Изучение насыщения тканей дакриостомы Митомицином-С

Полный текст

Актуальность проблемы

Митомицин-С — алкилирующий антибиотик, синтезируемый актиномицетами Streptomyces caespitosus, обладающий ингибирующим действием на синтез ДНК, клеточной РНК и белка. Он, в частности, подавляет синтез коллагена фибробластами, что приводит к ослаблению фибротизации в зоне хирургического вмешательства [1, 2]. В дакриологии Митомицин-С используют для профилактики избыточного рубцевания области сформированной дакриостомы. Впервые его применили Urugba et al. в 1997 г. Авторы вводили Митомицин-С во время операции в область дакриостомы аппликационно в концентрации 0,5 мг/мл на 2,5 мин и оценивали его эффективность по данным морфологического исследования. Было доказано, что местное применение Митомицина-С вызывает межклеточный отёк, изменения в митохондриях и ядре клетки. Был сделан вывод, что применение Митомицина-С теоретически может повысить результативность дакриоцисториностомии [3]. В дальнейшем многие исследователи применяли Митомицин-С также интраоперационно, варьируя концентрацию препарата от 0,2 до 0,5 мг/мл [4, 5] и время экспозиции от 2 до 10 мин [6, 7]. Эффективность операций с применением препарата, по данным различных авторов, составляет от 78,5 до 100 % случаев [8].

В России Митомицин-С впервые применил В.Г. Белоглазов и др. На заключительном этапе эндоназальной дакриоцисториностомии по Весту в модификации Белоглазова авторы вводили турунду с Митомицином-С в концентрации 0,5 мг/мл в область дакриостомы на 5 мин. Срок наблюдения составил 6 месяцев. Положительные результаты в основной группе составили 93,2 % случаев, в контрольной — 72,5 % случаев, таким образом эффективность применения Митомицина-С была подтверждена клинически [9].

Ряд исследователей доказали эффективность применения Митомицина-С при повторных операциях [10], другие, наряду с применением Митомицина-С, проводили интубацию дакриостомы силиконовым имплантатом [7, 11]. Учитывая разнообразие полученных результатов, а также нестандартизированность клинических исследований, сделать однозначные выводы о роли Митомицина-С в предотвращении избыточного рубцевания и, как следствие, рецидива облитерации слезоотводящих путей не представляется возможным.

В 2013 г. M.J. Ali et al. провели исследование на культуре фибробластов слизистой оболочки полости носа, изучая цитопатическое действие Митомицина-С в различных разведениях. Было показано, что применение препарата с антифибротической целью наиболее оправдано в концентрации 0,2–0,3 мг/мл [12]. Одновременно с этим авторы при помощи электронной микроскопии изучили биопсийный материал слизистой оболочки полости носа после эндоназальной дакриоцисториностомии с применением Митомицина-С аппликационно в концентрации 0,2 мг/мл и экспозицией 3 минуты. Было доказано, что аппликационное применение Митомицина-С вызывает ультраструктурные изменения, затрагивающие эпителий, сосуды и фибробласты [13].

Таким образом, к настоящему времени накоплено достаточно сведений о возможности использования Митомицина-С в качестве антифибротического агента, подтвержденных исследованиями in vitro.

Неоднозначность полученных результатов его применения в клинике гипотетически может быть связана с недостаточной концентрацией препарата в тканях области дакриостомы, однако работ по изучению данного вопроса проведено не было. Современные методы химического анализа дают возможность определить крайне низкие концентрации исследуемого препарата в биологическом объекте. Изучение фармакокинетики предполагает анализ изменения концентрации препарата с течением времени, что требует наличия образцов тканей, полученных через определённые промежутки времени. Методика анализа подразумевает изучение изолированного стандартного по массе навеска ткани, насыщенного исследуемым препаратом. Высокоэффективная жидкостная хроматография — масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС) имеют адекватную чувствительность и позволяет проводить исследование в образцах тканей минимальной массы, что даёт возможность выполнить клиническое исследование максимально безопасно.

