Oxidative carbonylation of proteins in muscle tissues with pronounced hyperhomocysteinemia

Cover Page

Abstract


Oxidative modification of proteins (OMP) in myocardium, skeletal muscle and aortic wall in rats with pronounced hyperhomocysteinemia accompanied by increased formation of free radicals, which follows to developing of oxidative stress, was found. 8ignificant increasing content of dynitrophenylhydrasons principal at the expense of primary markers of oxidative stress (ADNPH) in experimental group was detected. It enable us to speak about persistence fragments of oxidativly damaged proteins in muscle tissue. Content of secondary markers (KDNPH) also increased. Development of intensive oxidative damage accompanied by additional formation of aggregated molecules and also weakness of reserve -adaptative potential all investigated muscle tissues were shown.

Full Text

Динитрофенилгидразоны, сердечная мышца, миокард, сосудистая стенка, резервно -адаптационный потенциал. Необратимым окислительным повреждением белков, ведущим за собой потерю функции, является их карбонили-рование. Накопление карбонильных производных, которые способны вызывать нарушение и/или изменение структуры, функций биомолекул [10], играет важную роль в этиопатогенезе сердечно-сосудистых, нейродегенеративных заболеваний, а также в процессах старения. Активные формы кислорода/азота легко взаимодействуют с белковыми молекулами [11], а, в результате формирования вторичных продуктов оксидативного стресса, белки получают дополнительное окислительное повреждение [8]. Возрастание оксидативного/нитроза-тивного стресса, возникающего из-за высокой продукции свободных радикалов, впоследствии приводит к снижению антиоксидантной защиты клетки, имеющей многоуровневую систему. Последняя выражается в наличии низкомолекулярных внутри- и внеклеточных антиоксидантов, степени активности таких ферментов, как суперок-сиддисмутазы, каталазы, глутатионперок-сидазы, глутатионредуктазы [2]. Мощным последствием оксидативного стресса является повреждение структуры нуклеиновых кислот, липидов, белков, нарушения синтеза простагландинов, лейкотриенов, тром-боксанов [4]. Генерируются вторичные активные формы, которые стимулируют развитие некроза или апоптоза клеток [6]. Одним из факторов развития окислительного стресса является повышение концентрации гомоцистеина, основным источником которого является пищевой метионин. Лишаясь метильной группы, S-аденозил метионин превращается в S-аденозилгомоцистеин и 45 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. гидролизуясь, превращается в гомоцистеин, обладающий цитотоксичными свойствами. Материалы и методы Материалом для исследования послужили 36 гомогенатов мышечных тканей крыс-самцов линии Wistar массой 320 грамм. Экспериментальную гипергомо-цистеинемию у крыс осуществляли путем введения растворов метионина в Твин 80 [3] в течение 21 суток с дополнительным добавлением метионина в питьевую воду. В качестве контрольной группы использовались животные, сопоставленные с экспериментальной по полу и массе, получавшие Твин 80 per os в течение 21 дня. Измерение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Axis Shield (Норвегия). После выведения животного из эксперимента (обескровливание под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении), из навески тканей миокарда, скелетной мышцы и стенки аорты готовили гомогенат. Окислительную модификацию белков (спонтанную и металл-индуцированную) определяли во внелизосомальной фракции по методу R.l. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [4]. Продукты окислительного повреждения белков оценивали согласно авторской методики [8], а именно, график спектра ОМБ делился на области видимого света (λ 380-790 нм), ультрафиолетового излучения (λ 100-400) нм и на сегменты, где регистрировались альдегидные (АДНФГ) и кетонные карбонильные производные (КДНФГ) нейтрального и основного характера. Результаты исследования выражались в е.о.п/г белка. Содержание белка измеряли по методу Лоури с использованием коммерческого набора Клини Тест-БЛ НПЦ «Эко-сервис», СПб. Резервно-адаптационный потенциал оценивали путем расчета отношения общей площади под кривой динитрофенилгидра-зонов (ДНФГ) при спонтанном окислении к металл-индуцированному, принимая за 100% общее количество ДНФГ. Статистический анализ данных проводили ис пользуя программное обеспечение Microsoft Excel и программу Statistika 10. Для каждой выборки определяли медиану (Ме), верхний и нижний квартили [Q1; Q3]. Статистическую значимость отличий показателей экспериментальной группы от группы сравнения оценивали по U-критерию Манна-Уитни. Результаты и их обсуждение При сопоставлении результатов ОМБ миокарда контрольной и испытуемых групп, получили статистически значимое нарастание альдегидных, кетоновых динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера. Исходя из данных таблицы 1 видно, что содержание АДНФГ (первичных маркеров оксидативного стресса) [7], значительно превышает содержание КДНФГ. Это позволяет предположить персистен-цию фрагментов окислительно поврежденных белков в мышечной ткани. Аналогичная картина наблюдается при сравнении результатов ОМБ скелетной мышцы и сосудистой стенки экспериментальной и контрольной групп. Здесь также ярко просматривается тенденция к нарастанию уровня динитрофе-нилгидразонов (рис. 2, 3). Содержание первичных маркеров окислительного стресса - АДНФГ - значительно превалирует над КДНФГ (табл. 2, 3), уровень которых также статистически значимо вырос. Содержание КДНФГ сердечной и скелетных мышц выросло менее выра-женно, но также статистически значимо. В таблице 4 представлено соотношение динитрофенилгидразонов различных типов в контрольной и экспериментальной группах. Доля АДНФГ контрольной группы оказалась выше, той же доли при ГГЦ, а вот доля КДНФГ, как вторичного маркера окислительного стресса, оказалась выше в экспериментальной выборке по отношению к группе сравнения, что доказывает развитие достаточно интенсивного окислительного повреждения, сопровождающегося дополнительным образованием агрегированных окисленных молекул [7]. 