Comparison of indicators of autologous serum obtained by different methods and used for the treatment of macular hole

Evgeniy M. Popov; Попов Евгений Михайлович; Evgeniy M. Popov; Alexei N. Kulikov; Куликов Алексей Николаевич; Alexei N. Kulikov; Sergey V. Churashov; Чурашов Сергей Викторович; Sergey V. Churashov; Il’ya O. Gavrilyuk; Гаврилюк Илья Олегович; Il’ya O. Gavrilyuk; Elisaveta N. Egorova; Егорова Елизавета Николаевна; Elisaveta N. Egorova; Anastasiya I. Abbasova; Аббасова Анастасия Игоревна; Anastasiya I. Abbasova

doi:10.17816/OV89413

Сравнение показателей получаемой разными способами аутоплазмы, используемой для лечения пациентов с макулярным разрывом

Авторы: Попов Е.М.¹, Куликов А.Н.¹, Чурашов С.В.¹, Гаврилюк И.О.¹, Егорова Е.Н.¹, Аббасова А.И.¹
Учреждения:
1. Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Выпуск: Том 14, № 4 (2021)
Страницы: 27-34
Раздел: Оригинальные статьи
Статья получена: 29.11.2021
Статья одобрена: 04.02.2022
Статья опубликована: 15.12.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/ov/article/view/89413
DOI: https://doi.org/10.17816/OV89413
ID: 89413

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. В последние годы в лечении пациентов с макулярным разрывом всё чаще применяют аутологичную плазму крови. В исследовании проведён биологический анализ аутоплазмы, получаемой различными способами.

Цель исследования — сравнить клеточный и биохимический состав аутоплазмы, получаемой с помощью разных способов для использования в лечении пациентов с макулярным разрывом.

Материалы и методы. Выполнено исследование количества тромбоцитов, лейкоцитов и фибриногена в плазме крови 24 пациентов, полученной центрифугированием в оригинальных системах для заготовки аутоплазмы и в лабораторных пробирках.

Результаты. Показатели P-PRP, полученной в системе Arthrex ACP и в лабораторной пробирке, статистически не отличаются по количественным показателям фибриногена и тромбоцитов (p < 0,05) и отличаются по содержанию лейкоцитов (p > 0,05) в сторону увеличения количества лейкоцитов в субстрате, полученном в лабораторной пробирке. Показатели L-PRP, полученной в системе Ycellbio-Kit и в лабораторной пробирке, статистически не отличаются по количеству фибриногена (p < 0,05) и отличаются по содержанию тромбоцитов и лейкоцитов (p > 0,05) в сторону понижения их концентрации в аутоплазме, получаемой в лабораторной пробирке.

Заключение. Большой интерес для хирургии макулярного разрыва в настоящее время представляет аутоплазма, получаемая в системе Arthrex ACP по причине минимального содержания лейкоцитов, закрытости системы, лучших коагуляционных свойств получаемого субстрата. Лабораторные пробирки можно рассматривать как более доступную альтернативу для получения аутоплазмы (P-PRP) в целях лечения макулярного разрыва. Аутоплазма (L-PRP), получаемая в системе Ycellbio-Kit и лабораторной пробирке по своему составу в меньшей мере подходит для хирургии макулярного разрыва.

Ключевые слова

аутоплазма, макулярный разрыв, P-PRP, L-PRP, аутологичная кондиционированная плазма, ACP

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

В последние годы всё большее распространение в медицине, в частности в офтальмологии, получают методы лечения аутоплазмой крови с повышенным содержанием тромбоцитов [1–3]. Терапия такой плазмой является безопасным методом лечения и показания к её применению неуклонно расширяются [4]. Так, данные технологии могут быть использованы в хирургии макулярного разрыва, хирургии регматогенной отслойки сетчатки, при патологии роговицы [5–8].

На кафедре офтальмологии имени проф. В.В. Волкова Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова ведутся исследования репаративной способности аутоплазмы с повышенным содержанием тромбоцитов в хирургии макулярного разрыва [9].

