Диагностические значения особенностей строения микрососудов глиальных опухолей головного мозга

Полный текст

Диффузные глиомы – наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга с чрезвычайно высоким уровнем летальности, построенные из клеток, имеющих черты астроцитарной и/или олигодендроглиальной дифференцировки. Согласно пересмотренной классификации опухолей ЦНС ВОЗ (4-е пересм. изд., 2016 г.) был введён «интегрированный» диагноз, который формируется на основе определения патогистологических и молекулярных особенностей новообразования [1]. На первом этапе определяют именно гистологический вариант глиомы, основываясь на характерных для отдельных диагностических категорий фенотипических признаках с использованием как рутинной окраски, так и иммуногистохимических технологий [2].

Традиционно, важнейшее значение при установлении патогистологического диагноза и определении степени злокачественности новообразования принадлежит таким критериям, как пролиферативная активность неопластических клеток, клеточный и ядерный плеоморфизм, выраженность и распространенность вторичных изменений опухоли [3].

Учитывая особенности строения и форму кровеносных сосудов, в диффузных глиомах выделяют 4 основных морфологических типа, а именно: 1) гломерулоидний тип – группа сосудов, окруженных соединительнотканной стромой; 2) сосудистые гирлянды – сосуды с или без соединительнотканной стромы, которые вместе формируют гирляндоподобные структуры и чаще локализуются вокруг некротически измененной ткани; 3) сосудистые кластеры – отдельные ячейки микрососудов (≥3) причудливой формы без соединительнотканной стромы; 4) капилляроподобные сосуды – равномерно распределенные тонкие микрососуды, напоминающие нормальные капилляры головного мозга [4, 5].

Неоднократно указывалось на диагностическое и независимое от патогистологического диагноза прогностическое значение таких показателей ангиогенеза как микрососудистая плотность (micro-vascular density) [6-8], общая сосудистая площадь (total microvascular area) [9], морфологический тип представленных сосудов [4, 5]. Существует взаимосвязь особенностей строения микрососудистого русла и других морфологических и клинических признаков опухолей [10].

Использование иммуногистохимических (ИГХ) методик позволяет упростить и объективизировать исследования сосудов. Наиболее часто применяются следующие маркеры микрососудистой стенки: CD34, CD31, фактор фон Виллебранда.

Целью исследования было оценить особенности ангиогенеза в диффузных глиомах на основе определения характеристик микрососудов и выявить их взаимосвязь с гистологическим типом опухоли.

Материалы и методы

Было проанализировано 76 образцов глиальных опухолей головного мозга (табл. 1), полученные путем биопсии или оперативного вмешательства, преимущественно в нейрохирургическом отделении Днепропетровской областной клинической больницы им. И.И. Мечникова и подлежащих иммуногистохимическому исследованию в морфологическом отделе лечебно-диагностического центра ООО «Аптеки медицинской академии» (г. Днепр) в течение 2006-2016 гг. Гистологический диагноз был установлен, опираясь на современные гистологические и иммуногистохимические критерии [3].

 

Таблица 1.Характеристика исследуемой группы пациентов (n, %)

Критерий	Количество случаев, (n)	%
Пол
мужской	36	47,4
женский	40	52,6
Возраст
≤50	48	63,2
>50	28	36,8
Гистологический диагноз
диффузная астроцитома (ДА) – Grade II	10	13,2
анапластическая астроцитома (АА) – Grade III	14	18,4
глиобластома – Grade IV	36	47,4
олигодендроглиома (О) – Grade II	8	10,5
анапластическая олигодендроглиома (АО) – Grade III	8	10,5
Всего	76	100%

 

Кроме рутинного гистологического исследования (окраска гематоксилин-эозином), образцы опухоли подвергались иммуногистохимическому анализу, который проводился согласно протоколам ком-пании Termo Scientific (TS), (США) для определения экспрессии GFAP (RTU (Dako Cytomation, Дания)) и Ki-67 (клон sp6, p. 1: 400 (TS, США)). В срезах толщиной 4 мкм использовали систему визуализации Lab Vision Quanto (TS, США) с выявлением белковой цепи с помощью DAB Quanto Chromogen (TS, США).

Определение морфотипа сосудов, подсчёт их количества, измерение площади сосуда, площади его просвета и диаметра были основаны на отсутствии GFAP-иммунореактивности в эндотелии при выраженной (+++), умеренной (++) или слабой (+) GFAP-иммунореактивности окружающих неопластических клеток.

Для морфометрического исследования были получены цифровые фотографии участков исследуемых опухолей при помощи камеры ZEISS Axiocam 105 color на микроскопе Axio Scope. A1 при увеличении объектива ×40. Каждый образец был иллюстрирован 3 фотографиями с наибольшей плотностью расположения микрососудов. Измерение площади и линейных размеров производилась с использованием инструментов пакета Image J 1.49v [11].

Средние измеренные параметры были использованы для расчёта плотности микрососудов на 1 мм² площади опухоли, удельной площади микрососудов (% от общей площади среза), удельной площади просветов микрососудов (% от общей площади среза), среднего диаметра микрососудов (в мкм) [12, 13]. Пролиферативная активность микрососудов была оценена по индексу пролиферации эндотелиоцитов – соотношению количества Ki-67-имунореактивных ядер эндотелиоцитов и их общего количества, выраженному в процентах [12].

Статистический анализ был проведен с использованием лицензионной программы «Statistica» (версия 6.1; серийный номер AGAR 909 E415822FA). Нормальность распределения значений исследуемых параметров была проверена c использованием критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий характеристик изучаемых групп (n=5) опухолей определяли методом Краскела-Уоллиса, с последующим определением критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок. С целью определения силы связи между показателями использовался коэффициент корреляции Спирмена. Значение p<0,05 было принято статистически значимым [14].

Результаты и их обсуждение

Отсутствие экспрессии GFAP эндотелием сосудистой стенки, окруженной исключительно GFAP-положительной цитоплазмой неопластических клеток, позволило выявлять скрытые капилляры, а также провести более точные морфометрические исследования (рис. 1А-Б). Следует отметить, что представленная в образцах зона инфильтрации мозговой ткани опухолью, статистически значимо не отличалась от нормальной мозговой ткани по исследуемым параметрам (p>0,05).

 

Рис. 1. Количественные характеристики микрососудистого русла диффузных глиом головного мозга. А. Плотность расположения микрососудов (мкм-1). Б. Удельная площадь микрососудов (%). В. Удельная площадь просветов микрососудов (%). Г. Диаметр микрососудов (мкм). Д. Индекс пролиферации эндотелия (%)

 

В опухолях Grade II (ДА и О) регистрировались преимущественно капилляры, которые фенотипически не отличались от нормальных (94%). В АА и АО (Grade III) более часто отмечалось почкование, что отражалось на количестве сосудов, по форме похожих на нормальные (78%). Глиобластомы (Grade IV) отличались интенсивным ангиогенезом, что в 76% образцов приводило к формированию гирляндоподобных структур и лишь в 18% образцов были зафиксированы гломерулоидные сосуды; количество сосудов, которые были похожи на обычные капилляры головного мозга, составляло 37%.

Средние значения морфометрических показателей микрососудистого русла диффузных глиом представлены на рисунке 2. Достоверность отличий плотности микрососудов, удельной площади микрососудов, удельной площади просветов микрососудов и индекса пролиферации эндотелия в различных формах диффузных глиом установили с помощью теста Краскела-Уоллиса (p<0,01). Критерий Манна-Уитни установил, что значения плотности и удельной плотности микрососудов, зафиксированные в ДА и О (Grade II), были статистически значимо меньше, чем в опухолях Grade III-IV (соответствующие уровни значимости отличий p<0,01). При этом достоверные отличия отсутствовали между опухолями астроцитарного и олигодендроглиального ряда идентичной степени злокачественности и между опухолями Grade III-IV (p>0,05). Подобные зависимости были выявлены при анализе удельной площади просветов микрососудов, однако показатели АО оказались самыми низкими (p<0,01). Наибольшие значения данного показателя были зафиксированы в Г, в остальных гистологических формах диффузных глиом удельная площадь просветов микрососудов была промежуточной и статистически подобной. Значения индекса пролиферации эндотелия значимо отличались в опухолях различной степени дифференцировки. Так, опухоли, отнесенные к Grade II, демонстрировали достоверно наименьшие значения, в глиобластомах эндотелиальный индекс пролиферации был максимальным, а в диффузных глиомах Grade III по ВОЗ значения указанного показателя были промежуточными. Диаметр микрососудов колебался в опухолях различного гистологического строения в пределах статистической погрешности (тест Краскела-Уоллиса, p=0,069).

