Устойчивость chlamydia trachomatis к антибиотикам

Аннотация

В обзоре проанализированы данные литературы, освещающей различные аспекты устойчивости Chlamydia trachomatis к антибиотикам: возможные молекулярные механизмы, клиническое значение резистентности, определенной in vitro, а также роль антибиотиков в индукции персистенции.

Полный текст

Chlamydia trachomatis - облигатные внутриклеточные бактерии, вызывающие широкий спектр заболеваний у человека. В настоящее время С. trachomatis является самым распространенным инфекционным агентом, передающимся половым путем. Клиническими проявлениями хламидийной инфекции у женщин являются цервициты, уретриты, сальпингиты и эндометриты, у мужчин — уретриты и эпидидимиты. Отличительной особенностью хламидийной инфекции является то, что у 50~70% женщин и 30-50% мужчин заболевание протекает бессимптомно. В этой связи наибольшую опасность хламидии представляют для репродуктивного здоровья женщины, так как вовремя не установленная и поэтому не пролеченная инфекция может вызвать поражения органов малого таза, внематочную беременность и трубное бесплодие.

Механизмы действия тетрациклинов, макролидов и фторхинолонов

Для лечения хламидийных инфекций традиционно используют тетрациклины, макролиды и фторхинолоны [38]. К группе тетрациклинов относятся родственные по химическому строению, антимикробному спектру и механизму действия природные антибиотики, продуцируемые видами Streptomyces, и их полу синтетические производные: тетрациклин, морфоциклин, окситетрациклин, метациклин, доксициклин и другие. Тетрациклины — антибиотики широкого спектра действия, оказывающие на чувствительные микроорганизмы бактериостатический эффект. Тетрациклины активны в отношении грам-положительных и грам- отрицательных бактерий, а также спирохет, риккетсий, хламидий и микоплазм. Ингибирующий эффект тетрациклинов обусловлен их взаимодействием с комплексом «рибосома — мРНК», что приводит к подавлению синтеза белка.

Макролиды — продуцируемые некоторыми видами Streptomyces антибиотики широкого спектра действия — характеризуются наличием в их молекуле макроциклического лактонного кольца. Известны природные (эритромицин, олеандомицин, джозамицин и спирамицин) и полу синтетические (рокситромицин, кларитромицин и др.) препараты, которые применяются преимущественно для лечения грам-положительных (гноеродных кокков, клостридий), некоторых грам-отрицательных бактерий (бруцелл, гемофильных палочек), а также внутриклеточных паразитов — риккетсий, хламидий и др. Макролиды проявляют бактериостатический эффект, связываясь с 50S субъединицей рибосомы, что приводит к нарушению синтеза белка.

Фторхинолоны — фторированные производные налидиксовой кислоты и других хинолонов, спектр активности которых в большей степени включает грам-отрицательные бактерии. Фторхинолоны обладают бактерицидным эффектом, ингибируя ДНК-гиразу и топоизомеразу IV — ферменты, участвующие в репликации ДНК.

Формирование резистентности к тетрациклинам, макролидам и фторхинолонам

Устойчивость микроорганизмов к антимикробным средствам разделяют на естественную (природную) и приобретенную. Естественная устойчивость относится к видовым признакам и связана с отсутствием у микроорганизма мишени действия антибиотика или непроницаемостью клеточной стенки для определенных лекарственных средств. Появление у бактерий приобретенной резистентности не обязательно сопровождается снижением клинической эффективности антибиотика.

Механизмы формирования резистентности микроорганизмов к антибиотикам сложны и разнообразны. К основным механизмам антибиотикорезистентности бактерий относятся:

• инактивация антибиотика в результате его деструкции или модификации;
• изменение мишени действия антибиотика;
• уменьшение проницаемости клеточной стенки;
• выкачивание антибиотика энергозависимым способом (активный эффлюкс);
• возникновение у микроорганизма альтернативного пути образования жизненно важного метаболита, который заменяет основной путь, блокированный антибиотиком (метаболический «шунт»).