Цель работы: определить концентрацию Митомицина-С в тканях области дакриостомы при аппликационном способе его применения при эндоскопической эндоназальной дакриоцисториностомии.

Материал и методы

В ходе моноцентрового рандомизированного открытого проспективного исследования было обследовано 30 пациентов (30 случаев) с облитерацией слезоотводящих путей на уровне шейки слёзного мешка, из них 26 женщин (26 случаев) и 4 мужчин (4 случая) в возрасте 63 ± 15 лет. Исследование было проведено после одобрения локального этического комитета. Пациентам была разъяснена суть предстоящего исследования, и получено информированное добровольное согласие каждого пациента.

В исследование не были включены пациенты с травматическими повреждениями слезоотводящих путей и их вторичными изменениями, после ранее проведённых хирургических вмешательств на слезоотводящих путях, а также пациенты с заболеваниями полости носа и его придаточных пазух, требовавшими лечения. Было проведено стандартное офтальмологическое и дакриологическое обследование. Жалобы на слезотечение оценивали по шкале Munk. Всем пациентам была проведена лакримальная менискометрия при помощи оптической когерентной томографии, эндоскопия полости носа и мультиспиральная компьютерная томография с контрастированием слезоотводящих путей.

Эндоскопическую эндоназальную дакриоцисториностомию проводили по методике P. Wormald, однако при формировании дакриостомы медиальную стенку слёзного мешка иссекали по периметру костного «окна», а фрагмент слизистой оболочки полости носа резецировали до уровня заднего края дакриостомы. Всем пациентам на заключительном этапе операции в область сформированной дакриостомы вводили турунду, обработанную 2 мл Митомицина-С в концентрации 0,2 мг/мл на 3 минуты. После удаления турунды слезоотводящие пути промывали физиологическим раствором. Всем пациентам под контролем 30° оптики диаметром 3,4 мм (Karl Storz, Германия) проводили биопсию слизистой оболочки полости носа и слёзного мешка. Через 30 минут осуществляли вторую биопсию, на 1-е сутки — третью.

Перед анализом полученные образцы помещали в 1 мл деионизированной воды, после чего взвешивали на прецизионных весах (Sartorius AG, Германия) с точностью до 0,001 г и выдерживали в ультразвуковой ванне WiseClean (Daihan Scientific, Корея) в течение 15 минут. Образцы хранили не более суток при температуре 5 °С. Определяли концентрацию препарата в полученном растворе и, относя её к массе соответствующего образца ткани, находили концентрацию Митомицина-С в исходном образце ткани.

Определение Митомицина-С проводили методом ВЭЖХ-МС. Исследование выполняли на жидкостном хроматографе Agilent 1260 (Agilent, США) с масс-спектрометрическим детектором Maxis Impact (Bruker, Германия) с электрораспылительной ионизацией, квадрупольным и времяпролётным масс-анализаторами (рис. 1). Для разделения использовали колонку Zorbax SB-C18150 мм × 2,1 мм × 5 мкм (Agilent, CША), режим элюирования: изократический, 100 % ацетонитрил (JT Baker, Нидерланды), скорость подвижной фазы — 0,25 мл/мин. Общее время анализа — 2,1 мин.

 

Рис. 1. Масс-спектрометрический детектор Maxis Impact (Bruker, Германия)

 

 

Сравнение клинических результатов хирургического вмешательства проводили с результатами 30 случайно выбранных аналогичных операций, которые были выполнены в клинике с января по ноябрь 2015 г. без применения Митомицина-С.

Мониторинг результатов лечения проводили еженедельно в течение 1 месяца после операции, затем через 3 и 6 месяцев. Во время заключительного исследования определяли жалобы пациентов по шкале Munk, результаты теста с исчезновением красителя, высоту слёзного мениска при помощи оптической когерентной томографии, проходимость слезоотодящих путей при промывании, результаты эндоскопического исследования полости носа и области дакриостомы. Использовали следующие критерии оценки результатов лечения: «выздоровление» и «улучшение» (положительные результаты), «рецидив» (отрицательный результат) [14].

Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи программы MS Excel 2007, вычисляя среднее значение признака в статистической выборке и его стандартное отклонение.

Результаты и обсуждение

При определении концентрации Митомицина-С в исходных образцах ткани было обнаружено, что непосредственно после аппликации концентрация препарата составила 0,626 ± 0,176 мкг/г. Через 30 минут концентрация препарата снижалась до 0,23 ± 0,06 мкг/г. Через сутки после операции препарата в образцах ткани обнаружено не было (рис. 2).

 

Рис. 2. Зависимость концентрации Митомицина-С, мкг/г, от времени

 

 

Клинические результаты, хирургического лечения представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Клинические результаты хирургического лечения

Table 1. Surgery clinical results

Период	Оценка выраженности слезотечения по Munk, баллы	Тест с исчезновением красителя (носовая проба), случаи (%)		Высота слёзного мениска, мм
До операции	3,8 ± 0,8	Положительный	0 (0 %)	0,67 ± 0,13
		Отрицательный	30 (100 %)
После операции	1,1 ± 0,3	Положительный	26 (86,7 %)	0,26 ± 0,09
		Отрицательный	4 (13,3 %)

 

При заключительном эндоскопическом осмотре через 6 месяцев после операции эпителиальная выстилка области дакриостомы была визуализирована у 26 пациентов, рубцовая ткань, закрывающая область сформированной дакриостомы, — у 4 пациентов. В результате проведённой операции положительные результаты составили 86,7 % случаев, из них «выздоровление» — 66,7 % случаев, «улучшение» — 20,0 % случаев. «Рецидивы» заболевания составили 13,3 % случаев.

Заключение

Проведённое химическое исследование дало возможность выявить, что концентрация Митомицина-С в тканях области дакриостомы при аппликационном способе введения составляет 0,626 ± 176 мкг/г, что примерно в 300 раз ниже доказанной эффективной антифибротической концентрации препарата — 0,2–0,3 мг/мл, установленной в исследованиях in vitro. Таким образом, отсутствие убедительных данных об эффективности применения Митомицина-С, по-видимому, связано с недостаточной концентрацией препарата в тканях области дакриостомы при применении его аппликационно.

Так как в опубликованных экспериментальных работах возможность Митомицина-С воздействовать на фибробласты и подавлять их активность доказана, то дальнейшие исследования должны быть направлены на разработку мер по повышению концентрации Митомицина-С в тканях области дакриостомы.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Л. Атькова, А.О. Роот, C.Д. Ярцев

Сбор и обработка материалов — А.О. Роот, Н.Н. Краховецкий, С.Д. Ярцев, В.Д. Ярцев.

Анализ полученных данных и написание текста — Е.Л.Атькова, А.О. Роот, С.Д. Ярцев.

Об авторах

Евгения Львовна Атькова

ФГБНУ «НИИ глазных болезней»

Автор, ответственный за переписку.
Email: evg.atkova@mail.ru

аспирант

Россия, Москва

Анна Олеговна Роот

ФГБНУ «НИИ глазных болезней»

Email: a.root@niigb.ru

аспирант

Россия, Москва

Николай Николаевич Краховецкий

ФГБНУ «НИИ глазных болезней»

Email: krahovetskiynn@mail.ru

старший научный сотрудник отделения патологии слёзного аппарата

Россия, Москва

Василий Дмитриевич Ярцев

ФГБНУ «НИИ глазных болезней»

Email: yartsew@ya.ru

научный сотрудник отделения патологии слёзного аппарата

Россия, Москва

Степан Дмитриевич Ярцев

ФГБНУ «Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина» Российской академии наук

Email: yartsew1@yandex.ru

аспирант

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы