Cytokines production by mononuclear cells, infiltrating the epithelium tumour of ovaries

Full Text

Ролъ отдельных цитокинов в механизмах противоопухолевого иммунитета, а также возможности применения их в лечении опухолей разной локализации активно изучается на протяжении 20 лет [3]. Несмотря на это, особенности цитокинового обмена у больных эпителиальными опухолями яичников (ЭОЯ) изучены недостаточно. Имеющиеся литературные данные, посвященные этой проблеме, немногочисленны и неоднозначны. Большинством авторов, в том числе и нами, оценивался уровень цитокинов в сыворотке крови больных ЭОЯ и особенности их продукции иммунокомпетентными клетками периферической крови [4, 7, 9]. В то же время продукция цитокинов мононуклеарными клетками (МНК), инфильтрирующими ЭОЯ, практически не изучена, что не позволяет достоверно оценить их функциональную активность на финальном этапе реализации противоопухолевого иммунитета [8, 10].

Цель исследования

Изучить продукцию отдельных цитокинов МНК, инфильтрирующими эпителиальные опухоли яичников, в том числе интерлейкина- 1ß (ИЛ1ß) и фактора некроза опухоли-α (ФНОα), как цитокинов, обладающих противоопухолевой активностью и отражающих функциональное состояние мононуклеарных фагоцитов в смешанной культуре клеток, а также ИЛ2 и ИЛ4 — цитокинов, опосредующих противоопухолевую клеточную реакцию Т-лимфоцитов по 1 или 2 типу, и ИЛ6 — как цитокина, замыкающего реакции клеточного иммунитета.

Методы исследования

Были изучены особенности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов мононуклеарами, изолированными из ткани ЭОЯ, у 130 пациенток, находившихся на лечении в Ставропольском краевом онкологическом диспансере в период с 1998 по 2000 гг.

После клинического обследования, проведения УЗИ, КТ и гистологического исследования образцов удаленных опухолей все больные были распределены на 4 группы: 50 больных доброкачественными эпителиальными опухолями яичников,30 — пограничными опухолями яичников,20 — высокодифференцированным раком яичников и 30 — умеренно- и низкодифференцированным раком.

Степень дифференцировки клеток рака яичников оценивалась по методике, предложенной Г. Г. Автандиловым (1996) [1] и адаптированной нами относительно ЭОЯ. Учитывались площадь ядер опухолевых клеток, их плоидностъ, а также параметры активности областей организаторов ядрышек.

Изолированную из опухоли культуру МНК получали по методике, описанной Н. В. Чердынцевой и соавт. (1997) [5]. Для этого опухолевую ткань измельчали на кусочки размером 1х1х1 мм, затем инкубировали в ферментном коктейле, содержащем 0,01% коллагеназы (0,37 ЕД/мг «Serva»),0,01% дезоксирибонуклеазы II (262 КЕД/мг, «Serva») в течение 30 мин на магнитной мешалке в пластиковом стаканчике объемом 50мл при 37°C. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали от ферментов средой Хенкса и ресуспендировали в среде 199 [4].

Выделение мононуклеарных клеток из полученной клеточной суспензии осуществлялось на градиенте плотности Ficoll-Paque (р=1,077г/мл) производства «Pharmacya Fine Chemicals» (Швеция) по методу, описанному Воуит (1968) [6].

Культивирование мононуклеарных клеток, инфильтрирующих опухоль с целью моделирования условий, приближенных к внутренней среде организма, проводили по методике, предложенной Н. М. Бережной и соавт. (1993 г. ) [2]. Для этого к клеточной суспензии, содержащей МНК в конечной концентрации 2×106/мл среды 199, добавляли 10% аутосыворотки обследованных женщин и 40 мкг/мл гентамицина. Для оценки стимулированной продукции цитокинов в полученные клеточные суспензии добавляли по 20 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) производства АОО «Пан Эко» (Россия). Клеточные суспензии инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 100% влажности в атмосфере 5% СО2. После истечения срока культивирования супернатанты очищали цинтрифугированием при 800 g в течение 30 мин, собирали в стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и хранили до тестирования при — 30°C не более 6 мес.

Уровень цитокинов в культуральных средах определялся методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия) с помощью наборов реагентов ТОО «Протеиновый контур» (Россия). По данным титрования стандартных образцов строились калибровочные графики для каждого из цитокинов, по которым определялась концентрация ИЛ1ß, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОα в исследуемых образцах.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM II-300, с использованием программы «Primer Biostatistic 4. 03» для Windows’95. Для всех показателей полученных у женщин основной и контрольной группы определялись средние значения (М), а также стандартная ошибка среднего (т). Для оценки достоверности различий между значениями использовался критерий Стьюдента. Различия между показателями считались достоверными при р<0,05.