За последние несколько десятилетий фармацевтическая промышленность создала много синтетических и полу синтетических агентов, способных противостоятъ большинству ферментов, действие которых приводит к деградации или модификации природных антибиотиков. По этой причине менее специфические механизмы резистентности, такие как уменьшение проницаемости клеточной стенки и активный эффлюкс, вероятно, становятся более актуальными в клинической практике. Большинство антибиотиков легко попадает внутрь грам-положительных бактерий через пептидогликановый слой, в то время как наружная мембрана грам-отрицательных бактерий, в том числе и хламидий, служит барьером для многих из них, особенно для препаратов с выраженной гидрофильностью (тетрациклины, макролиды и др.) [36]. Поступление веществ извне у таких бактерий обеспечивают специальные белки наружной мембраны — порины, которые образуют специфические водные каналы. Мутационные процессы, изменяющие структуру таких каналов и/или уменьшающие их количество, снижают проницаемость клеточной оболочки. Следует отметить, однако, что такое снижение проницаемости клеточной оболочки само по себе очень редко приводит к значимому уровню резистентности [36].

Другим механизмом резистентности бактерий к антибиотикам является активный эффлюксэнергозависимый процесс выкачивания антибиотика из клетки. Осуществляется такое выкачивание эффлюксными транспортерами, которые у бактерий можно разделить на 4 семейства на основании их структуры, функционирования и гомологии [36]. Системы эффлюкса грам-отрицательных бактерий обычно состоят из трех компонентов: эффлюкс- транспортера, локализованного в цитоплазматической мембране, канала наружной мембраны и белка-помощника, который соединяет эффлюкс-транспортер и канал наружной мембраны. Химический агент проникает внутрь клетки через пориновые каналы наружной мембраны, частично встраиваясь в цитоплазматическую мембрану. Транспортер захватывает молекулы этого вещества и выбрасывает их наружу через свой канал [37]. Естественные субстраты бактериальных эффлюксных систем в большинстве случаев неизвестны: предполагается, что они участвуют в удалении токсичных веществ из цитоплазмы и цитоплазматической мембраны бактериальной клетки [9]. Активный эффлюкс считается основным механизмом резистентности к тетрациклинам: эффлюксные системы кодируются как хромосомными (envD, техВ), так и плазмидными (tet А) генами [ 14, 36].

Основным механизмом формирования резистентности к макролидам и фторхинолонам является изменение мишени действия антибиотика. Устойчивость к макролидам в большинстве случаев связана с изменениями в 23S рРНК: метилированием аденина или нуклеотидными заменами в пептидилтрансферазной петле домена V. Метилирование аденина в позиции 2058 (здесь и далее нумерация оснований по Esherichia соlі) осуществляет аденин-специфическая метилтрансфераза (метилаза) — фермент, кодируемый геном еrт [13, 46]. Кроме модификации аденина, резистентность к макролидам могут вызывать нуклеотидные замены в гене, кодирующем рРНК (rrп). В соответствии со вторичной структурой 23S субъениницы РНК рядом с А2058 располагаются G2057 и С2611; эти основания связаны между собой водородными связями и обусловливают способность данного фрагмента взаимодействовать с макролидами. Мутации в этих позициях приводят к разрушению водородной связи между ними, обеспечивая таким образом устойчивость к макролидам [46].

Активный эффлюкс также может определять устойчивость бактерий к макролидам [39]. Кроме того, описаны ферменты, инактивирующие макролиды, например, посредством их гликозилирования [24], однако распространение и клиническое значение этих ферментов невелико.

На основании многочисленных наблюдений был сделан вывод о том, что мишенью действия фторхинолонов у грам-отрицателъных бактерий является ДНК- гираза, у грам-положительных — топоизомераза IV [20]. ДНК-гираза состоит из двух пар субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и дуrВ соответственно.

ДНК-гираза катализирует АТФ- зависимое отрицательное суперскручивание ДНК и вовлечена в процессы репликации, рекомбинации и транскрипции [45]. Топоизомераза IV - это тетрамер, состоящий из двух пар субъединиц РаrС и РаrЕ, гомологичных субъединицам GyrA и GyrB соответственно; топоизомераза IV участвует в разделении реплицированной хромосомы [ 1].

