Effect of crosslinking with riboflavin and ultraviolet a (UVA) on the scleral tissue structure

Mukharram M. Bikbov; Бикбов Мухаррам Мухтарамович; Valentina K. Surkova; Суркова Валентина Константиновна; Emin L. Usubov; Усубов Эмин Логманович; Nikolaj A. Nikitin; Никитин Николай Александрович; Mikhail N. Astrelin; Астрелин Михаил Николаевич

doi:10.17816/OV1026-12

Влияние кросслинкинга с рибофлавином и ультрафиолетом А (UVA) на структуру склеральной ткани

Авторы: Бикбов М.М.¹, Суркова В.К.¹, Усубов Э.Л.¹, Никитин Н.А.¹, Астрелин М.Н.¹
Учреждения:
1. ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней» АН Республики Башкортостан
Выпуск: Том 10, № 2 (2017)
Страницы: 6-12
Раздел: Статьи
Статья получена: 28.06.2017
Статья опубликована: 15.05.2017
URL: https://journals.eco-vector.com/ov/article/view/6736
DOI: https://doi.org/10.17816/OV1026-12
ID: 6736

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Оценить влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином и ультрафиолетом А (UVA) на структуру склеральной ткани в эксперименте in vitro.

Материал и методы. Исследование проводили на 7 свиных глазах. Из каждого глазного яблока вырезали по два параллельных склеральных лоскута, один из которых подвергался процедуре кросслинкинга (инстилляция 0,1 % водного раствора рибофлавина мононуклеотида в течение 20 минут, облучение ультрафиолетом А мощностью 3 мВт/см2 в течение 30 минут), второй использовался в качестве контроля. Структуру склеры оценивали с помощью световой (окраска по Ван Гизону) и электронной микроскопии. Проводили морфометрический анализ фотоснимков гистологических препаратов с использованием специального программного обеспечения.

Результаты. В результате кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA наблюдалось увеличение плотности упаковки коллагеновых волокон в среднем на 8,2 %, уменьшение площади межуточного пространства — на 5,2 %, увеличение диаметра коллагеновых фибрилл — на 12 %. Патологических изменений структур склеры выявлено не было.

Вывод. Полученные результаты подтверждают эффективность кросслинкинга склеры c рибофлавином/UVA в образовании дополнительных перекрёстных связей и безопасность процедуры для склеральной ткани.

Ключевые слова

кросслинкинг склеры, световая микроскопия, электронная микроскопия, морфометрический анализ

Полный текст

Миопия является одной из основных причин снижения зрения во всём мире — данным заболеванием страдают около 1 миллиарда человек [10, 11]. Прогрессирование миопии наблюдается примерно в 50 % случаев и до сих пор остаётся нерешённой проблемой офтальмологии [6]. Ряд учёных считают, что кросслинкинг склеры может стать новым эффективным методом лечения прогрессирующей близорукости, в основе патогенеза которой лежит снижение биомеханической прочности склеральной ткани [7, 13, 16]. Кросслинкинг — это образование химических связей между макромолекулами, которое, как правило, делает материал прочнее [1, 17]. Более 10 лет кросслинкинг роговицы с рибофлавином и ультрафиолетом А (UVA) успешно применяется для лечения кератэктазий, повышая прочность ослабленной роговичной ткани и тем самым препятствуя прогрессированию заболевания [2, 5]. В настоящее время имеются исследования, описывающие улучшение биомеханических параметров склеры в результате фотохимического кросс линкинга [3, 9, 14, 18]. Однако лишь единичные работы посвящены гистологическим изменениям, происходящим в непрозрачной части фиброзной оболочки глаза после данной процедуры [7, 8, 15]. Поэтому актуальным является изучение морфологических изменений склеры под влиянием фотохимического кросслинкинга.

Цель — оценить влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином и ультрафиолетом А на структуру склеральной ткани в эксперименте in vitro.

Материалы и методы

Подготовка образцов склеральной ткани. Для экспериментов были использованы 7 свиных глаз (не более 3 часов после забоя). Материал для исследования доставляли в лабораторию в течение 30–40 минут после взятия в термосумке для транспортировки биологических материалов (4 °C) и помещали в холодильник. Общее время хранения не превышало 6 часов.