Результаты исследования

По нашим данным (табл. 1. ), спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1ß мононуклеарами, инфильтрирующими опухоль возрастает в процессе малигнизации доброкачественных опухолей яичников и снижения степени дифференцировки клеток рака. Однако, способность МНК опухоли отвечать на стимуляцию ФГА повышением уровня продукции этого цитокина резко снижена у всех больных ЭОЯ. Так, в ответ на стимуляцию мононуклеарные клетки, выделенные из доброкачественных и пограничных опухолей яичников, не отвечают достоверным повышением продукции ИЛ1ß, а МНК, выделенные из рака яичников, отвечают достоверным снижением уровня продукции этого цитокина.

 

Таблица 1. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ1ß и ФНОα мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ

	ИЛ1 ß, пкг/мл		ФНО α, лкг/мл
	Спонтанная продукция (М±m)	Стимулированная продукция (М±m)	Спонтанная продукция (М±m)	Стимулированная продукция (М±m)
Доброкачественные опухоли яичников (n=50)	87,5±2,9	92,1±18,9	56,9±1,9	61,5±3,3
Пограничные опухоли яичников (n=30)	94,9±10,5*	97,0±11,6*	63,5±3,7	68,9±9,7
Высокодифференциро - ванный рак (n=20)	142,2±12,6**	111,9±15,1* ↓	68,3±3,8*	72,3±5,0
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30)	181,5±12,7***	131,1±12,3** ↓	91,5±3,6***	100,3±4,5***

* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);

** отличия от доброкачественных и пограничных опухолей яичников (р<0,05);

*** отличия от доброкачественных, пограничных опухолей и высокодифференцированного рака яичников (р<0,05);

↑↓  достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).

 

Похожая закономерность отмечается и в отношении синтеза ФНОα (табл. 1. ), однако, увеличение уровня продукции этого цитокина МНК опухоли отмечается, начиная с рака яичников, и прогрессирует со снижением степени дифференцировки его клеток. При этом, стимулированная продукция ФНОα достоверно не отличается от спонтанной ни в одной из групп больных.

Полученные данные относительно продукции ИЛ1ß и ФНОα МНК больных ЭОЯ подтверждают факт увеличения цитотоксического потенциала мононуклеарных фагоцитов, инфильтрирующих опухоль у этих больных, прогрессирующую в процессе малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки клеток рака яичников. Отсутствие ответа МНК доброкачественных и пограничных опухолей в ответ на стимуляцию ФГА указывает на достижение ими максимальной активности, а снижение синтеза ИЛ1ß и ФНОα мононуклеарами, инфильтрирующими рак яичников, указывает на декомпенсацию противоопухолевой цитотоксичности мононуклеарных фагоцитов.

При изучении продукции МНК, выделенными из ткани опухоли, ИЛ2 (табл. 2. ) нами установлено, что спонтанная и стимулированная продукция этого цитокина снижается при малигнизации доброкачественных опухолей и уменьшении степени дифференцировки рака яичников. При этом, только МНК доброкачественных и пограничных опухолей отвечают увеличением стимулированной продукции ИЛ2, а мононуклеары рака яичников на стимуляцию ФГА достоверно не реагируют. Это убедительно указывает на снижение активности Т-хелперов 1 типа в реализации противоопухолевого иммунитета при малигнизации доброкачественных опухолей и прогрессирование рака яичников.

 

Таблица 2. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ2 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ

	ИЛ2, МЕ/мл
	Спонтанная продукция (M±m)	Стимулированная продукция (М±m)
Доброкачественные опухоли яичников (n=50)	108,8±1,5	114,9±2,4 ↑
Пограничные опухоли яичников (n=30)	98,2±1,0*	104,5±2,4*↑
Высокодифференциро - ванный рак (n=20)	97,3±1,1*	99,2±2,5*
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30)	88,7±1,3***	86,6±2,4***

 

Таблица 3.Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ4 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ

	ИЛ4, пкг/мл
	Спонтанная продукция (М±m)	Стимулированная продукция (М±m)
Доброкачественные опухоли яичников (n=50)	32,4+1,4	38,7±1,9 ↑
Пограничные опухоли яичников (n=30)	32,1+0,7	29,6+1,4*
Высокодифференциро - ванный рак (n=20)	32,6±1,4	30,3+1,5*
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30)	29,7+0,9	26,1±0,8***↓

* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);

***отличия от доброкачественных, пограничных опухолей и высокодифференцированного рака яичников (р<0,05);

↑ ↓ достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).