Исследование резистентных к фторхинолонам Esherichia coli показало наличие точечных нуклеотидных замен в гене gyrA, приводящих к аминокислотным заменам Ala 67 на Ser, Ser 83 на Leu или Trp, Gln 106 на Ser [47]. Фрагмент гена gyrA E.coli, кодирующий аминокислотную последовательность с 67 по 106 аминокислоту (область активного центра фермента), был назван участком, определяющим резистентность к фторхинолонам (quinolone- resistance-determining region — QRDR). Позднее было показано наличие точечных мутаций в районе гена раrС, гомологичном QRDR gyrA, которые также определяли резистентность к фторхинолонам у E.coli [29]. В ходе дальнейших исследований выяснилось, что точечные мутации именно в QRDR gyrA и раrС обеспечивали высокий уровень резистентности к фторхинолонам штаммов Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Enterococcus [ecaelis, Pseudomonas aeruginosa и других микроорганизмов [7, 32, 27, 35].

Мутации в генах, кодирующих ДНК-гиразу и топоизомеразу IV —не единственный механизм формирования устойчивости микроорганизмов к фторхинолонам. В последние годы появились сообщения о появлении резистентности, связанной с активным эффлюксом; у штаммов с высоким уровнем резистентности к фторхинолонам она обеспечивается сочетанием эффлюкса с изменением мишени [21, 26].

Антибиотикорезистентность хламидий и возможные механизмы ее формирования

В последние годы появилось немало сообщений о выделении клинически и in vitro резистентных хламидий [10, 25, 30, 41], однако до сих пор нет ясного понимания ни клинической значимости этой резистентности, ни механизмов ее формирования. В работе S. Dessus-Babus (1998) при изучении лабораторных мутантов, выращенных на субингибирующих концентрациях фторхинолонов офлоксацина и спарфлоксацина, было показано, что точечная мутация в QRDR гена gyrA, ведущая к замене Ser 83 на Ilе, увеличивает минимальную ингибирующую концентрацию офлоксацина в 60 раз, спарфлоксацина — в 1000 раз [16]. Авторы работы предполагают, что этот механизм — изменение ДНК-гиразы и топоизомеразы IV — может быть задействован в формировании устойчивости хламидий в ходе терапии фтор хинолонами; на сегодняшний день, однако, никаких данных относительно клинических изолятов не получено.

Многократное выявление хламидий у одного пациента иногда после нескольких курсов антихламидийной терапии — явление не редкое [2, 8, 15, 28, 31, 34, 41], хотя в полной мере оценить его масштабы весьма затруднительно, так как контроль излеченности далеко не везде принят в клинической практике. Более того, до недавнего времени при выяснении, является повторная инфекция следствием рецидива или реинфекции, полагаться приходилось в основном на слова пациента. Применение методов генотипирования, а именно секвенирование фрагментов гена отр1, кодирующего основной белок наружной мембраны МОМР (major outer membrane protein), в значительной мере позволяет ответить на вопрос о вероятности реинфекции [15]. Очевидно, однако, что генотипирование хламидий не дает ответа на этот вопрос, если инфицирование происходит от одного и того же партнера.

Одним из самых интригующих вопросов для клиницистов и микробиологов на сегодняшний день является вопрос о рецидивирующей хламидийной инфекции.

Причинами возникновения рецидивов хламидийной инфекции считают:

а)   назначение неадекватного лечения или нарушение пациентом предписанной схемы лечения;

б)   резистентность хламидий к антибиотикам;

в)   способность хламидий к персистенции — длительному выживанию внутри клетки-хозяина, что, в свою очередь, может быть самым сложным и тесным образом связано с антибиотикорезистентностью хламидий.

Персистенция бактерий, как известно, обусловлена их способностью адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Такого рода фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков микроорганизма называют модификациями, которые, в отличие от мутаций, хотя и контролируются геномом, наследственно не закрепляются. По существу, модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микроорганизмов или всей популяции в целом в ответ на стресс и проявляются в изменении морфологических, биохимических, антигенных и других признаков, что позволяет им выживать и поддерживать на должном уровне численность своей популяции. После устранения факторов, вызвавших образование модификации, микроорганизмы возвращаются к исходному фенотипу. Биохимической основой модификации является контролируемая регуляторными генами индукция или репрессия соответствующих структурных генов. Примером модификации

может служитъ способность некоторых микроорганизмов образовывать под действием пенициллина L-формы, лишенные клеточной стенки, а вместе с ней и мишеней действия некоторых антибиотиков, а также структур, распознаваемых защитными факторами макроорганизма. L-формы сохраняют свою жизнеспособность и даже способность размножаться, а затем вновь возвращаться к исходной форме после прекращения действия пенициллина.

