Significance of gene polymorphysm in development of colorectal cancer

Evgeniy P. Kulikov; Куликов Евгений Петрович; Aleksey I. Sudakov; Судаков Алексей Ильич; Aleksandr A. Nikiforov; Никифоров Александр Алексеевич; Sergey A. Mertsalov; Мерцалов Сергей Александрович; Vladimir A. Grigorenko; Григоренко Владимир Андреевич

doi:10.23888/PAVLOVJ2020282127-134

Значение полиморфизма генов в развитии колоректального рака

Авторы: Куликов Е.П.¹, Судаков А.И.¹, Никифоров А.А.¹, Мерцалов С.А.¹, Григоренко В.А.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Выпуск: Том 28, № 2 (2020)
Страницы: 127-134
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 01.07.2020
Статья опубликована: 03.07.2020
URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/34899
DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2020282127-134
ID: 34899

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Определить значение полиморфизма генов MTHFR (Ala222Val), XPD (Lis751Gln), XRCC1 (Arg194Trp), XRCC1 (Arg399Gln), XRCC1 (Arg208His), APE1 (Asp148Glu), hOGG1 (ser326Ces), P53 (Pro47Ser), VEGF (C654G), EGFR(A2073T), TNF(G308A), CHEK2 (Ile157Thr), MMP1 (1607 1G>2G), TIMP1(C53CT) в развитии колоректального рака.

Материалы и методы. Проанализированы 106 случаев колоректального рака у пациентов, проходивших лечение в ГБУ РО Областной клинический онкологический диспансер (Рязань). Генотипирование всем больным выполнялось методом выделения ДНК из лейкоцитов венозной крови с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с электрофоретической детекцией результата.

Результаты. Взаимосвязи между возрастом пациентов на момент верификации диагноза и полиморфизмом ни для одного из исследуемых генов зарегистрировано не было (р>0,05). Статистически значимая связь выявлена между полиморфизмом гена TNF (G308A) и стадией рака: его гомозиготный мажорный генотип G/G гораздо чаще встречался в группе пациентов с III-IV стадией (р=0,047). При наличии аллеля G/G TNF (G308A) совместно с гомозиготным мутантным аллелем гена MMP1 (1607 1G/2G) отмечается прямая связь с возрастанием доли пациентов, диагноз которым был поставлен на III-IV стадии. Данное сочетание двух полиморфизмов статистически значимо различалось в обследуемых группах (р=0,025). У 8 из 10 больных с IV стадией отмечено наличие полиморфизма G/G в гене VEGF (C654G). Данный мутантный гомозиготный вариант встречался значительно реже у пациентов с I (37,5%), II (40%) или III стадией (37,5%) (р=0,0147).

Выводы. Исследованные гены не влияют на возрастной критерий манифестации колоректального рака и встречаются одинаково часто у пациентов обоих полов вне зависимости от возрастной группы. Локализация и степень дифференцировки опухоли также не зависят от полиморфизма исследуемых генов. Наличие полиморфизма G/А гена TNF (G308A) следует считать благоприятным критерием, способствующим меньшей агрессивности опухоли (р<0,05). Выявление же мажорного генотипа G/G особенно в сочетании с гомозиготным мутантным аллелем гена MMP1 (1607 1G/2G) является неблагоприятным фактором (р<0,05). Наличие гомозиготного мутантного генотипа G/G VEGF (C654G) может напрямую коррелировать с быстрой прогрессией опухолей и активным метастазированием (р<0,05).

Ключевые слова

полиморфизм генов, колоректальный рак, инвазивный рост, метастазирование

Полный текст

Колоректальный рак (КРР) занимает 3-е место по распространённости в России. Ежегодно он диагностируется более чем у 60 тыс. пациентов. Всего в нашей стране на диспансерном учёте с этой патологией состоит более 350 тыс. человек.

При этом, результаты лечения данной категории больных остаются неудовлетворительными во многом ввиду запущенности процесса на момент верификации диагноза. Позднее выявление КРР (III-IV стадии заболевания) обусловлено отсутствием скрининговых программ диагностики, недостаточностью знаний о причинах и фактора риска возникновения данной патологии, а также непосредственным течением болезни, которое в ряде случаев бывает крайне быстрым.