 

Таблица 4. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ6 мононуклеарными клетками, инфильтрирующими ЭОЯ

	ИЛ6, пкг/мл
	Спонтанная продукция (M±m)	Стимулированная продукция (М±m)
Доброкачественные опухоли яичников (n=50)	957,7±12,9	1483,0±103,6 ↑
Пограничные опухоли яичников (n=30)	996,3±58,6	1173,6±134,4
Высокодифференциро - ванный рак (n=20)	1406,0±124,1**	1206,0±110,2
Умеренно- и низкодифференцированный рак (n=30)	1550,0±177,6**	1257,2±168,5

* отличия от доброкачественных опухолей яичников (р<0,05);

** отличия от доброкачественных и пограничных опухолей яичников (р<0,05);

↑ ↓ достоверное повышение или снижение стимулированной продукции цитокинов МНК (р<0,05).

 

В отличие от ИЛ2, базальная продукция ИЛ4 (табл. 3.) мононуклеарными клетками опухоли достоверно не отличалась у больных ЭОЯ вне зависимости от характера опухолевого процесса. В то же время стимулированная продукция ИЛ4 достоверно сниснижается в процессе малигнизации доброкачественных опухолей, причем это снижение достигает своего максимума в ткани умеренно и низкодифференцированного рака яичников. Эти данные показывают, что активность Т-хелперов 2 типа остается стабильно высокой в ткани опухолей яичников с низким пролиферативным потенциалом опухолевых клеток, а при увеличении клеточной пролиферации в умеренно- и низкодифференцированном раке - снижается.

Полученные данные, относительно продукции ИЛ2 и ИЛ4 МНК, инфильтрирующими ЭОЯ показывают, что снижение активности Т-хелперов 1 типа в этих опухолях возникает, начиная с самых ранних этапов их малигнизации, причем это снижение нарастает в процессе прогрессирования опухоли. В то же время активность Т-хелперов 2 типа в ткани ЭОЯ остается на достаточно высоком уровне, вплоть до возникновения умеренно- и низкодифференцированного рака яичников с крайне высоким пролиферативным потенциалом опухолевых клеток.

По нашим данным (табл. 4. ), спонтанная продукция ИЛ6 мононуклеарами ЭОЯ возрастает только в раке яичников, вне зависимости от степени дифференцировки его клеток. Стимулированная продукция ИЛ6 не зависит от характера опухолевого роста и достоверно возрастает по сравнению с базальной только в доброкачественных опухолях яичников.

Подобная парадоксальная реакция МНК, инфильтрирующих ЭОЯ, в отношении продукции ИЛ6 в ответ на неспецифическую иммуностимуляцию может быть объяснена достижением максимальной активности клеток, продуцирующих эти цитокины, и истощением их компенсаторных возможностей.

Выводы

1. Функциональная активность мононуклеарных фагоцитов, инфильтрирующих ЭОЯ возрастает при малигнизации доброкачественных опухолей и снижении степени дифференцировки рака яичников, что подтверждается повышением продукции этими клетками ИЛ 1ß и ФНОα.
2. В процессе малигнизации доброкачественных опухолей яичников наблюдается снижение активности преимущественно Т-хелперов 1 типа, которое нарастает в процессе увеличения пролиферации опухолевых клеток.
3. Нарушение активности Т- хелперов 2 типа возникает только в ткани умеренно- и низкодифференцированного рака яичников, клетки которого обладают наибольшей пролиферативной активностью.
4. Высокий уровень продукции мононуклеарными клетками, инфильтрирующими опухоль ИЛ6 может быть одной из причин, тормозящих синтез цитокинов, обладающих противоопухолевой активностью, и ведущих к снижению противоопухолевого иммунитета у больных ЭОЯ на тканевом уровне.

About the authors

R. V. Pavlov

Stavropol State Medical Academy; Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Otta RAMS

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Stavropol; Saint Petersburg

V. A. Aksionenko

Stavropol State Medical Academy; Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Otta RAMS

Email: info@eco-vector.com

Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Stavropol; Saint Petersburg

S. A. Selkov

Stavropol State Medical Academy; Research Institute of Obstetrics and Gynecology named after D.O. Otta RAMS

Email: info@eco-vector.com

Department of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, Stavropol; Saint Petersburg

References

Supplementary files