Под термином «персистенция хламидий» принято понимать длительное существование хламидий внутри клетки-хозяина в живом, но некульпивируемом виде. Персистенция хламидий — это отклонение их жизненного цикла от нормального, которое может бытъ вызвано целым рядом факторов, включая антибактериальную терапию.

Жизненный цикл хламидий состоит из чередования двух функционально и морфологически различающихся форм — инфекционных внеклеточных элементарных телец (ЭТ) и репродуктивных внутриклеточных ретикулярных телец (РТ). ЭТ прикрепляются к чувствительным клеткам и проникают в них путем эндоцитоза. В течение первых двух часов ЭТ начинают дифференцироваться в РТ: ослабляются дисульфидные связи между цистеин-богатыми белками наружной мембраны, вследствие чего повышается ее проницаемость, усиливается транспорт питательных веществ и возрастает метаболическая активность [5, 42]. В это же время происходит деконденсация хламидийной хромосомы и начинается экспрессия генов, продукты которых участвуют в процессах транскрипции, трансляции и созревания белков, а также генов, кодирующих белки, — медиаторы взаимодействия хламидийного включения и клетки-хозяина [40]. По мере созревания РТ увеличиваются в размере; приблизительно через двенадцать часов после инфицирования они начинают делиться. Во время активного деления ретикулярных телец синтезируются ферменты гликолиза, пентозофосфатного «шунта» и других метаболических путей [23], некоторые структурные компоненты наружной мембраны (например, МОМР), клеточной стенки, системы секреции III типа и др. [ 19, 44]. Примерно через восемнадцать часов после инфицирования клетки хламидиями начинается дифференциация РТ в ЭТ: происходит реконденсация хламидийной хромосомы и экспрессия гистоноподобного белка Нс1, а также некоторых белков наружной мембраны (например, Отр3) и др. [40]. Жизненный цикл хламидий завершается лизисом клетки через 48-72 часа в зависимости от штамма и условий культивирования.

Отклонение цикла развития хламидий от нормального может бытъ индуцировано целым рядом факторов самой разной природы. На многочисленных клеточных моделях было показано, что персистенцию хламидий могут вызывать цитокины (интерферон ?), антибиотики (пенициллин, хлор- тетрациклин, эритромицин, сульфонамиды, рифампин, азитромицин, ципрофлоксацин и др.), а также истощение культуры по некоторым аминокислотам (триптофану и др.) [3~6, 17, 18]. In vitro персистенция хламидий проявляется отсутствием выраженного роста, ограниченной метаболической активностью, неспособностью к репродукции и инфицированию других клеток. При иммунофлюоресцентном анализе персистирующих хламидий наблюдаются аберрантные — нетипичных размера и морфологии - внутриклеточные включения, которые, по данным электронной микроскопии, характеризуются наличием увеличенных РТ и практически полным отсутствием ЭТ [5, 10]. Авторы отмечают, что изменения в развитии хламидий, индуцированные перечисленными выше факторами, являются обратимыми: после удаления из инкубационной среды медиатора персистенции возобновляется деление хламидий и продукция ЭТ, способных инфицировать свежий монослой.

В какой мере персистенция хламидий, описанная в экспериментах in vitro, отражает ситуацию in vivo, на сегодняшний день неизвестно. Очевидно, что клеточные модели имеют целый ряд ограничений, и самым существенным из них является отсутствие факторов макроорганизма, в том числе и иммунных, которые могут бытъ задействованы в установлении персистенции и последующей реактивации хламидий. По образному выражению G.L. Byrne (2001), хламидии, по-видимому, обладают способностью при любом негативном воздействии включать «тормоз репликации» и замедлятъ таким образом клеточное деление [11]. Это событие сопровождается изменениями, которые, возможно, имеют отношение к патогенному потенциалу хламидий и позволяют им устанавливать длительное взаимодействие с клеткой-хозяином. Косвенными доказательствами персистенции хламидий in vivo может служитъ обнаружение хламидийной ДНК в биопсийных материалах эндометрия и фаллопиевых труб, взятых у женщин с бесплодием; при этом выделить хламидии в культуре клеток не удавалось [12].