На современном этапе в лечении КРР используется комбинированный или комплексный подход с использованием хирургического, лучевого и лекарственного воздействия [1].

Особенности возникновения рака, ответ на проводимую терапию во многом могут быть обусловлены индивидуальным генотипом пациента, который кодирует различные механизмы как участвующие в канцерогенезе, так и препятствующие ему [2, 3]. В связи с этим, большое количество научных работ направлены на выявление связи полиморфизма генов с патологическими процессами [4, 5] и различными локализациями опухоли [6, 7].

Целью работы являлось определить значение полиморфизма генов MTHFR (Ala222Val), XPD (Lis751Gln), XRCC1 (Arg194Trp), XRCC1 (Arg399Gln), XRCC1 (Arg208His), APE1 (Asp148Glu), hOGG1 (ser326Ces), P53 (Pro47Ser), VEGF (C654G), EGFR(A2073T), TNF(G308A), CHEK2 (Ile157Thr), MMP1 (1607 1G>2G), TIMP1(C53CT) в развитии колоректального рака.

В соответствии с поставленной целью проводилась оценка взаимосвязи полиморфизма с гендерной принадлежностью пациентов, с возрастом на момент манифестации заболевания, с локализацией опухолевого процесса, со степенью дифференцировки опухоли, стадией заболевания, глубиной инвазии и метастатическим распространением опухоли.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России и ГБУ РО Областной клинический онкологический диспансер, одобрено Локальным этическим комитетом (протокол №5 от 06.11.15). В работе использованы данные людей после подписания ими информированного согласия.

Генотипирование проводилось на наличие полиморфизма следующих генов: MTHFR (Ala222Val), XPD (Lis751Gln), XRCC1 (Arg194Trp), XRCC1 (Arg399Gln), XRCC1 (Arg208His), APE1 (Asp148Glu), hOGG1 (ser326Ces), P53 (Pro47Ser), VEGF (C654G), EGFR (A2073T), TNF(G308A), CHEK2 (Ile157Thr), MMP1 (1607 1G>2G), TIMP1 (C53CT).

Генотипирование выполнялось в Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России методом выделения ДНК из лейкоцитов венозной крови обследуемых с последующей ПЦР с электрофоретической детекцией результата «SNP-ЭКСПРЕСС» (НПФ «Литех», Россия).

В исследование были включены 106 пациентов, получавших лечение по поводу верифицированного колоректального рака. Гендерный состав обследуемых больных был примерно равным: 58 мужчин (55%) и 48 женщин (45%). По возрасту пациенты были разбиты на 3 группы, согласно полному количеству лет на момент манифестации заболевания. Была выделена I группа с относительно ранней манифестацией – до 55 лет (средний – 45,7 лет – 24 человека), II – от 55 до 65 лет (60,1 – 48 пациентов) и III группа старше 65 лет (71,6 лет – 43 пациента). Средний возраст всех пациентов на момент постановки диагноза составил 61,5 лет.

Из всех пациентов 76 (72%) человек наблюдались с диагнозом рака прямой кишки и 30 (28%) – с локализацией опухоли в других отделах толстого кишечника.

Верификация диагноза имелась у 100% пациентов. Гистологически все опухоли были представлены аденокарциномами, преимущественно умеренной дифференцировки (G-2, 81%).

Стадия заболевания выставлялась согласно Международной классификации TNM 8-ой редакции (2018 год). По степени распространённости процесса доля пациентов с I-II стадией (без метастатического поражения регионарных л/у) составила – 45,3% (48 человек), с III стадией – также 45,3% (48 пациентов). 10 пациентов (9,6%) на момент постановки диагноза имели IV стадию заболевания.

