роли белковых продуктов данных генов в процессе «освоения» условно— патогенным паразитом, к которым относится СГВ, новых экологических ниш в человеческом организме. В этой связи представляется целесообразным более детальное исследование пациентов — носителей СГВ на предмет содержания в геноме данных потенциальных генов патогенности.
Об авторах
А. Н. Суворов
Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
А. М. Савичева
Научно—исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
А. В. Глушанова
Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
К. А. Оганян
Научно—исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
К. Б. Грабовская
Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
О. В. Алайцева
Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
С. Л. Зациорская
Научно—исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
Д. Ферретти
Научно—исследовательский институт экспериментальной медицины
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
О. Н. Аржанова
Научно—исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта
Email: info@eco-vector.com
Россия, Санкт—Петербург
Список литературы
- Adderson Е.Е., Takahash S., WangY. et al. Subtractive hybridization identifies a novel predicted protein mediating epithelial cell invasion by virulent serotype III group В Streptococcus agalactiae // Infect. Immun.—2003.—Vol. 71.—P. 6857—6863.
- Bake C.J. and Edwards M.S. Group В streptococcal infection. In Infectious diseases of the fetus and the newborn infant // Remington J.S. and Klein J.O. eds. (Philadelphia: W.B. Saunders Company).—1995. —P. 980—1054.
- Chmourygina I., Suvorov A.N., Ferrieri P. et al. //Infect. Immun.—1996.—Vol. 64.—P. 2387—2390.
- DemuthD.R., Duan Y., Brooks W. etal. Tandem genes encode cell—surface polypeptides SspA and SspB which mediate adhesion of the oral bacterium Streptococcus gordonii to human and bacterial receptors // Mol. Microbiol.—1996.—Vol. 20.—P. 403—413.
- Embleton N., Wariyar U., Hey E. et al. Mortality from early onset group В streptococcal infection in the United Kingdom // Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal. Ed.—1999.—Vol. 80.—P.139—141.
- Gardam M.A., Low D.E., Saginur R.et al. Group В streptococcal necrotizing fasciitis and streptococcal toxic shock—like syndrome in adults // Arch. Intern. Med. — 1998.—N 24.—Vol. 158.—P. 1704—1708.
- Gibson R.L., Lee M.K., Soderland C.et al. Group В streptococci invade endotelial cells: type III capsular polysacharide attenuates invasion // Infect. Immun.—1993.—Vol. 61.—P. 478—485.
- Glaser, Rusniok C., Buchrieser C. et al. Genome sequence of Streptococcus agalactiae, a pathogen causing invasive neonatal disease // Molec. Microbiol.—2002.—Vol. 45.—P. 1499—1514.
- Henderson I.R., Navarro—Garcia F., Desvaux M. et al. // Microbiol. Mol. Biol. Rev.—2004.—Vol. 68.—P. 692—744.
- Kong F., Gowan S., Martin D. et al. Molecular profiles of group В streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes //J. Clin. Microbiol.—2002.—Vol. 40.—P. 620—626.
- Lukacs S.L., Schoendorf K.C., Schuchat A. et al. Trends in sepsis—related neonatal mortality in the United States, 1985—1998 // Pediatr. Infect. Dis. J.—2004.—Vol. 23.—P. 599—603.
- Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: NY, 1982.—P. 1—545.
- Suvorov A.N., Sverdlova A., Totolian A.A. et al. //Med. Microbiol. Lett.—1996.—Vol. 4.—P. 341—345.
- Suvorov A.N., Ferretti J.J. Construction of a GBS—GAS DNA subtraction library allows discovery of previously unidentified GBS genes and rapid location of unique regions on the GBS chromosome // J. Basic Microbiol.—2004. — Vol. 44.—P. 66—74.
- Tettelin H., Masignani V., Cieslewicz M.J. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.—2002.—Vol. 99.—P. 12391—12396.