Продукция цитокинов мононуклеарными клетками, инфильтрирующими эпителиальные опухоли яичников
- Авторы: Павлов Р.В.1,2, Аксененко В.А.1,2, Сельков С.А.1,2
-
Учреждения:
- Ставропольской государственной медицинской академия
- НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН
- Выпуск: Том 51, № 1 (2002)
- Страницы: 74-77
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 15.01.2002
- Статья одобрена: 09.12.2021
- Статья опубликована: 15.01.2002
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/90024
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD90024
- ID: 90024
Цитировать
Аннотация
В присутствии аутосыворотки изучена продукция ИЛ 1ß, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа мононуклеарными клетками, инфильтрирующими эпителиальные опухоли яичников 50 женщин больных доброкачественными опухолями,30 больных пограничными опухолями и 50 больных раком яичников. Установлено, что продукция ИЛ1ß, ФНОα и ИЛ6 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими эпителиальные опухоли яичников, возрастает при малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки клеток рака яичников.
При малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки клеток рака яичников выявлено снижение базальной и стимулированной продукции ИЛ2, а также стимулированной продукции ИЛ4 мононуклеарами, инфильтрирующими опухоль. Полученные данные позволяют констатировать повышение активности мононуклеарных фагоцитов, инфильтрирующих эпителиальные опухоли яичников, в процессе их прогрессирования, а также снижение активности Т-клеточной иммунной реакции 1 и 2 типа в ткани опухолей этой локализации. Одной из возможных причин снижения клеточного иммунитета на тканевом уровне у больных опухолями яичников может быть повышенная продукция мононуклеарными клетками цитокинов, замыкающих иммунные реакции, в частности ИЛ6.
Ключевые слова
Полный текст
Ролъ отдельных цитокинов в механизмах противоопухолевого иммунитета, а также возможности применения их в лечении опухолей разной локализации активно изучается на протяжении 20 лет [3]. Несмотря на это, особенности цитокинового обмена у больных эпителиальными опухолями яичников (ЭОЯ) изучены недостаточно. Имеющиеся литературные данные, посвященные этой проблеме, немногочисленны и неоднозначны. Большинством авторов, в том числе и нами, оценивался уровень цитокинов в сыворотке крови больных ЭОЯ и особенности их продукции иммунокомпетентными клетками периферической крови [4, 7, 9]. В то же время продукция цитокинов мононуклеарными клетками (МНК), инфильтрирующими ЭОЯ, практически не изучена, что не позволяет достоверно оценить их функциональную активность на финальном этапе реализации противоопухолевого иммунитета [8, 10].
Цель исследования
Изучить продукцию отдельных цитокинов МНК, инфильтрирующими эпителиальные опухоли яичников, в том числе интерлейкина- 1ß (ИЛ1ß) и фактора некроза опухоли-α (ФНОα), как цитокинов, обладающих противоопухолевой активностью и отражающих функциональное состояние мононуклеарных фагоцитов в смешанной культуре клеток, а также ИЛ2 и ИЛ4 — цитокинов, опосредующих противоопухолевую клеточную реакцию Т-лимфоцитов по 1 или 2 типу, и ИЛ6 — как цитокина, замыкающего реакции клеточного иммунитета.
Методы исследования
Были изучены особенности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов мононуклеарами, изолированными из ткани ЭОЯ, у 130 пациенток, находившихся на лечении в Ставропольском краевом онкологическом диспансере в период с 1998 по 2000 гг.
После клинического обследования, проведения УЗИ, КТ и гистологического исследования образцов удаленных опухолей все больные были распределены на 4 группы: 50 больных доброкачественными эпителиальными опухолями яичников,30 — пограничными опухолями яичников,20 — высокодифференцированным раком яичников и 30 — умеренно- и низкодифференцированным раком.
Степень дифференцировки клеток рака яичников оценивалась по методике, предложенной Г. Г. Автандиловым (1996) [1] и адаптированной нами относительно ЭОЯ. Учитывались площадь ядер опухолевых клеток, их плоидностъ, а также параметры активности областей организаторов ядрышек.
Изолированную из опухоли культуру МНК получали по методике, описанной Н. В. Чердынцевой и соавт. (1997) [5]. Для этого опухолевую ткань измельчали на кусочки размером 1х1х1 мм, затем инкубировали в ферментном коктейле, содержащем 0,01% коллагеназы (0,37 ЕД/мг «Serva»),0,01% дезоксирибонуклеазы II (262 КЕД/мг, «Serva») в течение 30 мин на магнитной мешалке в пластиковом стаканчике объемом 50мл при 37°C. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали от ферментов средой Хенкса и ресуспендировали в среде 199 [4].
