CHANGES IN BALANCE OF T-HELPER SUBSETS IN THE GALT OF RATS UNDER CHRONIC ZOOSOCIAL STRESS AND MODULATION OF THE INTESTINAL MICROFLORA

Full Text

Современная ситуация в украинском обществе характеризуется высоким уровнем социального напряжения, что провоцирует развитие стресса, тревоги и депрессии. В свою очередь, стресс-индуцированная иммунная дисрегуляция приводит к значительным негативным последствиям для здоровья, увеличивая риск развития вирусных инфекций, хронических аутоиммунных и воспалительных заболеваний [12]. Так, во многих клинических и экспериментальных исследованиях было показано, что хронический социальный стресс (ХСС) может быть триггером развития многих патологических состояний, включая сахарный диабет 1 типа (СД 1 типа) и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), в механизмах развития которых, в свою очередь, важную роль играют нарушения дифференцировки различных субпопуляций Т - хелперов, в частности, дисбаланс Th1/Th2 и Treg/Th17-клеток в кишечноассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) [10]. Ключевыми регуляторами образования Th1 и Th2 являются транскрипционные факторы T-bet и GATA-3, нокаут по генам которых (ТВХ21 и GATA3) блокирует развитие соответствующих лимфоцитов [13, 14]. Дифферен-цировка Th17 и Т-регуляторных клеток, в свою очередь, зависит от экспрессии транскрипционных факторов RORyt и Foxp3. Экспериментальная трансдукция Foxp3 внерегуляторные Foxp3-CD25-CD4 "наивные" Т-клетки человека или мышей придает последним функциональные свойства и фенотип ^eg [2], а нокаут гена RORyt приводит к потере способности CD4+Т - клеток дифференцироваться в ^П-клетки; их способность к выработке IL-17 резко ослабевает [9]. У мышей с такой патологией невозможно индуцировать аутоиммунные процессы [9]. Характерно, что именно тонкий кишечник, особенно подвздошная кишка, является основным местом генерации индуцибель-ных ^eg - клеток (ffreg) и резервуаром 44 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. пула ТЫ7-клеток, так как именно здесь происходит индукция их дифференци-ровки из наивных Т-лимфоцитов с участием кишечной микрофлоры [6]. Учитывая это, целью нашей работы было выявить особенности соотношения Th1/Th2 и Treg/Th17-лимфоцитов в КАЛТ крыс в условиях ХЗС и модуляции состава кишечной микрофлоры. Материалы и методы Исследования проводились на 70 самках крыс линии Wistar, которые были разделены на семь экспериментальных групп: контрольные крысы, которым ин-трагастрально (и/г) в течение 3-х недель вводили по 0,5 мл физиологического раствора (группа 1); крысы, которым моделировали ХЗС1 путем трехнедельной социальной изоляции и длительного психоэмоционального воздействия (ПЭВ), предполагавший перманентное проживания самок в «агрессивной среде», а именно, через перфорированную перегородку в клетке с агрессивным самцом, который ежедневно вступал в конфронтации с подсаженным к нему другим самцом (группа 2); крысы, которым моделировали ХЗС2 путем содержания животных в перенаселенных клетках (20 крыс на клетку) в течение 3 недель с ежедневной сменой группировки, при котором подопытную самку каждый день помещали в новую сбалансированную и перенаселенную колонию (группа 3); крысы с ХЗС1 и ХЗС2, которым осуществляли модуляцию состава кишечной микрофлоры путем внутрижелудочно-го (и/г) введения аминогликозидного антибиотика канамицина (Can) в течение 7 суток ежедневно, начиная с 3-й недели моделирования ХЗС в дозе 15 мг/кг (группы 4 и 5, соответственно); крысы с ХЗС1 и ХЗС2, которым осуществляли модуляцию состава кишечной микрофлоры путем и/г ежедневных введений Лактобактерина (Lb, смесь живых лиофильно высушенных лактобактерий L. plantarum штамм 8Р - A3 и L. fermentum штамм 90Т - С4) в течение 3-х недель в дозе 4·108 КОЕ (группы 6 и 7, соответственно). Уровень эмоционально -поведенческой и исследовательской активности изучали в тестах «открытое по ле» и «перегородка»; в тесте Порсолта («принудительного плавания», ПП) определяли уровень депрессивности