Method for the quantative determination of β-hydroxysimvastatin in blood plasma

Abstract

Article is devoted working out of an original HPLC method of quantitative determination of β-hydroxysimvastatin in the blood plasma. In work the HPLC system "Stayer" with the spektro-photometric detector was used. Analysis was achieved on the reversed phase column «Beckman Coulter». Separation of β-hydroxysimvastatin from the blood plasma carried out a method liquid Extraction

Full Text

Симвастатин является одним из наиболее эффективных лекарственных средств для коррекции дислипидемии. [2] Появление множества дженериков дает возможность сделать терапию симвастатином более доступной для пациентов. Действие препарата связано с обратимой блокадой 3-гидрокси-3-метилглютарил коэнзим А (HMG-CoA) редуктазы – ключевого фермента синтеза холестерина. Симвастатин снижает уровень общего холестерина, липопротеинов низкой плотности, аполипопротеина В и триглицеридов, а также умеренно повышает уровень липопротеинов высокой плотности. [1] Препарат подвергается интенсивному метаболизму при первичном прохождении через печень с образованием 5 метаболитов, из которых наиболее выраженной гиполипидемической активностью обладает β-гидроксисимвастатин. При этом концентрация самого симвастатина в общем кровотоке весьма низкая. [6] Биотрансформация симвастатина может существенно изменяться под влиянием лекарственных средств и при различных патологиях, изменяющих активность печеночных цитохромов Р-450. Для изучения фармакокинетики, а также исследования биоэквивалентности дженериков симвастатина определяют концентрацию препарата и его основного метаболита – β-гидроксисимвастатина – в биологических жидкостях. В настоящее время существует множество точных методов количественного определения лекарственных веществ. Электрохимические методы являются простыми в эксплуатации и относительно дешевыми, но при этом они обладают рядом недостатков, таких как невысокая стабильность электролита и непродолжительный службы электролитического элемента [4]. Самый избирательный и высокочувствительный метод количественного анализа – хроматомасс-спектрометрия, однако он требует дорогостоящего оборудования, поэтому мало доступен отечественным лабораториям. [3] При использовании метода газовой хроматографии имеются ограничения по термоустойчивости соединений, а пробоподготовка является весьма трудоемкой. [5] Применение высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) дает возможность упростить обработку проб, существенно сократить общее время анализа, а использование современных обращенно-фазных колонок позволяет добиться хорошего разделения компонентов. Наиболее распространенным способом детектирования веществ в ВЭЖХ является УФ-спектрофотометрия. [3] Материалы и методы В работе использована ВЭЖХ система серии «Стайер» со спектрофотометрическим детектором UVV 104. Хроматограф оборудован петлевым дозатором «Reodyne 7125» с петлей ввода на 50 мкм. Ввод проб в петлю осуществлялся с помощью шприцов «Hamilton». Исследование проводилось с применением обращенно-фазной колонки «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Как вспомогательное оборудование использовалась центрифуга «Elmi CM 6M», встряхиватель пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi), встряхиватель лабораторный медицинский «Vortex» (Elmi), роторно-вакуумный испаритель «VV – Micro» (Heidolph). В качестве стандарта β-гидроксисимвастатина использовался «Simvastatin Hydoxy Acid, Ammonium Salt» производства «United States Biological», имеющий сертификат качества. Рабочий раствор (100 мкг/мл) готовился на метаноле и хранился при 40С. Для приготовления подвижной фазы и обработки проб применялись реактивы марки ВЭЖХ: ацетонитрил («Pancreac»), дихлорметан («Pancreac»), метанол («Sharlau»); марки ОСЧ: пропанол – 2 («Химмед»); марки ЧДА: кислота ортофосфорная («Химмед»), калий фосфорно-кислый двузамещенный («Химмед»); 0,01 М фосфатный буфер pH=7,4 («Sigma»). Для растворения фосфатного буфера использовалась бидистиллированная вода. В качестве биологического материала для подбора условий хроматографирования из ушной вены кроликов породы шиншилла отбирались образцы крови в объеме 5 мл. Для отделения плазмы пробы центирифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -290С. Для сбора и обработки хроматографических данных применялся программно-аппаратный комплекс «Мультихром для Windows 9x & NT». Результаты и их обсуждение В результате серии экспериментов с использованием подвижной фазы различного состава и изменениями условий обработки проб для определения β-гидроксисимвастатина оптимальными стали приведенные ниже условия хроматографирования. Анализ проводился при длине волны 238 нм и термостатировании колонки при 450С. Использовалась подвижная фаза с содержанием ацетонитрила и фосфатного буфера в соотношении 70:30, доведенная кислотой ортофосфорной концентрированной до pH=4,5. Перед использованием подвижная фаза фильтровалась через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм и дегазировалась под вакуумом в течение 20 минут. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. Экстрагирование β-гидроксисимва-статина проводилось методом жидкостной экстракции. Для этого к 1 мл плазмы добавляли 500 мкл КН2РО4 и перемешивали на приборе «Vortex» 10 секунд, затем добавляли 4,5 мл дихлорметана и 0,5 мл пропанола-2 и помещали на 10 минут на встряхиватель пробирок. После центрифугирования в течение 20 минут при 3000 об/мин органический слой отбирали в колбы для упаривания, которые помещали в роторно-вакуумный испаритель. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы, из них 100 мкл наносили на колонку хроматографа. Количественное определение β-гидроксисимвастатина проводилось методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Для этого использовались калибровочные растворы с концентрациями препарата 100; 200; 500; 1000; 1250; 2500; 5000 нг/мл. Для приготовления калибровочных растворов к плазме крови интактных кроликов добавляли стандартный раствор β-гидроксисимвастатина и перемешивали на приборе «Vortex» в течение 10 секунд. Разработанная методика обладала следующими характеристиками: время удерживания β-гидроксисимвастатина 12±0,3 мин, предел его обнаружения 100 нг/мл. Коэффициент экстракции составил 82%. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций от 100 до 5000 нг/мл. Калибровочный график (рис. 1) описывался линейный уравнением: у = 0,1268х – 5.197, где х – концентрация препарата, у – высота хроматографического пика. Величина коэффициента регрессии оказалась близка к 1 (0,9987). Точность и воспроизводимость метода были рассчитаны по результатам 5 параллельных измерений 7 концентраций препарата, и составили 3,9% и 89,4-113,64% соответственно. Образцы полученных хроматограмм представлены на рисунках 2-4. Выбор хроматографической колонки и длины волны производился на основе анализа литературных данных. В большинстве методик, разработанных зарубежными авторами, использовались обращено-фазные колонки с привитой фазой С18 и длина волны 238 нм. [7 – 13] При ее изменении в ту или иную сторону чувствительность метода снижалась. Для приготовления подвижной фазы были испробованы различные варианты с применением растворителей наиболее часто используемых в ВЭЖХ [5]: - метанол и вода в соотношении 80:20; 90:10; - ацетонитрил и вода в соотношении 80:20; 70:30; 60:40; - метанол, ацетонитрил, вода в соотношении 60:20:20; 40:40:20. Рис. 2. Типичная хроматограмма стандартного раствора β-гидроксисимвастатина с концентрацией 10 мкг/мл Рис. 3. Типичная хроматограмма пробы интактной плазмы крови кролика Рис. 4. Типичная хроматограмма пробы плазмы крови кролика при однократном введении симвастатина Время удерживания β-гидроксисимвастатина при использовании подвижных фаз, содержащих метанол, составляло более 25 мин. Видимо, это связано с их большой вязкостью, что затрудняет применение колонок, заполненных частицами сорбента размером 5 мкм[5], поэтому выбор элюента был остановилен на ацетонитриле. При использовании ацетонитрила с водой в соотношении 80:20 время удерживания β-гидроксисимвастатина совпадало со временем элюирования с колонки компонентов плазмы, а использование фазы с соотношением 60:40 привело к уменьшению чувствительности метода и увеличению времени удерживания более 20 мин даже при нарастании скорости потока. Для увеличения чувствительности pH подвижной фазы изменяли в диапазоне от 3.0 до 9.0, максимальная чувствительность отмечалась при pH=4.5. Выбор pH и температуры термостатирования колонки определялись также данными ее технического паспорта. Для стабилизации значения pH вода в составе подвижной фазы была заменена на 0,01 М фосфатный буфер. Выбор жидкостной экстракции был обусловлен оснащением лаборатории, а также высокой стоимостью оборудования и материалов для твердо-фазной экстракции. В качестве экстрагентов были испробованы следующие растворители и их комбинации: дихлорметан; дихлорметан и пропанол-2 в соотношении 9:1; гексан; гексан и дихлорметан в соотношении 3,5:1; диэтиловый эфир; этилацетат; диэтиловый эфир, этилацетат и дихлорметан в соотношении 1:1:1; хлороформ и пропанол-2 в соотношении 9:1; спирт этиловый; спирт метиловый. Экстракции β-гидроксисимвастатина удалось добиться только с применением диэтилового эфира и комбинации дихлорметана и пропанола-2 в соотношении 9:1. Однако воспроизводимость и точность методики была выше при использовании последней комбинации. Увеличение продолжительности встряхивания и центрифугирования проб не привело увеличению чувствительности и улучшению разделения. Выводы 1. Разработана методика количественного определения β-гидроксисимва-статина в плазме крови методом ВЭЖХ, отличающаяся доступностью и экономичностью. 2. Методика обладает достаточной точностью, воспроизводимостью, Надежностью, простотой выполнения и быстротой анализа.