Выделение мононуклеарных клеток из полученной клеточной суспензии осуществлялось на градиенте плотности Ficoll-Paque (р=1,077г/мл) производства «Pharmacya Fine Chemicals» (Швеция) по методу, описанному Воуит (1968) [6].
Культивирование мононуклеарных клеток, инфильтрирующих опухоль с целью моделирования условий, приближенных к внутренней среде организма, проводили по методике, предложенной Н. М. Бережной и соавт. (1993 г. ) [2]. Для этого к клеточной суспензии, содержащей МНК в конечной концентрации 2×106/мл среды 199, добавляли 10% аутосыворотки обследованных женщин и 40 мкг/мл гентамицина. Для оценки стимулированной продукции цитокинов в полученные клеточные суспензии добавляли по 20 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) производства АОО «Пан Эко» (Россия). Клеточные суспензии инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 100% влажности в атмосфере 5% СО2. После истечения срока культивирования супернатанты очищали цинтрифугированием при 800 g в течение 30 мин, собирали в стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и хранили до тестирования при — 30°C не более 6 мес.
Уровень цитокинов в культуральных средах определялся методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия) с помощью наборов реагентов ТОО «Протеиновый контур» (Россия). По данным титрования стандартных образцов строились калибровочные графики для каждого из цитокинов, по которым определялась концентрация ИЛ1ß, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОα в исследуемых образцах.
Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM II-300, с использованием программы «Primer Biostatistic 4. 03» для Windows’95. Для всех показателей полученных у женщин основной и контрольной группы определялись средние значения (М), а также стандартная ошибка среднего (т). Для оценки достоверности различий между значениями использовался критерий Стьюдента. Различия между показателями считались достоверными при р<0,05.
Результаты исследования
По нашим данным (табл. 1. ), спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1ß мононуклеарами, инфильтрирующими опухоль возрастает в процессе малигнизации доброкачественных опухолей яичников и снижения степени дифференцировки клеток рака. Однако, способность МНК опухоли отвечать на стимуляцию ФГА повышением уровня продукции этого цитокина резко снижена у всех больных ЭОЯ. Так, в ответ на стимуляцию мононуклеарные клетки, выделенные из доброкачественных и пограничных опухолей яичников, не отвечают достоверным повышением продукции ИЛ1ß, а МНК, выделенные из рака яичников, отвечают достоверным снижением уровня продукции этого цитокина.
Таблица 1. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1ß и ФНОα мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ
ИЛ1 ß, пкг/мл | ФНО α, лкг/мл | |||
Спонтанная продукция (М±m) | Стимулированная продукция (М±m) | Спонтанная продукция (М±m) | Стимулированная продукция (М±m) | |
Доброкачественные опухоли яичников (n=50) | 87,5±2,9 | 92,1±18,9 | 56,9±1,9 | 61,5±3,3 |
Пограничные опухоли яичников (n=30) | 94,9±10,5* | 97,0±11,6* | 63,5±3,7 | 68,9±9,7 |
Высокодифференциро - ванный рак (n=20) | 142,2±12,6** | 111,9±15,1* ↓ | 68,3±3,8* | 72,3±5,0 |
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30) | 181,5±12,7*** | 131,1±12,3** ↓ | 91,5±3,6*** | 100,3±4,5*** |
* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);
** отличия от доброкачественных и пограничных опухолей яичников (р<0,05);
*** отличия от доброкачественных, пограничных опухолей и высокодифференцированного рака яичников (р<0,05);
↑↓ достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).
Похожая закономерность отмечается и в отношении синтеза ФНОα (табл. 1. ), однако, увеличение уровня продукции этого цитокина МНК опухоли отмечается, начиная с рака яичников, и прогрессирует со снижением степени дифференцировки его клеток. При этом, стимулированная продукция ФНОα достоверно не отличается от спонтанной ни в одной из групп больных.