животных. Крыс выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Структуру популяции T-bet+-, GATA3+-, RORyt+- и Foxp3+-клеток изучали на основании анализа серийных гистологических срезов и данных их морфометрических и денситометрических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы подвздошной кишки. Данные срезы депа-рафинировали в ксилоле, проводили регидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%), отмывали в 0,1М фосфатном буфере (рН=7,4) и красили с первичными кроличьими поликлональными антителами (ПКАТ) к транскрипционным факторам T-bet, GATA3, RORyt и Foxp3 крысы (Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 18 часов во влажной камере при Т=4оС. После отмывания избытка первичных антител в 0,1М фосфатном буфере, срезы инкубировали 60 минут (Т=37оС) с вторичными антителами к полной молекуле IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology, США), конъюгированными с FITC. После инкубации срезы промывали 0,1М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (1:9) для последующей люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Изображение, получаемое на микроскопе PrimoStar (ZEISS, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) с помощью высокочувствительной камеры AxioCam 5c (ZEISS, Германия) и пакета программ для получения, архивирования и подготовки изображений к публикации AxioVision 4.7.2 (ZEISS, Германия) немедленно вводилось в компьютер. При этом в автоматическом режиме определялись области со статистически значимой флюоресценцией, характерной для клеток, экспрессирующих T-bet, GATA3, RORyt и Foxp3. 45 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Рассчитывались морфометрические и денситометрические характеристики имму-нопозитивних клеток. При окраске МКАТ исследовали T-bet+, GATA3+, RORyt+ и Foxp3+ - лимфоциты, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки заполненных лимфоцитами ворсинок (Lymphocyte-filled villi, LFV, ЗЛВ), являющиеся отдельным компартментом КАЛТ у крыс и в субэпителиальной зоне сгруппированных лимфоидных узелков (СЭЗ, PPSubep). Все полученные экспериментальные данные обрабатывали на персональном компьютере пакетом прикладных и статистических программ EXCEL из пакета MS Office 2010 (MicrosoftCorp.США), STATISTICA 6.0 (Stat - Soft, 2001). Результаты и обсуждение Известно, что у животных в условиях длительного ПЭВ или зоосоциальной изоляции формируется патологическое состояние, которое характеризуется выраженной тревожностью, снижением исследовательской и двигательной активности, коммуникативности и болевой чувствительности, нарушениями эстрального цикла, полового/социального распознавания, развитием депрессивности [1]. Кроме того, у таких животных наблюдается весь спектр свойственных стрессу реактивных изменений, а имен но, увеличение массы надпочечников, уровня адреналина и норадреналина, высвобождение кортикостерона и др. [1]. Результаты проведенного нами тестирования экспериментальных животных в тесте "Открытое поле" показали, что развитие ХЗС приводило к достоверному снижгнию основных показателей двигательно-исследовательской и эмоциональной активности: горизонтальной двигательной активности (на 25%, р<0,05 (ХЗС1) и 29%, р<0,05 (ХЗС2)), вертикальной двигательной активности (на 38%, р<0,05 (ХЗС1) и 47%, р<0,05 (ХЗС2)) и исследовательской активности (на 41%, р<0,05 при ХЗС1 и на 54%, р<0,05 в случае ХЗС2). Полученные результаты свидетельствовали о проявлении выраженной тревожности у крыс в условиях хронического зоосоциаль-ного стресса (табл. 1). Кроме того, ХЗС приводил к достоверному усилению груминга (на 75%, р<0,05 при ХЗС1 и на 92%, р<0,05 в случае ХЗС2) и актов дефекации (болюсы) (в 3,6 раз, р<0,05 при ХЗС1 и в 2,8 раз, р<0,05 в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой крыс (табл. 1). Следует указать, что снижение двигательной активности крыс на фоне заметно возросшего груминга, по мнению ряда исследователей [8] свидетельствует о развитии стресса и