Influence of the thyroxine on the functional activity of the р-glycoprotein in the experiment

Abstract

In the research on the rabbits influence of a L-thyroxine on the activity of the protein- transporter Р-glycoprotein (Pgp) was studied. Activity of the Pgp was investigated on the pharmacokinetics of its marker substrate fexofenadine. It was established that introduction of a L-thyroxine within 14 days lead to dose-dependent rising of Рgp activity.

Full Text

Гликопротеин-Р (Pgp) – белок-транспортер, обеспечивающий выведение липофильных ксенобиотиков и ряда биобиотиков из клеток и как следствие защиту организма от действия лекарственных и токсических веществ [1]. В эксперименте и клинике исследовано большое количество препаратов как естественного, так и синтетического происхождения, которые оказывают влияние на функциональную активность Pgp, причем как индуцирующее, так и ингибирующее. Подобное воздействие на белок-транспортер приводит в конечном счете к значительным нарушениям фармакокинетики лекарственных веществ и, как следствие, к изменению их фармакологической активности [1]. Влияние тиреоидных гормонов на функциональную активность Рgp остается недостаточно изученным. Цель настоящего исследования – изучить влияние L-тироксина на функциональную активность Рgp у кроликов породы шиншилла. Материалы и методы Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах породы шиншилла, средней массой 3500±100 г. В исследование включали самок, которые находились в состоянии течки. L-тироксин (Berlin-Chemi Menarini) вводили подкожно в течение 14 дней: 6 самкам – в дозе 25 мкг/кг массы (серия низкая доза тироксина) и 6 самкам – в дозе 100 мкг/кг массы (серия высокая доза тироксина). За сутки до начала эксперимента, через 14 дней введения L-тироксина и на 5 день отмены препарата у животных определяли активность Pgp и уровень ТТГ, Т3 и Т4 в сыворотке крови. Активность белка-транспортера оценивали по концентрации в плазме крови его маркерного субстрата – фексофенадина (Sanofi Aventis). Фексофенадин вводили животным перорально с помощью металлического зонда в дозе 30 мг/кг массы. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа от момента введения препарата из ушной вены кроликов забирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -290С. Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Beckman Coulter» с ультрафиолетовым детектором и колонке «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. [2] в собственной модификации. Анализ выполняли при длине волны 225 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. Использовали подвижную фазу следующего состава: 133,7 мл бидистиллированной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтиламина (Chem-Lab), доведенной ортофосфорной кислотой до рН 4 и 64 мл ацетонитрила (Chem-Lab). Осуществляли жидкостную экстракцию фексофенадина из плазмы крови. В качестве экстрагентов использовали дихлорметан (ACROS ORGANICS), этилацетат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИММЕД). Коэффициент экстракции составил 53%. Количественное определение фексофенадина выполняли по методу абсолютной калибровки, с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Представлено уравнение калибровочной зависимости для определения фексофенадина в плазме крови: y = ах + b = -0,0001+9,4089*10-6*x, где у – высота пика фексофенадина в единицах экстинкции, х – содержание фексофенадина в стандартном растворе в нг/мл. Коэффициент регрессии r для данной калибровочной зависимости равнялся 0,9958. Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими характеристиками: время удерживания – 13,7 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови 90 нг/мл; точность – 4,2%. Вычисление концентрации фексофенадина осуществляли с помощью программы Gold. Фармакокинетические параметры (максимальную концентрацию – Cmax, площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время AUC0-∞, общий клиренс, объем распределения) рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение Cmax/AUC0-∞ рассчитывали самостоятельно. Уровень гормонов определяли радиоиммунным методом с применением стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей обработкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ РязГМУ. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программ Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой серии использовали тест ANOVA повторных измерений, межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для каждого показателя рассчитывали среднее арифметическое значение и ошибку среднего (М±m). Результаты и их обсуждение Введение как низкой дозы (25 мкг/кг массы) так и высокой дозы L-тироксина (100 мкг/кг массы) приводило к развитию выраженного гипертиреоза, что проявлялось повышением уровней Т4 на 249,5% (p<0,05) и 245,1% (p<0,05), Т3 на 496,1% (p<0,05) и 450,0% (p<0,05) и снижением содержания ТТГ в сыворотке крови на 36,9% (p<0,05) и 19,4% (p<0,05) соответственно по сравнению с исходными значениями (табл. 2). Более выраженные изменения показателей у животных, получавших низкую дозу L-тироксина, связаны с исходно более низкими показателями уровней Т4, Т3 и более высоким уровнем ТТГ в данной серии опыта (табл. 2). На 5 день отмены низкой дозы L-тироксина происходила нормализация гормонального статуса лабораторных животных (p>0,05). В отличие от данных этой серии на 5 день отмены высокой дозы L-тироксина содержание Т3 оставалось повышенным на 