Полученные данные относительно продукции ИЛ1ß и ФНОα МНК больных ЭОЯ подтверждают факт увеличения цитотоксического потенциала мононуклеарных фагоцитов, инфильтрирующих опухоль у этих больных, прогрессирующую в процессе малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки клеток рака яичников. Отсутствие ответа МНК доброкачественных и пограничных опухолей в ответ на стимуляцию ФГА указывает на достижение ими максимальной активности, а снижение синтеза ИЛ1ß и ФНОα мононуклеарами, инфильтрирующими рак яичников, указывает на декомпенсацию противоопухолевой цитотоксичности мононуклеарных фагоцитов.
При изучении продукции МНК, выделенными из ткани опухоли, ИЛ2 (табл. 2. ) нами установлено, что спонтанная и стимулированная продукция этого цитокина снижается при малигнизации доброкачественных опухолей и уменьшении степени дифференцировки рака яичников. При этом, только МНК доброкачественных и пограничных опухолей отвечают увеличением стимулированной продукции ИЛ2, а мононуклеары рака яичников на стимуляцию ФГА достоверно не реагируют. Это убедительно указывает на снижение активности Т-хелперов 1 типа в реализации противоопухолевого иммунитета при малигнизации доброкачественных опухолей и прогрессирование рака яичников.
Таблица 2. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ2 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ
| ИЛ2, МЕ/мл | |
Спонтанная продукция (M±m) | Стимулированная продукция (М±m) | |
Доброкачественные опухоли яичников (n=50) | 108,8±1,5 | 114,9±2,4 ↑ |
Пограничные опухоли яичников (n=30) | 98,2±1,0* | 104,5±2,4*↑ |
Высокодифференциро - ванный рак (n=20) | 97,3±1,1* | 99,2±2,5* |
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30) | 88,7±1,3*** | 86,6±2,4*** |
Таблица 3.Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ4 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ
| ИЛ4, пкг/мл | |
Спонтанная продукция (М±m) | Стимулированная продукция (М±m) | |
Доброкачественные опухоли яичников (n=50) | 32,4+1,4 | 38,7±1,9 ↑ |
Пограничные опухоли яичников (n=30) | 32,1+0,7 | 29,6+1,4* |
Высокодифференциро - ванный рак (n=20) | 32,6±1,4 | 30,3+1,5* |
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30) | 29,7+0,9 | 26,1±0,8***↓ |
* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);
***отличия от доброкачественных, пограничных опухолей и высокодифференцированного рака яичников (р<0,05);
↑ ↓ достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).
Таблица 4. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ6 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ
| ИЛ6, пкг/мл | |
Спонтанная продукция (M±m) | Стимулированная продукция (М±m) | |
Доброкачественные опухоли яичников (n=50) | 957,7±12,9 | 1483,0±103,6 ↑ |
Пограничные опухоли яичников (n=30) | 996,3±58,6 | 1173,6±134,4 |
Высокодифференциро - ванный рак (n=20) | 1406,0±124,1** | 1206,0±110,2 |
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30) | 1550,0±177,6** | 1257,2±168,5 |
* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);
** отличия от доброкачественных и пограничных опухолей яичников (р<0,05);
↑ ↓ достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).
В отличие от ИЛ2, базальная продукция ИЛ4 (табл. 3.) мононуклеарными клетками опухоли достоверно не отличалась у больных ЭОЯ вне зависимости от характера опухолевого процесса. В то же время стимулированная продукция ИЛ4 достоверно сниснижается в процессе малигнизации доброкачественных опухолей, причем это снижение достигает своего максимума в ткани умеренно и низкодифференцированного рака яичников. Эти данные показывают, что активность Т-хелперов 2 типа остается стабильно высокой в ткани опухолей яичников с низким пролиферативным потенциалом опухолевых клеток, а при увеличении клеточной пролиферации в умеренно- и низкодифференцированном раке - снижается.
Полученные данные, относительно продукции ИЛ2 и ИЛ4 МНК, инфильтрирующими ЭОЯ показывают, что снижение активности Т-хелперов 1 типа в этих опухолях возникает, начиная с самых ранних этапов их малигнизации, причем это снижение нарастает в процессе прогрессирования опухоли. В то же время активность Т-хелперов 2 типа в ткани ЭОЯ остается на достаточно высоком уровне, вплоть до возникновения умеренно- и низкодифференцированного рака яичников с крайне высоким пролиферативным потенциалом опухолевых клеток.
По нашим данным (табл. 4. ), спонтанная продукция ИЛ6 мононуклеарами ЭОЯ возрастает только в раке яичников, вне зависимости от степени дифференцировки его клеток. Стимулированная продукция ИЛ6 не зависит от характера опухолевого роста и достоверно возрастает по сравнению с базальной только в доброкачественных опухолях яичников.