46 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. 0,25 Рис. 1 . Спектры поглощения продуктов ОМБ миокарда Таблица 1 Площади под кривой компонентов спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков миокарда (е.о.п/г белка, Ме[Ц1;Ц3]) SАДНФГ нейтр. M[Qt;QJ SКДНФГ нейтр. M[Qt;Q3] SАДНФГ осн. M[Qt;Q3] SКДНФГ осн. M[Qt;Q3] S общая M[Qt;QJ Контрольная группа n=6 1,86 [1,50; 5,33] 0,39 [0,24; 0,55] 0,22 [0,04;0,35] 0,018 [0,004; 0,1] 2,32 [2,19; 5,42] Экспериментальная группа n=6 16,12* [11,46;16,53] 4,06* [3,03;4,41] 3,30* [3,04;3,76] 0,51* [0,45;0,68] 22,84* [19,96;24,1] Примечание: * -статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05) 0,3 0,25 230 261 291 322 352 383 414 442 473 503 534 Рис. 2. Спектры поглощения продуктов ОМБ скелетной мышцы 47 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Таблица 2 Площади под кривой компонентов спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков скелетной мышцы (е.о.п/г белка, Me[Q1;Q3]) S АДНФГ нейтр. M[Q1;Q3] S КДНФГ нейтр. M[Q1;Q3] 8АДНФГ осн. M[Q1;Q3] 8КДНФГ осн. M[Q1;Q3] S общая M[Q1;Q3] Контрольная группа n=6 4,66 [3,62; 6,44] 0,84 [0,67; 0,96] 0,75 [0,50; 0,95] 0,13 [0,07; 0,2] 6,39 [4,75; 8,07] Экспериментальная группа n=6 20,3 * [17,64; 27,14] 7,51 * [7,5; 9,15] 8,33 * [7,96;9,12] 0,93 * [0,91; 1,75] 37,83* [35,22;40,96] Примечание: * -статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05) Рис. 3. Спектры поглощения продуктов ОМБ стенки сосуда Таблица 3 Площади под кривой компонентов спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков сосудистой стенки (е.о.п/г белка, Ме^1^3]) 8АДНФГ нейтр 8КДНФГ нейтр 8АДНФГ осн. 8КДНФГ осн. 8общая Контрольная группа n=6 3,616 [2,46; 6,15] 0,83 [0,4; 0,88] 1,19 [0,93; 1,37] 0,2 [0,1; 0,27] 6,02 [5,95; 7,65] Экспериментальная группа n=6 28,02 * [26,02; 51,85] 14,3* [7,84; 15,93] 10,28 * [7,76;15,45] 1,74* [1,53; 2,84] 73,03* [43,15;119,1] Примечание: * -статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05) Оценивая резервно-адаптационный потенциал мышечных тканей (рис. 4, 5, 6), мы наблюдаем увеличение доли спонтанного окисления (8общ) в металл - индуцирован ном (8общ инд), что подтверждает выраженное снижение антиоксидантной защиты в экспериментальной группе по сравнению с контрольной выборкой. 48 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Таблица 4 Соотношение маркеров окислительного стресса мышечных тканей Миокард Скелетная мышца Стенка сосуда Контроль ГГЦ Контроль ГГЦ Контроль ГГЦ КДНФГ 16% 19% 15% 23% 19% 31% АДНФГ 84% 81% 85% 77% 81% 69% твин80 метионин ■ Sofiiii. 522 S обш ,инл=1 00% Рис. 4. Резервно-адаптационный потенциал миокарда 10% ·- ■- 0% -І-----I-1твин80 метионин S oGul S обиіл-інп=100% Рис. 5. Резервно-адаптационный потенциал скелетной мышцы Твин80 Метионин Бобщ. S общ. инд=100% Рис. 6. Резервно-адаптационный потенциал стенки сосуда 49 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. По-видимому, гомоцистеин при высоких концентрациях способен окисляться, формируя смешанные дисульфиды [13]. В результате этого образуются свободные радикалы, представленные супероксидом кислорода и перекисью водорода, что приводит к дополнительному образованию активных кислородных радикалов (АКР), что и ведет к развитию ок-сидативного стресса. Цитотоксическое действие гомоцистеина может приводить к нарушению функций различных орга-нелл клетки, а также нарушению процессов транскрипции и трансляции нуклеиновых кислот [14]. К примеру, митохондриальная дисфункция приводит к повышенному супероксидобразованию [5], в результате увеличивается вероятность повреждения мышечных тканей свободными радикалами. Это влечет за собой повышенное окисление миоглобина [ 12], дискоординацию связывания Са2+ с тропонином и стимулирования взаимодействия с другими сократительными белками, приводящего к ослаблению сократительной способности миокарда. Выраженная гипергомоцистеинемия напрямую связана с некрозом или апопто-зом мышечных клеток за счет активации фактора транскрипции NF - kB [1], с накоплением окислительно модифицированных белков в клетке или вне ее. Выраженная гипергомоцистеинемия приводит к так называемому порочному кругу, а именно, уменьшению протеолиза с одновременным накоплением окислительно-поврежденных белков. Выводы 1. Выраженная гипергомоцистеинемия сопровождается статистически значимым нарастанием содержания динитрофенилгидразонов, преимущественно за счет альдегидных производных. 2. Данная модель показывает развитие достаточно интенсивного окислительного повреждения, что сопровождается дополнительным образованием агрегированных окисленных молекул и истощением резервно - адаптационного потенциала мышечных тканей.

About the authors

A S Ilicheva

Email: sergan52006@rambler.ru

M A Fomina

Email: marya.fom@yandex.ru

References

  1. Глебов А.Н. Роль кислородосвязывающих свойств крови в развитии окислительного стресса, индуцированного липополисахаридом [Текст] / А.Н. Глебов, Е.В. Шульга, В.В. Зинчук. - Гродно, 2011. - 216 с.
  2. Кравченко Ю.В. Исследование системы антиокислительной защиты в условиях алиментарно индуцированного окислительного стресса [Текст] / Ю.В. Кравченко, Г.Ю. Мальцев, А.В. Васильев // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 50, № 5. - С. 477-483.
  3. Медведев, Д.В. Способ моделирования тяжелой формы гипергомоцистеинемии у крыс [Teкст] / Д.В. Медведев, В.И. Звягина, М.А. Фомина // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2014. - №4. - С. 42-46.
  4. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения [Текст] / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, №1. - С. 24-26.
  5. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания [Teкст] / Е.Б. Меньщикова [и др.]. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
  6. Паунова С.С. Апоптоз- физиология и патология (обзор литературы) [Teкст] / С.С. Паунова // Нефрология и диализ. - 2004. - №2. - С. 132-136.
  7. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях [Teкст] / Ю.И. Губский [и др.] // Современные проблемы токсикологии. - 2005. - Т. 8, №3. - С. 20-27.
  8. Фомина М.А. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях [Teкст] / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина; ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. - Рязань, 2014. - 60 с.
  9. Biomarkers of Oxidative Damage in Human Disease [Text] / Isabella Dalle-Donne [et al.] // Clinical Chemistry. - 2006. - Vol. 52, №4. - P. 601-623.
  10. Advanced glycationend products. Sparking the development of diabetic vascular injury [Text] / A. Goldin [et al.] // Circulation. - 2006. - Vol. 14. - P. 597-605.
  11. Colak E. New markers of oxidative damage to macromolecules [Text] / E. Colak // JMB. - 2008. - P. 1-16.
  12. Hydrogen peroxide plays a key role in the oxidation reactionof myoglobin by molecular oxygen - A computer simulation [Text] / T. Wasawa [et al.] // Biophys. J. - 1992. - Vol. 63. - P. 544-550.
  13. Lentz S.R. Homocysteine: Is it a clinical important cardiovascular risk factor? [Text] / S.R. Lentz, W.G. Haynes // Clev.Clin. J. Med. - 2004. - Vol. 71. -P. 729-734.
  14. Weisfeldt M.L. Oxygen-derived free radicals and myocardial ischemicinjury [Text] / M.L. Weisfeldt, J.L. Zweier, J.T. Flaherty // Heart Dis. - 1988. - № 3. -P. 60-72.

Statistics

Views

Abstract - 352

PDF (Russian) - 289

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2015 Ilicheva A.S., Fomina M.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies