Построение компьютерной модели при морфометрии тканей

Полный текст

Обычно морфометрия тканей проводится с помощью прямой микроскопии [1-3]. Все элементы тканей подсчитываются в поле зрения, которое постепенно передвигается исследователем «на глазок», из-за чего неизбежно возникает перекрытие полей зрения, что значительно влияет на результат. Все поля зрения смотрятся редко из-за трудозатратности.

Площадь исследуемых элементов тканей не вычисляется или оценивается приблизительно с помощью окуляра с сеткой. Площадь среза всего препарата вычисляется с помощью наложения миллиметровой бумаги на микропрепарат. В этом случае нельзя отличить одни ткани от других (например, мышечную ткань от стромы) и присутствует значительная погрешность.

В случае использования ручной микроскопии и анализа результатов, время обработки 1 микропрепарата результатов составляет до 4-6 часов. При этом не исключены ошибки, которые сложно обнаружить. На их исправление требуется время, сопоставимое с первичным анализом микропрепаратов [1].

Цель работы: проведение частичной автоматизации гистоморфологического метода для объективной оценки состояния исследуемых тканей и ускорения выполнения гистоморфологических исследований.

Материалы и методы

Нами исследовались молочные железы крыс в норме и при кистозной мастопатии [2, 4]. Проводился морфометрический анализ 253 микропрепаратов молочных желез крыс по 23 показателям [3].

I. Фотографирование микропрепаратов.

Использовался микроскоп «Микромед-2» с увеличением х40. Микропрепараты были сфотографированы с помощью видео-окуляра для микроскопа «Toup Cam 9.0 mp» (разрешение 9 мегапикселей). Как оказалось, он имеет избыточное разрешение, и для получения снимков необходимого качества достаточно разрешения в 3 мегапикселя. При этом фотоснимки частично перекрывали друг друга. Это не повлияло на конечную модель, поскольку все основные параметры высчитывались относительно общей площади снимков, а не площади среза микропрепарата. По каждому микропрепарату было сделано 10-30 снимков, на получение которых требовалось около 2-3 минут. Всего для изучения 253 микропрепаратов было сделано около 5000 снимков, на что потребовалось около 12 часов.

II. Подсчет элементов тканей на фотографиях.

Полученные гистоморфологические снимки загружаются в графический редактор (например, Photoshop), и проводится послойная обработка фотографий с подсчетом необходимых параметров. Например, на первом этапе удаляется всё, что не относится к микропрепарату и подсчитывается площадь всей ткани, на втором – всё, что не относится к строме и подсчитывается её площадь и так далее. Площадь оставшихся или удаленных элементов тканей в пикселях (px) можно посмотреть в расширенном окне «Гистограмма» (показывает площадь выделенной фигуры). Кроме площади можно подсчитывать любые элементы, например, протоки молочных желез или сосуды. Все подсчитанные площади и значения заносятся в таблицу Exсel.

Этот упрощенный метод компьютерной морфометрии похож на ручную морфометрию, но он гораздо быстрее и удобнее, поскольку подсчет производится на большом экране компьютера с возможностью выделения элементов и наложения фильтров, чего нельзя сделать при прямом микроскопировании исследуемых тканей.

III. Построение компьютерной модели.

Все значения параметров, полученные по каждому снимку микропрепарата, суммируются (функция «суммирование»), и в итоге получаются конечные значения для каждого микропрепарата.

Далее для всех расчетов используются формулы (из раздела «формулы», либо написанные самими исследователями).

Площадь гистоморфологических элементов переводятся из px в мкм². Разрешение изученных в нашем случае данных составило 800/600 px. При увеличении микроскопа х40: 1 мм=275 px, 1 мм²=75625 px, 1 мкм²≈0,0746 px, 1 px≈13,22 мкм².

Для расчета площади пикселей можно использовать формулу:

$1 px=r\frac{S1}{S2}$,

где r – разрешение пикселя в мкм² известного снимка, S1 – площадь известного снимка, S2 – площадь нового снимка.

Соответственно, при разрешении 872/654 px:$1px=13,22*\frac{800*600}{872*654}$ ≈11,12 мкм². Если меняется увеличение, то аналогично умножаем значение на отношение старого и нового увеличений.

Далее выстраивается схема, в которой все значения проходят цепочку математических преобразований для получения значений каждого параметра. Это и есть математическая модель проведенного эксперимента. В Exсel это оформляется как последовательные столбцы, в каждом из которых вычисляется свой параметр. Причем, в любой момент можно взять любые значения из любого столбца и использовать их для вычислений (рис. 1). 

Рис. 1. Алгоритм построения компьютерной модели в Excel

 

 

Если эксперимент включает несколько исследуемых групп объектов (например, животных), которые нужно продифференцировать между собой, то проводится дополнительный этап выделения средних значений для каждой группы с автоматическим расчетом среднеквадратичного отклонения.

В нашем случае исследовалось 23 группы экспериментальных животных, поэтому были подсчитаны средние показатели для каждой группы. На основании средних значений для каждой группы делались выводы о результатах проведенной работы.