Глазные яблоки полностью освобождали от прилежащих мягких тканей. С помощью скальпеля и хирургических ножниц на каждом глазу в сагиттальном направлении, начиная в 2 мм от лимба, выкраивали по два параллельных склеральных лоскута прямоугольной формы размером 4 × 10 мм. Один из образцов склеры каждого глазного яблока подвергался процедуре кросслинкинга (опытная группа), второй парный образец оставался интактным (контрольная группа).

Процедура кросслинкинга. Склеральные образцы из опытной группы укладывали на предметное стекло наружной поверхностью кверху, насыщали 0,1 % водным раствором рибофлавина-мононуклеотида путём инстилляции в течение 20 минут. Облучение склеры ультрафиолетом А (длина волны 370 нм, мощность 3 мВт/см2) осуществляли с применением офтальмологического аппарата для УФ-кросслинкинга «УФалинк» (Россия) в течение 30 минут, дополнительно инстиллируя раствор фотосенсибилизатора каждые 5 минут на облучаемую поверхность.

С помощью световой микроскопии изучали склеральные образцы из 4 глазных яблок (8 образцов), с помощью электронной — из 3 глазных яблок (6 образцов).

Световая микроскопия. Склеральные лоскуты фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина в течение 48 часов. После проводки через спирты образцы заливали в парафин. Затем готовили гистологические срезы толщиной 5–7 мкм и окрашивали их пикрофуксином по Ван Гизону. Визуальный анализ препаратов выполняли на световом микроскопе Axiostar Plus (Carl Zeiss) при различных увеличениях. Морфометрические измерения производили с помощью медицинской компьютерной видеосистемы, состоящей из микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss), цифровой фотокамеры Jenoptik ProgRes C10 и персонального компьютера Рentium-IV с программным обеспечением «ВидеоТесТ Морфология». В программе осуществлялся автоматический подсчёт размеров (в пикселях) структур склеры, окрашенных в разные цвета — коллагеновых волокон, ядер склероцитов, межуточного про странства. Практическое значение имели выводимые программой данные об относительной площади структур склеры (в процентах от общей площади снимка) (рис. 1).

Рис. 1. Морфометрические измерения фотоснимков гистологических срезов склеры в программе «ВидеоТесТ Морфология»

Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопического исследования образцы склеры фиксировали в 2 % растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2–7,4) с дофиксацией в 1 % растворе оксида осмия на том же буфере. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон-812 по общепринятой методике [4]. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-III 8800 (Швеция), контрастировали 2 % водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу, изучали и фотографировали на электронном трансмиссионном микроскопе Jem-1011 (JEOL Ltd., Япония) при увеличениях от 5000 до 20000. Сравнительный анализ диаметра коллагеновых фибрилл осуществляли с использованием фотографических изображений (увеличение ×10 000) при помощи программного обеспечения Olympus iTEM для анализа электронограмм (рис. 2).

Рис. 2. Измерение диаметра коллагеновых фибрилл в программе Olympus iTEM

Результаты

При световой микроскопии на фотоснимках гистологических препаратов склеры опытной и контрольной групп визуализировались коллагеновые волокна ярко-красного цвета и ядра склероцитов чёрного цвета. Признаков патологических изменений структур склеры в результате кросслинкинга не наблюдалось (рис. 3).

Рис. 3. Гистологический срез склеральных образцов опытной и контрольной групп. Окраска по Ван Гизону, увеличение ×100

Морфометрический анализ фотоснимков гистологических препаратов отражает сравнение относительных площадей коллагеновых волокон и межуточного пространства в основной и контрольной группах и таким образом позволяет судить о влиянии кросслинкинга на плотность упаковки склеральной ткани (табл. 1, 2).