В современной отечественной литературе есть множество публикаций по использованию в клинической офтальмологии аутоплазмы с повышенным содержанием тромбоцитов, но нет единой терминологии и единого представления о свойствах получаемых препаратов плазмы, зависящих от их клеточного состава и состояния активации фибриногена [10–12].

Согласно классификации, предложенной D.M. Dohan Ehrenfest и соавт. [13], выделено четыре основные группы препаратов плазмы с повышенным содержанием тромбоцитов в зависимости от их клеточного состава и активированности фибриногена.

P-PRP (pure platelet-rich plasma) — чистая обогащённая тромбоцитами плазма или бедная лейкоцитами плазма. Продукты этой группы имеют низкую вязкость, практически лишены лейкоцитов и содержат повышенную концентрацию тромбоцитов (концентрация тромбоцитов увеличивается в 2–3 раза от первоначального содержания в крови), фибриноген в их составе не активирован. Продукты P-PRP широко используют в клинической медицине (травматологии, спортивной медицине, косметологии, дерматологии), в том числе и в офтальмологической практике. Коммерческим продуктом P-PRP является АСР (аutologous сonditioned plasma — аутологичная кондиционированная плазма), получаемая при помощи оригинальной системы Arthrex ACP шприц в шприце (Артрекс, Германия).
L-PRP (leucocyte-platelet-rich plasma) — это группа препаратов плазмы, обогащённой тромбоцитами, которые так же, как и P-PRP, обладают низкой вязкостью, фибриноген в их составе не активирован, но они имеют более высокую концентрацию тромбоцитов (трёх-, четырёхкратно превосходящую начальную концентрацию) и большее количество лейкоцитов. L-PRP также широко применяют в различных областях клинической медицины, включая офтальмологию. Именно для заготовки этого семейства препаратов плазмы существует наибольшее количество систем, позволяющих минимизировать обработку образцов крови и максимально стандартизировать получаемый субстрат. В эту группу входит оригинальная система для заготовки плазмы Ycellbio-Kit (Вайселлбиомедикал, Республика Корея).
P-PRF (pure platelet-rich fibrin) — препараты фибрина с повышенным содержанием тромбоцитов, практически не содержат лейкоцитов и имеют активированный фибриноген с фибриновой сетью высокой плотности.
L-PRF (leucocyte-platelet-rich fibrin) — препараты фибрина с повышенным содержанием тромбоцитов и лейкоцитов, имеющих активированный фибриноген с высокой плотностью фибриновой сети.

P-PRF и L-PRF обладают высокой вязкостью, существуют только в гелевой форме. Используются в реконструктивной костно-пластической хирургии, абдоминальной хирургии, урологии, комбустиологии. В офтальмологии находят применение как фибриновые клеи в целях реконструктивной хирургии глазной поверхности.

В настоящее время в клинической офтальмологии более широкое применение получили две оригинальные системы для заготовки аутоплазмы с повышенным содержанием тромбоцитов: Arthrex ACP и Ycellbio-Kit. Данные системы по различным причинам могут быть не всегда доступны к использованию. Это натолкнуло нас на поиск более доступных способов получения аутоплазмы с повышенным содержанием тромбоцитов для применения в целях витреоретинальной хирургии макулярного разрыва.

Цель исследования — сравнить клеточный и биохимический состав аутоплазмы, получаемой с помощью разных способов для использования в лечении пациентов с макулярным разрывом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включено 24 добровольца (12 мужчин, 12 женщин) из числа пациентов и сотрудников клиники офтальмологии Военно-медицинской академии, не имеющих соматических заболеваний в стадии дестабилизации, анемии любого генеза и не принимающих антикоагулянтную и антиагрегантную терапию (по данным клинического исследования крови и исследования коагулограммы у обследуемых отклонений от нормальных значений не было). Средний возраст участников исследования — 41 ± 17 лет.