тревожнодепрессивных изменений поведения. Таблица 1 Результаты поведенческих тестов крыс, подвергнутых ХСС Серии контроль ХСС 1 ХСС 2 Тест «Открытое поле» ГДА 62,9±3,6 47,0±5,21 44,5±3,61 ВДА: climbing 12,5±0,8 7,8±1,11 6,6±0,81 rearing 4,8±0,7 2,4±0,3 4,5±0,7 Груминг: короткий 1,2±0,2 2,1±0,31 2,3±0,31 длительный 1,0±0,2 0,9±0,1 0,8±0,1 Обследование отверстий 6,8±0,4 4,0±0,31 3,1±0,31 Уровень дефекации 0,5±0,3 1,8±0,41 1,4±0,21 Тест «Принудительное плавание» Активное плавание, сек. 121,6±9,3 73,5±11,21 70,2±8,51 Пассивное плавание, сек. 42±16,3 56±16,1 48,3±8,6 Иммобилизация, сек. 136,4±10,2 170,5±8,51 179,5±8,71 Тест «Перегородка» Число подходов к перегородке, к-во 5,4±0,8 2,1±0,21 2,6±0,31 Длительность нахождения, сек 53,9±6,4 33,9±3,71 37,3±5,21 Обнюхивание, к-во 5,7±0,7 5,3±1,1 4,3±0,8 Вставание на задние лапки, к-во 3,8±0,5 4,2±1,0 4,7±0,8 Г руминг 3,1±0,4 2,6±0,3 2±0,4 Фризинг (замирание) 0,1±0,1 0,1±0,1 0,5±0,11 Примечание: тролюp<0,05 (). - вероятность суждения об отсутствии различий средних величин по отношению к кон- 46 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Хронический зоосоциальный стресс вызывал изменение поведения крыс и в тесте Порсолта на определение тревожности. Так, результаты тестирования экспериментальных животных в тесте ПП показали, что развитие ХЗС приводило к достоверному снижению длительности активного плавания (на 39%, р<0,05 при ХЗС1 и на 42%, р<0,05 в случае ХЗС2) и увеличению стадии иммобилизации (на 25%, р<0,05 в случае ХЗС1 и на 32%, р<0,05 при ХЗС2) по сравнению с контролем (табл. 1). Полученные результаты свидетельствовали о формировании депрессивного состояния у животных. Результаты тестирования экспериментальных животных в тесте "Перегородка" также показали, что развитие ХЗС приводило к развитию повышенной тревожности у самок крыс, о чем свидетельствовало достоверное снижение числа подходов к перегородке (на 61% р<0,05 при ХЗС1 и на 52%, р<0,05 в случае ХЗС2), среднего времени пребывания у перегородки (на 37%, р<0,05 при ХЗС1 и на 31%, р<0,05 в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Кроме того, было зафиксировано статистически значимое увеличение фризинга при ХЗС2 (в 5 раз, р<0,05). Следует отметить, по данным литературы, фризинг - это реакция проявления наиболее сильного стресса [5]. Изучения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов показало, что развитие ХЗС не влияло на соотношение Tbet+/Gata3+-клеток в ЗЛВ подвздошной кишки крыс и приводило к достоверному повышению данного коэффициента в СЭЗ (на 75% (р<0,05) при ХЗС1 и на 46% (р<0,05) в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой животных (рис. 1А). Наряду с этим, при развитии ХЗС прослеживается общая тенденция к достоверному снижению соотношения Treg/Th17-лимфоцитов в лимфоидных структурах подвздошной кишки крыс, наиболее выраженная в ЗЛВ. Так, коэффициент распределения Foxp3+/Roryt+-клеток уменьшился в ЗЛВ в 4,1 раза (р<0,05) в случае ХЗС1 и в 3,5 раза (р<0,05) при ХЗС2; в СЭЗ - на 39% (р<0,05) при ХЗС1 и в 3,8 раза (р<0,05) в случае ХЗС2, по сравнению с контролем (рис. 1D). Данные изменения свидетельствуют о доминировании в условиях ХЗС Th1- и ^П-дифференцировки, что повышает уровень про-воспалительной сигнализации в кишечнике. Полученные нами результаты совпадают с данными Hong M. е! al. (2013), которые свидетельствуют о том, что при развитии стресса и стресс-индуцированной депрессии в лимфоидных органах у мышей изменяется количество ^П-лимфоцитов, и нарушается баланс между Th17/Treg-клетками [7]. Также Schmidt D. е! al. (2010) показали, что ХЗС приводит к активации иммунной системы, стимулирует дифференцировку про-воспалительных Th17- и Th1-клеток в периферических лимфатических узлах экспериментальных животных, снижает количество Тreg-лимфоцитов и вызывает спонтанное развитие стрессиндуцированного колита [3]. Введения Can стрессированным животным приводили к достоверному увеличению соотношения Th1/Th2-лимфоци-тов только в случае ХЗС1 (в ЗЛВ в 2,1 раза, р<0,05 и в СЭЗ на 37%, р<0,05) и не влияли на этот баланс при ХЗС2 (рис. 1В). При этом коэффициент распределения Foxp3+/Roryt+-клеток вырос в ЗЛВ в 2,9 раза (р<0,05) при ХЗС1 и в 2,7 раза (р<0,05) в случае ХЗС2, в СЭЗ - на 61% (р<0,05) только в случае ХЗС2 (рис. 1Е). Таким образом, несмотря на доминирование 'ГЫ-субпопуляции после введения Can стрессированным животным наблюдается и одновременное относительное увеличение числа Т-регуляторных клеток, способных нивелировать их эффекторные функции. При введении Lb экспериментальным животным изменения в соотношении Tbet+/Gata3+-лимфоцитов носили разнонаправленный характер - Th1/Th2 баланс снижался в ЗЛВ (на 18% (р<0,05) при ХЗС1 и на 29% (р<0,05) в случае ХЗС2) и повышался в СЭЗ (на 29% (р<0,05) при ХЗС1 и на 24% (р<0,05) в случае ХЗС2) (рис. 1С). В тоже время, соотношение 47 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 stress Th1/Th2 ratio □ LFV DPP Subep A -ίrh 0.84 0.76 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 stress + Can Th1/Th2 ratio □ LFV QPP Subep * I* * rh B stress 1 + stress 2 + Can Can 1.5 I 1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 stress + Lact Th1/Th2 ratio □ LFV DPP Subep rh rh r-h ι-h 0.76 1.03 0.93 0.86 C stress 2 stress 1 + stress 2 + Lact Lact 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 stress Treg/Th17 ratio □ LFV QPP Subep r*i 0.95 stress 1 D 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 stress + Can Treg/Th17 ratio □ LFV DPP Subep E * ί* * ph -Ϊ- 0.95 00 1.23 0.81 1.36 stress 1 + stress 2 + Can Can 2.7 2.2 1.7 1.2 stress + Lact Treg/Th17 ratio □ LFV DPP Subep Г* [Од 0.95 |^оГу [Oïl 2.1 1.68 1.22 ί.37! stress 1 stress 2 stress 1 + stress 2 + Lact Lact Рис. 1. Соотношение T-bet+/GATA3+-лимфоцитов (Th1/Th2) и Foxp3+/Roryt+-лимфоцитов (Treg/Th17) в ЗЛВ (LFV) и СЭЗ (PPSubep),* - p<0,05 Foxp3+/Roryt+-клеток после введения пробиотика стрессированным крысам однонаправленно увеличивалось во всех изученных нами морфофункциональных зонах, наиболее интенсивно - в ЗЛВ. Так, коэффициент распределения Treg/Th17-лимфоцитов увеличился в ЗЛВ в 5 раз (р<0,05) при ХЗС1 и в 2,4 раза (р<0,05) в случае ХЗС2; в СЭЗ - на 77% (р<0,05) при ХЗС1 и в 5,8 раз (р<0,05) в случае ХЗС2 (Рис.Щ. Полученные результаты совпадают с рядом исследований, продемонстрировавших способность Lb увели чивать количество Treg-клеток и, таким образом, предотвращать развитие воспалительных и АИЗ, а также уменьшать состояние депрессии и тревоги в условиях стресса [4]. Повышая уровень Treg, Lb оказывает антидиабетогенное действие в условиях стрептозотоцин - индуцированного диабета и у BB-DP крыс путем индукции CD4+CD25+Foxp3+-клеток, уменьшает риск развития болезни Крона и язвенного колита [11]. Вместе с тем, Chiba Y. Et al. (2010) продемонстрировали, что Lactobacillus casei увеличивают продук stress 1 stress 2 stress 1 stress 2 stress 1 stress 2 F stress 1 stress 2 48 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. цию IL-12 клетками селезенки и ПБ мышей даже сильнее, чем некоторые патогенные бактерии, что, в свою очередь, стимулирует образование Th1 - клеток и продукцию про-воспалительного IFNy [15]. Способность Lb увеличивать соотношение Tbet+/Gata3+-лимфоцитов в СЭЗ была обнаружена и нами. Выводы 1. Развитие хронического зоосоци-ального стресса сопровождается дисбалансом субпопуляций Т-хелперов в КАЛТ, приводя к увеличению соотношения Tbet+/Gata3+ и снижению Foxp3+/Roryt+-клеток, свидетельствуя о доминировании в условиях хронического зоосоциального стресса Th1- и Thn-дифференцировки и повышении уровня про-воспалительной сигнализации в кишечнике. 2. Введение канамицина стрессиро-ванным животным приводит к доминированию Th1- и Ті^-субпопуляций, а модуляция кишечной микрофлоры лактобакте-рином снижает соотношении Tbet+/Gata3+-лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок, увеличивает в субэпителиальной зоне и однонаправленно повышает коэффициент Treg/Th17.

References

Supplementary files