В настоящее время усилия многих исследователей направлены на выявление молекулярных механизмов устойчивости хламидий к антибиотикам, а также взаимосвязи между персистенцией хламидий и их антибиотикорезистентностью. Несмотря на то, что сообщения о резистентности in vitro Chlamydia trachomatis стали появляться с 1980 года [33], вопрос о клинической значимости этого феномена до сих пор остается открытым. Так, в работе R. В. Jones с соавт. (1990) были описаны клинические изоляты, резистентные in vitro к тетрациклину, доксициклину, эритромицину и клиндамицину [25]. Пациенты, от которых были получены эти мультирезистентные штаммы, после лечения миноциклином (2 пациента) и доксициклином (1 пациент) через несколько недель обследовались снова: результаты культуральных тестов были отрицательными. А. Н. Van der Willigen (1988) и Т. М. Hooton с соавт. (1990) выявили высокий показатель рецидивов при лечении острых урогенитальных хламидийных инфекций ципрофлоксацином, в то время как в культуре клеток рост хламидий, выделенных от этих пациентов, ципрофлоксацином эффективно подавлялся [22, 43]. J. Somani с соавт. (2000) опубликовали работу, в которой неудачи антихламидийной терапии азитромицином, напротив, согласовались с данными in vitro тестирования клинических изолятов: все 3 описанных изолята были устойчивы к высоким концентрациям доксициклина, азитромицина и офлоксацина. Более того, авторы показали, что именно рецидив, а не реинфекция имел место в каждом из 3 случаев. Секвенирование гена отр.1 подтвердило генетическую идентичность штаммов, выделенных до лечения и во время рецидива [41].

Наиболее масштабное исследование персистенции хламидий с точки зрения актуальности этого явления в клинике было проведено D. Dean и соавт. (2000) [15]. При ретроспективном анализе клинических изолятов, полученных от 11 212 женщин в течение 10 лет, было выявлено, что 552 женщины имели 3 и более эпизода цервикальной хламидийной инфекции в течение 2 лет и более. Из этих 552 женщин 130 (24%) имели повторные инфекции, вызванные одним и тем же серотипом хламидий. Для генотипирования было выбрано 45 изолятов, полученных от 7 женщин с рецидивирующей хламидийной инфекцией продолжительностью от 2 до 5 лет. Отр1 -генотипирование показало, что 5 женщин из 7 имели один и тот же генотип хламидий при каждом эпизоде. Кроме того, методом лигазной цепной реакции (ЛЦР) были проанализированы отрицательные в культуре клеток пробы, полученные от этих пациенток в разное время между эпизодами хламидийной инфекции. Многие из них дали положительные ЛЦР-результаты, что, по мнению авторов, также может служитъ косвенным доказательством персистенции хламидий. Особого внимания заслуживает тот факт, что при определении чувствительности изолятов хламидий (по одному от каждой из 7 женщин) к доксициклину и азитромицину — а именно эти антибиотики использовались для антихламидийной терапии — только у одного продемонстрировано повышенное значение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) по сравнению с контрольным чувствительным штаммом. Авторы работы заключили, что причиной персистенции хламидий в данных случаях с очень небольшой вероятностью могла служитъ их устойчивость к антибиотикам.

Почему персистирующие хламидии не могут так же эффективно, как и нормально развивающиеся, элиминироваться в ходе антибактериальной терапии? Если рассматривать персистенцию хламидий как реакцию на негативное воздействие, проявляющуюся в изменении морфологических, биохимических и антигенных: характеристик этого микроорганизма, то можно предположитъ, что уменьшение чувствительности к антибиотикам является следствием этих изменений. Так, в экспериментах с Esherichia coli показано, что кислородный стресс, которому подвержены патогенные бактерии в тканях хозяина, индуцировал целый ряд адаптивных реакций, и некоторые из них — снижение синтеза порина OmpF и, возможно, активизация эффлюксных систем — приводили к фенотипической резистентности к тетрациклину, фторхинолонам и ампициллину [36].

Совершенно очевидно, что еще предстоит проделать огромную работу, чтобы прийти к глубокому и ясному пониманию всей совокупности процессов, происходящих в инфицированном хламидиями макроорганизме, а также механизмов, регулирующих взаимоотношения хламидий с клеткой-хозяином. Эти знания должны создать прочную теоретическую основу для обеспечения рациональной диагностики и терапии хламидийной инфекции.