Каждому обследованному в условиях процедурного кабинета при температуре в помещении 20–22 ^°С из периферической вены без перерыва выполняли забор крови в объеме 54 мл в шприц ёмкостью 60 мл с предварительно набранным антикоагулянтом ACD-A (натрия цитрат — 2,2 %, глюкоза — 2,45 %, лимонная кислота — 0,8 %) 6 мл. ACD-A — один из рекомендованных антикоагулянтов для заготовки аутоплазмы в целях клинической офтальмологии, а соотношении крови к антикоагулянту 9 : 1 соответствует рекомендациям производителей систем для заготовки аутоплазмы Arthrex ACP и Ycellbio-Kit и рекомендациям по лабораторной диагностике (лабораторное исследование плазмы без антикоагулянта затруднительно, из-за развития в короткие сроки коагуляции и искажения результатов исследования) [14–16]. После забора вращательными движениями шприца в течение 30 с кровь смешивалась с антикоагулянтом и переносилась в системы для получения аутоплазмы и лабораторные пробирки.*

После центрифугирования в полученном субстрате оценивали количество тромбоцитов, лейкоцитов и фибриногена. Обработку результатов проводили с помощью стандартных инструментов описательной статистики Microsoft Office Excel 2016. Параметры представлены в формате M ± SD, где M — среднее значение, SD — стандартное отклонение. Для определения достоверности использовали парный t-критерий Стьюдента для зависимых выборок. Для контроля исследуемые показатели также определялись в венозной крови с антикоагулянтом. Количественные показатели клеточного состава исследовали на гематологическом анализаторе BC Mindray 5800 (Shenzhen Mindray, Китай), показатели свертывающей системы крови — на автоматическом коагулометре ACL TOP 500 (Instrumentation Laboratory, США).

Исследование богатой тромбоцитами и бедной лейкоцитами аутоплазмы (P-PRP)

P-PRP для исследования получали двумя способами: с помощью системы Arthrex ACP и лабораторной пробирки.

Получение P-PRP с помощью системы Arthrex ACP. В систему Arthrex ACP вносили 15 мл крови с антикоагулянтом и далее действовали согласно рекомендациям производителя системы [14]. Исследование выполняли в центрифуге Rotofix 32A (Hettich, Германия) при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования плазму отбирали в вертикальном положении системы путем оттягивания поршня внутреннего шприца, не достигая 1,5 мм до уровня эритроцитов. Таким способом в среднем получали 5,1 ± 1,2 мл плазмы (рис. 1).

Рис. 1. Центрифуга Rotofix 32A и система Arthrex ACP для получения аутологичной кондиционированной плазмы / Fig. 1. The Rotofix 32A centrifuge and the Arthrex ACP system for producing autologous conditioned serum

Получение P-PRP с помощью лабораторной пробирки. В пробирку емкостью 12 мл вносили 10 мл крови с антикоагулянтом и центрифугировали на приборе Multi Centrifuge CM 6M (Elmi, Латвия) при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования плазму отбирали в шприц емкостью 5 мл через инъекционную иглу 22 Ga 40 мм, не достигая 1,5 мм до уровня эритроцитов. Таким способом в среднем получали 3,9 ± 0,8 мл плазмы (рис. 2).

Рис. 2. Центрифуга Multi Centrifuge CM 6M и лабораторная пробирка для получения богатой тромбоцитами аутоплазмы / Fig. 2. Multi Centrifuge CM 6M centrifuge and laboratory test tube for producing platelet-rich autologous serum

Исследование богатой тромбоцитами и лейкоцитами аутоплазмы (L-PRP)

L-PRP для исследования получали двумя способами: с помощью системы Ycellbio-Kit и лабораторной пробирки.

Получение L-PRP с помощью системы Ycellbio-Kit. В систему Ycellbio-Kit независимо от пола вносили 14 мл крови с антикоагулянтом и далее действовали согласно рекомендациям производителя [15]. Для исследования применяли центрифугу Armed 80-2S («Армед», Россия) при скорости 3500 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования тромбоцитарно-лейкоцитарный слой концентрируется в узкой части системы между слоем эритроцитов и плазмы. Тромбоцитарно-лейкоцитарный клеточный пул вместе с плазмой отбирали в шприц ёмкостью 5 мл через инъекционную иглу 22 Ga 40 мм в объёме 1,5 мл. Для максимального аспирирования клеточных элементов слой тромбоцитов и лейкоцитов слегка взбалтывался круговыми движениями инъекционной иглы (рис. 3).