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета Excel 2007 (MS, США), Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., CША) а также онлайн-калькуляторов (для равновесия Харди-Вайнберга – https:// wpcalc.com/en/equilibrium-hardy-weinberg/). Описание и сравнение различий частот качественных признаков в независимых группах проводилось с использованием критерия χ² по Пирсону, при количестве ожидаемых явлений от 5 до 9 – с поправкой Йетса или точного критерия Фишера при значениях менее 5. Оценка прогностической значимости признака проводилась с определением относительного риска (OР) при 95% доверительном интервале (ДИ). В группах пациентов также оценивалось отклонение частот встречаемости аллелей от равновесия Харди-Вайнберга. При анализе статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

По гендерному признаку не было выявлено значимых различий в популяции лиц мужского и женского пола (р>0,05). При поиске взаимосвязи между возрастом пациентов на момент верификации диагноза и полиморфизмом ни для одного из исследуемых генов статистически значимых различий между выделенными группами не было получено (р>0,05). Кроме того, во всех возрастных группах было сохранено равновесие Харди-Вайнберга, что свидетельствует о достоверности распределения частот аллелей внутри возрастных популяционных групп.

При проведении анализа полиморфизма исследуемых генов в зависимости от локализации опухолевого процесса статистически значимых различий зарегистрировано не было (р>0,05), равно как и при оценке влияния полиморфизма исследуемых генов на степень дифференцировки опухоли (р>0,05).

Была оценена связь со стадией опухолевого процесса на момент постановки диагноза. Для большинства полиморфных генов прямой зависимости с возрастанием стадии не отмечено (р>0,05). Статистически значимая связь выявлена для полиморфизма гена TNF G308A, кодирующего цитокин фактора некроза опухоли: его гомозиготный мажорный генотип G/G гораздо чаще встречался в группе пациентов с впервые выявленной III-IV стадией заболевания (у 69% обследуемых) по сравнению с группой пациентов, у которых диагноз был поставлен на I-II стадиях (40% обследуемых, χ²=3,96, р=0,047, OP=1,45 [1, 0; 2, 03], табл. 1).

Таблица 1 Связь полиморфизма генов TNF и MMP1 и стадии заболевания

Генотип/аллель	I-II стадия	III-IV стадия	χ², р	OР [95% ДИ]
TNF(G308A)
G/G	18	33	3,96, р=0,047	1,45 [1, 0; 2, 03]
G/A	30	25	3,96, р=0,047	1,45 [1, 0; 2, 03]
A/A	0	0	-	-
G	66	91	2,57, p=0,11	0,77 [0, 57;1, 04]
A	30	25	2,57, p=0,11	0,77 [0, 57;1, 04]
TNF(G308A) + MMP1 (1607 2G/2G)
G/G	3	16	5,04, p=0,025	1,85 [1, 13; 3, 05]
G/A	12	10	5,04, p=0,025	1,85 [1, 13; 3, 05]

Кроме этого, была проанализирована связь полиморфизма данного гена с другими. Установлено, что при наличии аллеля G/G TNF (G308A) совместно с гомозиготным мутантным аллелем гена MMP1 (1607 1G/2G) отмечается прямая связь с возрастанием доли пациентов, диагноз которым был впервые поставлен на III-IV стадии. Белки, кодируемые данными генами, являются схожими по своей биологической роли и взаимосвязанными в плане потенцирования активности друг друга. Данное сочетание двух полиморфизмов статистически значимо различалось в обследуемых группах (χ²=5,04, р=0,025, ОР=1,85 [1, 13; 3, 05], табл. 1).

Несмотря на небольшую долю пациентов с IV стадией заболевания, включённых в исследовании, у 8 из 10 больных этой группы отмечено наличие полиморфизма G/G в гене VEGF (C654G). Данный мутантный гомозиготный вариант встречался значительно реже у пациентов с I (37,5%), II (40%) или III стадией (37,5%) (р=0,0147, ОР=5,42 [1, 21; 24, 32], табл. 2).

Таблица 2 Стадийность опухолевого процесса и полиморфизм гена VEGF

Генотип/аллель	I-II стадия	III-IV стадия	р	OР [95% ДИ]
VEGF (C654G)
C/C	10	1	р=0,0147	5,42 [1, 21; 24, 30]
C/G	49	1
G/G	37	8
C	69	3	р=0,1	2,90 [0, 88; 9, 62]
G	123	17	р=0,1	2,90 [0, 88; 9, 62]

На основе анализа частоты встречаемости генетического полиморфизма не выявлено каких-либо различий в зависимости от возраста пациента на момент манифестации КРР. Вполне допустимо, что развитие рака в более молодом возрасте имеет под собой генетическое обоснование, но в данном исследовании оно не было показано.