Таблица 1. Сравнение относительной площади (% от общей площади) коллагеновых волокон в опытной и контрольной группах

Table 1. Comparison of the collagen fibers relative area (% of the total area) in the experimental and control groups

Глаз	Опыт, %	Контроль, %	Увеличение относительной площади коллагеновых волокон в опытных образцах по сравнению с контрольными, %
1	66,63	59,01	7,62
2	70,36	57,97	12,39
3	66,57	64,73	1,84
4	71,76	60,95	10,81
Среднее значение	68,83	60,67	8,17

Таблица 2. Сравнение относительной площади (% от общей площади) межуточного пространства в опытной и контрольной группах

Table 2. Comparison of the interstitial space relative area (% of the total area) in the experimental and control groups

Глаз	Опыт, %	Контроль, %	Уменьшение относительной площади межуточного пространства в опытных образцах по сравнению с контрольными, %
1	10,96	16,02	5,06
2	13,83	17,89	4,06
3	10,97	17,32	6,35
4	8,96	14,24	5,28
Среднее значение	11,18	16,37	5,19

Таким образом, после кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA наблюдали увеличение плотности упаковки коллагеновых волокон в среднем на 8,2 % и уменьшение площади меж уточного пространства в среднем на 5,2 %.

Электронно-микроскопические исследования в обеих группах показали наличие регулярно чередующихся фибрилл (рис. 4), формирующих коллагеновые волокна. В самих фибриллах прослеживалась характерная поперечная исчерченность с чёткой периодичностью. Патологических изменений волокнистых структур склеры в обеих группах выявлено не было.

Рис. 4. Пучки коллагеновых фибрилл опытной и контрольной групп при поперечном (а) и продольном (b) срезах (ув. ×10 000)

Проводилась оценка состояния клеток склеры — склероцитов. Было показано, что они сохраняют свою структурную целостность без повреждения стенки (рис. 5). Выделялись склероциты с отростками неправильной вытянутой формы, в которых визуализировались сохранные ядра, органоиды, цитоплазма.

Рис. 5. Склероциты опытной и контрольной групп (ув. ×10 000)

Количественный анализ электронограмм показал, что в результате кросслинкинга с рибофлавином/UVA происходит увеличение диаметра коллагеновых фибрилл в среднем на 12 % (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение среднего диаметра коллагеновых фибрилл опытных и парных контрольных образцов склеры

Table 3. Comparison of the collagen fibrils mean diameter in the scleral samples from experimental eye and contralateral control eye

Глаз	Опытный образец (pixel)	Контрольный образец (pixel)
1	177,09	152,95
2	186,00	168,33
3	192,86	175,05
Среднее значение	185,32 (112 %)	165,44 (100 %)

Обсуждение

Мы изучили влияние кросслинкинга с рибо флавином/UVA на структуру склеры с помощью световой и электронной микроскопии. Каких-либо патологических изменений склеральной ткани по сравнению с контролем выявлено не было. Вместе с тем наблюдались компактизация коллагеновых волокон и увеличение диаметра фибрилл склеры. Полученные данные согласуются с результатами других авторов. Так, G. Wollensak et al. (2005) с помощью электронной микроскопии наблюдали признаки повреждения в результате кросслинкинга лишь единичных склероцитов, без патологических изменений в волокнах склеры. В связи с этим учёные сделали вывод о высокой устойчивости склеральной ткани к повреждающему воздействию ультрафиолетового излучения [15]. S. Choi et al. на электронограммах зафиксировали увеличение диаметра коллагеновых фибрилл склеры на 27 % под воздействием кросслинкинга [7]. G.-B. Jung et al. (2011) наблюдали более плотное расположение коллагеновых волокон после процедуры по данным световой микроскопии. Однако их исследование выполнено лишь на 1 трупном глазу и оценка плотности волокон проведена субъективно, без морфометрического анализа [8].

Данные литературы и результаты нашего исследования свидетельствуют об относительно высокой устойчивости склеральной ткани к повреждающему воздействию ультрафиолетового излучения. Увеличение диаметра коллагеновых фибрилл и более плотное расположение волокон склеры в результате кросслинкинга связаны с образованием дополнительных перекрёстных связей, которые отталкивают макромолекулы коллагена друг от друга [8, 12].

Вывод

В результате кросслинкинга склеры с рибо флавином и ультрафиолетом А наблюдается увеличение плотности упаковки коллагеновых волокон в среднем на 8,2 %, уменьшение площади межуточного пространства — на 5,2 %, увеличение диаметра коллагеновых фибрилл — на 12 %. Полученные данные подтверждают образование дополнительных перекрёстных связей между макромолекулами склеры. Патологических изменений клеток и волокон фиброзной оболочки глаза в результате ультрафиолетового облучения в присутствии фотосенсибилизатора не наблюдалось, что свидетельствует о безопасности процедуры для склеральной ткани.