Рис. 3. Центрифуга Armed 80-2S и система Ycellbio-Kit для получения богатой тромбоцитами аутоплазмы / Fig. 3. The Armed 80-2S centrifuge and the Ycellbio-Kit system for producing platelet-rich autologous serum

Получение L-PRP с помощью лабораторной пробирки. В пробирку емкостью 12 мл вносили 10 мл крови с антикоагулянтом и затем центрифугировали на приборе Multi Centrifuge CM 6M при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования плазму отбирали в шприц емкостью 5 мл через инъекционную иглу 22 Ga 40 мм, не достигая 1,5 мм до уровня эритроцитов, и далее вносили в пробирку емкостью 12 мл и повторно использовали ту же центрифугу на скорости 2800 об/мин 2 мин. При увеличении скорости и/или длительности центрифугирования происходит активация тромбоцитов с формированием нерастворимого сгустка (рис. 4). При уменьшении скорости и/или длительности центрифугирования в полученном субстрате уменьшается количество тромбоцитов.

Рис. 4. Клеточные элементы крови (указаны стрелкой), выпавшие в осадок и полученная L-PRP / Fig. 4. Precipitated blood cell elements (indicated by arrow), and obtained L-PRP

После центрифугирования клеточные элементы смещаются в сторону дна пробирки и видны в виде серовато-красноватого осадка. Верхние 2/3 части бедной тромбоцитами и лейкоцитами плазмы аспирировались, в пробирке оставалась 1/3 часть богатой тромбоцитами и лейкоцитами плазмы. Клеточные элементы, выпавшие в осадок, аккуратными качательными движениями пробирки переводились в раствор. Таким способом в среднем получали 1,3 ± 0,3 мл плазмы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественные показатели фибриногена, тромбоцитов и лейкоцитов аутоплазмы, полученной различными способами, представлены в таблице.

Таблица. Среднее количество фибриногена, тромбоцитов и лейкоцитов в венозной крови с антикоагулянтом и аутоплазме крови, полученной различными способами / Table. The average amount of fibrinogen, platelets and leukocytes in venous blood with anticoagulant and autologous serum obtained by various methods

Способ	Фибриноген, г/л	Тромбоциты, ×10⁹/л	Лейкоциты, ×10⁹/л
Контрольные показатели венозной крови с антикоагулянтом	3,51 ± 0,68	203,83 ± 42,05	5,39 ± 1,24
Показатели P-PRP, полученной в системе Arthrex ACP	3,57 ± 0,56	451,17 ± 114,32	0,48 ± 0,74
Показатели P-PRP, полученной в лабораторной пробирке	3,56 ± 0,59	454,33 ± 104,90	0,85 ± 0,56
Показатели L-PRP, полученной в системе Ycellbio-Kit	3,30 ± 0,64	740,08 ± 209,26	3,57 ± 1,87
Показатели L-PRP, полученной в лабораторной пробирке	3,42 ± 0,64	643,67 ± 163,51	1,45 ± 0,79

Представленные в таблице исследуемые показатели P-PRP, полученной в системе Arthrex ACP и лабораторной пробирке, статистически значимо не отличаются по количественным показателям фибриногена и тромбоцитов (p < 0,05) и достоверно отличаются по содержанию лейкоцитов (p > 0,05) в сторону увеличения их количества в субстрате, полученном в лабораторной пробирке. Сравниваемые показатели L-PRP, полученной в системе Ycellbio-Kit и лабораторной пробирке, статистически достоверно не отличаются по количеству фибриногена (p < 0,05) и отличаются по содержанию тромбоцитов и лейкоцитов (p > 0,05) в сторону уменьшения их концентрации в аутоплазме, получаемой в лабораторной пробирке.