Подобная парадоксальная реакция МНК, инфильтрирующих ЭОЯ, в отношении продукции ИЛ6 в ответ на неспецифическую иммуностимуляцию может быть объяснена достижением максимальной активности клеток, продуцирующих эти цитокины, и истощением их компенсаторных возможностей.
Выводы
- Функциональная активность мононуклеарных фагоцитов, инфильтрирующих ЭОЯ возрастает при малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки рака яичников, что подтверждается повышением продукции этими клетками ИЛ 1ß и ФНОα.
- В процессе малигнизации доброкачественных опухолей яичников наблюдается снижение активности преимущественно Т-хелперов 1 типа, которое нарастает в процессе увеличения пролиферации опухолевых клеток.
- Нарушение активности Т- хелперов 2 типа возникает только в ткани умеренно- и низкодифференцированного рака яичников, клетки которого обладают наибольшей пролиферативной активностью.
- Высокий уровень продукции мононуклеарными клетками, инфильтрирующими опухоль ИЛ6 может быть одной из причин, тормозящих синтез цитокинов, обладающих противоопухолевой активностью, и ведущих к снижению противоопухолевого иммунитета у больных ЭОЯ на тканевом уровне.
Об авторах
Р. В. Павлов
Ставропольской государственной медицинской академия; НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН
Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
кафедра акушерства и гинекологии
Россия, Ставрополь; Санкт-ПетербургВ. А. Аксененко
Ставропольской государственной медицинской академия; НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН
Email: info@eco-vector.com
кафедра акушерства и гинекологии
Россия, Ставрополь; Санкт-ПетербургС. А. Сельков
Ставропольской государственной медицинской академия; НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН
Email: info@eco-vector.com
кафедра акушерства и гинекологии
Россия, Ставрополь; Санкт-ПетербургСписок литературы
- Автандилов Г. Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. — М.: РМАПО,1996. — 256 с.
- Бережная Н. М., Ковальчук Б. В., Осипова Е. В. Влияние продуктов культивирования опухолевых клеток различного гистогенеза на функциональную активность лимфоцитов крови человека и зависимости от чувствительности опухолевых биоптатов к ИЛ-2. // Экспериментальная онкология. — 1993. — Том. 10, № 3. - С. 46-50.
- Возианов А. Ф., Бутенко А. К., Зак К. П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. — Киев.: Наукова думка,1998. — 317 с.
- Павлов Р. В., Аксененко В. А., Криворучко А. Ю., Павленко Н. А. Продукция цитокинов лимфоцитами периферической крови больных эпителиальными опухолями яичников. //Журнал акушерства и женских болезней. — Выпуск 1, — том XLX, — 2001. — С. 37-40.
- Чердынцева Н. В., Полушина О. А., Кусмарцев С. А., Васильев Н. В. Сравнительная характеристика цитостатической и мембранотоксической опухолеассоциированных лимфоцитов. // Иммунология — № 3. — С. 55-57.
- Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 1968. — Vol. 21, № 3 — P. 77-82.
- Cohen S. B., Wattiez A., Stockheim D., Seidman D. S., Lidor A. L., Mashiach S., Goldenberg M. The accuracy of serum interleukin-6 and tumour necrosis factor as markers for ovarian torsion. //Hum. Reprod. — 2001. — Vol. 16, №10. -
- P. 2195-2197.
- Kryczek I., Grybos M., Karabon L., Klimczak A., Lange A. IL-6 production in ovarian carcinoma is associated with histiotype and biological characteristics of the tumour and influences local immunity. // Br. J. Cancer. — 2000. — Vol. 82, № 3, — P. 621-628.
- Nash M. A., Ferrandina G., Gordinier M., Loercher A., Freedman R. S. The role of cytokines in both the normal and malignant ovary. //Endocr Relat Cancer. — 1999. — Vol. 6, № 1. -P. 93-107.
- Schёondorf T., Engel H., Kurbacher С. M., Brenne U., Kolhagen H., Сёоhrіпg U. J., Scharl A., Mallmann P. Immunologic features of tumor-infiltrating lymphocytes and peripheral blood lymphocytes in ovarian cancer patients. // J. Soc. Gynecol. Investig. — 1998. — Vol. 5, № 2. — P. 102-107.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)