Локализация и степень дифференцировки опухоли также не зависят от полиморфизма исследуемых генов.

Также полиморфные гены MTHFR (Ala222Val), XPD (Lis751Gln), XRCC1 (Arg194Trp), XRCC1 (Arg399Gln), XRCC1 (Arg208His), APE1 (Asp148Glu), P53 (Pro47Ser), EGFR (A2073T), CHEK2 (Ile157Thr), TIMP1 (C53CT) не показали влияние на склонность опухоли к более агрессивному инвазивному росту и метастазированию.

При этом выявлена прямая связь между носительством мажорной гомозиготы гена TNF (G308A) G/G и высокой способностью опухоли к быстрой инвазии, которая проявлялась выявлением заболевания уже на III-IV стадии. Возможно носители хотя бы одного мутантного аллеля гена TNF (G308A) имеют ослабленную функцию данного цитокина и соответственно его меньшее биологическое влияние. Эти данные подтверждают известную связь между активностью цитокина TNF-а и опухолевой прогрессией, благодаря его способности усиливать клеточную пролиферацию, стимулировать неоангиогенез, а также потенцировать другие факторы воспаления, ускоряющие рост опухоли [8]. Выявление гетерозиготного состояния данного гена (G/A) может иметь благоприятную прогностическую значимость, ввиду большего времени, необходимого опухоли для лимфогенного и отдалённого метастазирования.

Также отмечено, что наличие у пациента помимо генотипа TNF (G308A) G/G мутантного гомозиготного аллеля MMP1 (1607 2G/2G) приводит к более агрессивному и быстрому опухолевому росту и является неблагоприятным прогностическим критерием. Вероятно, это связано с чрезмерным индуцирующим влиянием цитокина TNF-а на матриксные металлопротеазы, кодируемые геном MMP1, которые, в свою очередь, способствуют раннему метастазированию опухоли [9].

Мутация эндотелиального фактора роста сосудов VEGF является достоверно агрессивным фактором риска быстрого прогрессирования опухоли. В нашем исследовании мы не определяли количественно экспрессию данного гена в клетках опухоли, однако вполне возможно, что мутантный генотип данного аллеля (G/G) ассоциирован с повышенным ростом сосудов и быстрой прогрессией опухоли. Малая доля пациентов с IV стадией опухолевого процесса, включённых в исследование, не позволяет интерпретировать полученные результаты однозначно, но выявленное резкое увеличение мутации данного гена в этой группе требует дальнейшего изучения и возможного дополнительного иммуно-гистохимического обследования опухолевых тканей этих пациентов.

Заключение

Были проанализировано значение полиморфизма генов MTHFR (Ala222Val), XPD (Lis751Gln), XRCC1 (Arg194Trp), XRCC1 (Arg399Gln), XRCC1 (Arg208His), APE1 (Asp148Glu), hOGG1 (ser326Ces), P53 (Pro47Ser), VEGF (C654G), EGFR (A2073T), TNF (G308A), CHEK2 (Ile157Thr), MMP1 (1607 1G/2G), TIMP1 (C53CT) в развитии колоректального рака.

Исследованные гены встречаются одинаково часто у обоих полов вне зависимости от возрастной группы и не влияют на возрастной критерий манифестации колоректального рака, а также на локализацию и степень дифференцировки опухоли.

Выявлена достоверная связь полиморфизма гена TNF(G308A) и склонности опухоли к быстрой инвазии в глубжележащие ткани, что проявлялось выявлением заболевания на III-IV стадии. Наличие полиморфизма G/А следует считать благоприятным критерием, способствующим меньшей агрессивности опухоли (р<0,05). Наличие же мажорного генотипа G/G особенно в сочетании с гомозиготным мутантным аллелем гена MMP1 (1607 1G/2G) является неблагоприятным фактором, наиболее часто встречающимся у пациентов с впервые выявленным колоректальным раком на III-IV стадии (р<0,05).

Наличие гомозиготного мутантного генотипа G/G VEGF (C654G) может напрямую коррелировать с быстрой опухолевой прогрессией и активным метастазированием.

Углубление знаний о природе рака, особенностях его течения у конкретного больного в будущем помогут в улучшении результатов лечения пациентов, переходу к персонализированной терапии.