ОБСУЖДЕНИЕ

По мнению многих авторов, наиболее значимыми показателями аутоплазмы, определяющими способность формировать тромбоцитарно-фибриновую «пробку» в диастазе макулярного разрыва и тромбоцитарно-фибриновую плёнку на поверхности макулярной сетчатки, являются фибриноген и тромбоциты [17, 18], которые, будучи физиологическими факторами гемостаза и восстановления сосудистой стенки, обеспечивают более деликатное, по сравнению с механическими техниками, закрытие макулярного разрыва. Факторы роста α-гранул тромбоцитов обеспечивают восстановление повреждённой ткани, при этом выраженность репаративной активности зависит от концентрации тромбоцитов. Считается, что максимальный репаративный эффект аутоплазмы достигается при концентрации тромбоцитов в ней от 1 млн клеток в мкл [19]. Напротив, медиаторы воспаления лейкоцитов могут пагубно воздействовать на зону макулярного разрыва, вызывая альтерацию, отёк и ишемию сетчатки, вместе с этим выраженность воспалительных проявлений прямо пропорционально зависит от концентрации лейкоцитов в аутоплазме [20].

Получаемая в лабораторной пробирке P-PRP имеет большее количество лейкоцитов, что при витреальной хирургии может увеличивать риск воспалительной реакции, и учитывая то, что при заготовке аутоплазмы с помощью лабораторной пробирки происходит контакт крови с внешней средой, возрастает возможность контаминации субстрата микроорганизмами, увеличивая вероятность послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений.

L-PRP, получаемая в лабораторной пробирке наряду со снижением концентрации лейкоцитов, содержит меньшее количество тромбоцитов, что, с одной стороны, может уменьшить воспалительный ответ на введение в ткани, а с другой стороны, снижает репаративную активность аутоплазмы.

Немаловажный аспект коагуляционной активности аутоплазмы — наличие или отсутствие антикоагулянта. Так, протокол получения аутоплазмы в системе Arthrex ACP позволяет получать субстрат без использования антикоагулянта, при этом концентрация фибринагена и клеточных элементов возрастает, повышая коагуляционную способность плазмы. Такие же свойства имеет аутоплазма (P-PRP), получаемая без антикоагулянта в лабораторной пробирке. Протокол заготовки аутоплазмы в системе Ycellbio-Kit без антикоагулянта не предусмотрен, поэтому плазма, полученная в системе Ycellbio-Kit, будет обладать заведомо худшими прокоагуляционными свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в результате исследования данные свидетельствуют, что в настоящее время наибольший интерес для хирургии макулярного разрыва представляет аутоплазма, получаемая в системе Arthrex ACP, в связи с тем, что имеет наименьшее содержание лейкоцитов, максимальную защищённость системы от воздействия внешних факторов, возможность получения аутоплазмы без антикоагулянта. Лабораторные пробирки могут быть рассмотрены более доступной альтернативой для получения P-PRP в целях лечения пациентов с макулярным разрывом, но с заведомо бо́льшим риском развития воспалительных осложнений. Аутоплазма, получаемая в системе Ycellbio-Kit, в меньшей мере пригодна для хирургии макулярного разрыва, по причине большего содержания лейкоцитов, необходимости использования антикоагулянта при заготовке, сложности технологического процесса заготовки. L-PRP, получаемая в лабораторной пробирке, имеет схожие недостатки с аутоплазмой, получаемой в системе Ycellbio-Kit, и так же малопригодна для хирургии макулярного разрыва.

Таким образом, несмотря на проведенные многочисленные исследования в области получения аутоплазмы в целях хирургии макулярного разрыва, продолжается поиск препарата аутоплазмы с оптимальными свойствами, сочетающими низкую вязкость до применения, способность формировать тромбоцитарно-фибриновую «пробку» в диастазе макулярного разрыва и стимулировать максимальный репаративный эффект.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Не указан.

* ^*В исследовании использовали лабораторную пробирку, в том числе с винтовой крышкой, производства фирмы НУОВА АПТАКА С.Р.Л., Италия, РУ № ФСЗ 2011/09223 от 19.03.2012.

Об авторах