133,3% (p<0,05), концентрация Т4 снижалась на 39,9% (p<0,05), уровень ТТГ соответствовал норме. При изучении фармакокинетики фексофенадина – маркерного субстрата Рgp на фоне введения тироксина, получены результаты, которые представлены в таблице 1. Применение кроликам L-тироксина в дозе 25 мкг/кг в течение 14 дней вызывало снижение Сmax (ключевого показателя оценки функциональной активности Рgp) на 39,4% (p<0,05) по сравнению с исходным значением. Остальные фармакокинетические параметры имели лишь тенденцию к изменению: AUC0-∞ – к уменьшению, а общий клиренс, объем распределения и отношение Cmax/AUC0-∞ – к увеличению. На 5 день отмены L-тироксина изучаемые параметры достоверно от исходных значений не отличались. При введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы в течение 14 дней наблюдалась схожая динамика показателей, но выраженная в большей степени. Сmax снизилась на 54,9% (p<0,05), AUC0-∞ – на 63,7% (p<0,05), общий клиренс увеличился на 183,3% (p<0,05). Объем распределения и отношение Cmax/AUC0-∞ имели тенденцию к увеличению (p>0,05). На 5 день отмены высокой дозы L-тироксина Сmax оставалась сниженной на 16,8% (p<0,05), остальные изучаемые фармакокинетические параметры достоверно от исходных значений не отличались (p>0,05). Снижение Сmax и AUC0-∞ фексофенадина, более выраженное при введении высокой дозы L-тироксина, свидетельствует о повышении активности белка-транспортера Рgp. В тоже время увеличение общего клиренса (характеризующего выведение лекарственных веществ из организма) и отсутствии изменений в отношении Cmax/AUC0-∞ (характеризующего всасывание лекарственных веществ) можно рассматривать как косвенное свидетельство селективного повышения активности Рgp под действием L-тироксина в печени и почках – органах ответственных за выведение фексофенадина (80% препарата активно секретируется Рgp в желчь и 20% в мочу). Данная гипотеза согласуется с результатами полученными ранее в эксперименте на крысах с гипертиреозом, в котором установлено, что экспрессия Pgp существенно повышалась в печени и почках, умеренно в тощей и подвздошной кишке [7]. Более выраженные изменения фармакокинетики фексофенадина при введении L-тироксина в дозе 100 мкг/кг массы по сравнению с дозой 25 мкг/кг являются следствием дозозависимой индукции Рgp. Молекулярные механизмы индукции и ингибирования Рgp в настоящий момент активно изучаются. Описано повышение экспрессии гена MDR1, кодирующего Рgp, под действием ЦОГ-2 [8], фактора индуцируемого гипоксией [4], за счет активации ядерного прегнан-Х-рецептора [5]. Предполагается, что индукция Рgp может быть опосредована через фактор некроза опухоли альфа [3]. Активация Рgp под влиянием тироксина может быть связана со стимуляцией ядерных рецепторов и индукцией экспрессии Рgp, которая опосредована увеличением транскрипции мРНК гена mdr1, что обнаружено в ткани почек у крыс [9]. На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 обнаружено, что Т3 выводится из клеток Pgp [6]. Аналогичные данные получены для Pgp в гематоэнцефалическом барьере. Показано, что белок – транспортер регулирует проникновение Т4 в спинно-мозговую жидкость [10]. Таким образом, тиреоидные гормоны являются субстратами и тканеспецифичными индукторами Pgp, а дисфункция щитовидной железы способна существенно изменять фармакокинетику лекарственных веществ. Выводы 1. Введение кроликам L-тироксина подкожно в дозах 25 и 100 мкг/кг массы в течение 14 дней приводит к развитию экспериментального гипертиреоза, который сопровождается повышением уровней Т3 и Т4 и снижением уровня ТТГ в сыворотке крови. 2. L-тироксин, назначаемый кроликам в течение 14 дней, вызывает повышение активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина, что подтверждается снижением Сmax (дозы 25 и 100 мкг/кг), а также уменьшением AUC0-∞ и увеличением общего клиренса (доза 100 мкг/кг). 3. L-тироксин является дозозависимым индуктором гликопротеина-Р. Основные фармакокинетические параметры фексофенадина при введении тироксина (М±m) Серии эксперимента Изучаемые параметры Сmax, нг/мл AUC0-∞ , нг/ч×мл Общий клиренс, л/ч Объем распределения, л Сmax / AUC0-t Доза тироксина 25 мкг/кг Исходные значения 385,9±54,7 6886,9±1351,5 16,1±4,0 344,3±52,3 0,072±0,021 Тироксин 14 дней 234,0±22,4*, ** 3795,7±767,7 30,1±6,5 446,1±49,2 0,077±0,017 5 день отмены 320,1±24,1 4841,6±1011,8 22,2±3,6 360,3±25,1 0,081±0,016 Доза тироксина 100 мкг/кг Исходные значения 399,8±14,2 5336,4±717,3 18,6±2,6 329,9±47,5 0,084±0,0135 Тироксин 14 дней 180,3±9,8*, ** 1937,1±666,3*,** 52,7±14,4*,** 445,9±72,9 0,144±0,04 5 день отмены 332,4±14,3* 4881,5±763,0 21,3±3,7 372,5±20,8 0,076±0,01 * – p<0,05 – достоверные различия со значениями у интактных животных (исходные значения), ** – p<0,05 – достоверные различия со значениями на 5 день отмены препарата. Таблица 2 Гормональный статус кроликов при введении тироксина (М±m) Серии эксперимента Изучаемые параметры ТТГ, мМЕ/л T3, нмоль/л Т4, нмоль/л Доза тироксина 25 мкг/кг Исходные значения 0,73±0,03 1,3±0,1 39,8±0,6 Тироксин 14 дней 0,46±0,02*, ** 7,8±0,3*, ** 139,1±13,0*, ** 5 день отмены 0,70±0,03 1,1±0,03 60,7±7,5 Доза тироксина 100 мкг/кг Исходные значения 0,62±0,02 1,8±0,09 70,0±4,3 Тироксин 14 дней 0,50±0,03* 9,9±0,5*, ** 241,6±12,9*, ** 5 день отмены 0,59±0,03 4,2±0,6* 42,1±1,8 * * – p<0,05 – достоверные различия со значениями у интактных животных, ** – p<0,05 – достоверные различия со значениями на 5 день отмены препарата.