 

Рис. 1. Диффузная (А) и анапластическая (Б) астроцитомы головного мозга. GFAP-негативный эндотелий резко выделяется на фоне GFAP-реактивных опухолевых клеток. ИГХ, дополнительное окрашивание гематоксилином Майера, ×400

 

Cо степенью злокачественности по ВОЗ прямо достоверно коррелировали: плотность расположения сосудов (r=0,596), удельная площадь микрососудов (r=0,275), удельная площадь просветов микрососудов (r=0,813) и индекс пролиферации эндотелия (r=0,746).

Анализ корреляционных связей исследуемых параметров показал умеренную прямую достоверную связь между плотностью расположения микрососудов и индексом пролиферации эндотелия, а также их удельной площадью. Диаметр микрососудов не коррелировал ни с одним из исследуемых показателей (коэффициент корреляции Спирмена не имел статистической значимости).

В предыдущих исследованиях особенностей микрососудистого русла диффузных глиом, как и других солидных опухолей, широко применяли иммуногистохимические маркеры сосудистой стенки (CD34, CD31) [4, 5, 7-9, 12]. Однако, указанные маркеры достаточно редко используются в рутинной патологоанатомической диагностике интрапаренхиматозных опухолей головного мозга, поэтому мы использовали для морфометрических измерений негативное контрастирование сосудистой стенки. При этом маркер астроцитарной дифференцировки GFAP зарекомендовал себя наилучшим образом: во всех диффузных глиомах наблюдается выраженная или умеренная его экспрессия опухолевыми клетками при абсолютном отсутствии соответствующего белка в эндотелии сосудов [3].

Результаты морфометрических исследований показали зависимость показателей интенсивности образования новых сосудов от степени злокачественности глиом. При этом увеличение количественных параметров (плотность расположения микрососудов, индекс пролиферации эндотелия и др.) переходит в изменения качественных характеристик васкуляризации опухолевой ткани: образование каскада микрососудов (гирлянд) и гломерулоидных структур в высокозлокачественных новообразованиях [5, 9].

Инициаторами роста сосудов считают нарастающие в опухолевой ткани гипоксию и «псевдогипоксию». «Псевдогипоксия» обусловлена изменениями метаболизма, вызванными мутацией гена изоцитратдегидрогеназы, что характерно преимущественно для низкозлокачественных глиом. Впрочем, гипоксия, которая вероятно является сильнейшим стимулом, более выражена в густоклеточных плеоморфных неоплазиях (Grade III-IV).

Выводы

1. Отсутствие экспрессии GFAP эндотелиоцитами и перицитами позволяет на основании их негативного контрастирования оценить и измерить морфометрические показатели микрососудов диффузных глиом головного мозга без применения дополнительных сосудоспецифических маркеров.
2. Определена статистически значимая связь индекса пролиферации (Ki-67) эндотелия и Grade по ВОЗ (r=0,746, p<0,05).
3. Для опухолей Grade II характерны капилляроподобные микрососуды, в опухолях Grade III и IV могут наблюдаться микрососудистые гирлянды, а в глиобластомах встречаются гломерулоидные сосуды. Плотность расположения, удельная площадь и удельная площадь просвета микрососудов прямо коррелируют с Grade по ВОЗ. Плотность расположения микрососудов и удельная площадь микрососудов в глиомах Grade III-IV значительно выше, чем в опухолях Grade II (p<0,01)

Об авторах

И. С. Шпонька

ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: Timash3061990@gmail.com

д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии и судебной медицины

Украина,  49044, г. Днепр, ул. Владимира Вернадского, 9

Т. В. Шинкаренко

ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины»

Email: Timash3061990@gmail.com

аспирант кафедры патологической анатомии и судебной медицины

Украина,  49044, г. Днепр, ул. Владимира Вернадского, 9

Список литературы

Дополнительные файлы