В эксперименте производился расчет 23 морфометрических показателей:

1. ПГС (мм²) – площадь гистотопографического среза молочной железы.
2. К (в штуках) – общее количество протоков в срезе.
3. КО (в штуках) – количество одиночных протоков в максимальном сечении молочной железы.
4. КПГ (в штуках) – количество групп протоков, то есть количество протоков, расположенных группами.
5. КГ (в штуках) – количество групп протоков, то есть сколько протоков расположено группами.
6. Р (в штуках на мм²) – плотность железистого поля = К/ПГС.
7. ПГ – плотность групп протоков = КГ/ПГС.
8. ВГ – средняя величина групп протоков = КПГ/КГ.
9. %О – процент одиночных протоков = КО/К*100%.
10. %Г – процент групповых протоков от всех протоков = 100-%О.
11. %ПЖ – процент площади железистого поля. Он равен проценту площади протоков желез от ткани молочной железы.
12. %ПС – процент площади стромы. Он равен 100% – % площади протоков.
13. ПЖ – площадь паренхимы в мм² = ПГС*%ПС.
14. ПС – площадь стромы в мм² = ПГС-ПЖ.
15. СВ – степени васкуляризации. Он равен количество сосудов/ПС.
16. РП – средний размер одного протока. Он равен ПЖ/К в мкм².
17. КС – клеточность околопротоковой стромы.
18. %Г – % клеток.
19. ВЭ (мкм²) – высота эпителия. Оценка высоты эпителия протоков (толщина вокруг протоков) в мкм.
20. ПЭП (в тыс. мкм²) – площадь эпителия протоков в среднем.
21. ППП (в тыс. мкм²) – площадь просвета протока в среднем. Равна РП-ПЭП.
22. ПЭ (в тыс. мкм²) – площадь эпителия протока в максимальном срезе. Равна ПЭП*К.
23. ППЖ (в тыс. мкм²) – площадь просвета желез. Равна ПЖ-ПЭ.

Следует отметить, что Р, РП, ППП считаются наиболее важными при оценке степени кистозной мастопатии.

Результаты и их обсуждение

Чтобы рассчитать практически все морфометрические показатели потребовалось 6 базовых параметров: площадь среза, площадь стромы, площадь железистой ткани, площадь просветов, количество протоков, число сосудов. Причем основные параметры (РП, ППП) ранее высчитывались косвенными методами через формулы с высокой погрешностью. Применение компьютерной морфометрии позволило значительно поднять точность их вычисления.

Благодаря визуализации и оценке взаимосвязей исследуемых параметров выявились некоторые математические неточности морфометрии молочных желез, которые ранее было сложно обнаружить без компьютерного моделирования. В частности, оказалось, что деление на количество протоков часто приводит к ложно завышенным и ложно заниженным результатам. Это связано с тем, что протоки молочных желез в норме практически не видны, в результате количество протоков (знаменатель во многих описанных выше параметрах) оказывается очень низким, что завышает конечный результат. И наоборот, при выраженной кистозной мастопатии видны все протоки, что занижает результаты в сравнении с частичным регрессом кист, когда общая площадь протоков практически не меняется, но становятся не видны ранее минимально расширенные протоки.

В целях более адекватной оценки состояния ткани молочной железы, по нашему мнению, можно использовать следующий параметр, который будет особенно эффективен при оценке степени выраженности кистозной мастопатии: %СР (степень расширения просветов протоков по отношению к площади стромы). Он равен ППП/ПС. Данный параметр ориентирован на общую оценку состояния протоков без влияния количества протоков (К). При этом можно увидеть, какую часть стромы занимают расширенные протоки, что наглядно отображает степень выраженности кистозной мастопатии. С помощью ручной морфометрии рассчитать этот показатель без высокой погрешности очень сложно.

После получения компьютерной модели в Exсel проводится дальнейшая исследовательская работа, в частности:

1. Статистическая обработка результатов по Стьюденту или другими методами (есть в Exсel).
2. Визуализация результатов работы на графиках и диаграммах.
3. Использование полученных значений на любом из этапов для дополнительных исследовательских действий (например, можно воспользоваться средствами машинного обучения для поиска взаимосвязей между исследуемыми морфометрическими параметрами).
4. Расчёт новых параметров, которые необходимы для улучшения модели или всего метода в целом.

Преимущества построения компьютерной модели, на наш взгляд, состоят в следующем:

1. Данная модель подходит для анализа любой ткани, а не только молочных желез.
2. Все результаты находятся в одном месте, и можно быстро визуализировать любой параметр. Это позволяет увидеть результаты работы в целом, что облегчает формулировку выводов или поиск ошибок.
3. При изменении отдельных значений или формул происходит мгновенный перерасчет сразу всей модели, что значительно ускоряет исследовательскую работу.
4. Результаты могут быть проверены на любом из уровней исследования, что упрощает поиск допущенных ошибок и повышает прозрачность проведения научной работы.
5. Скорость морфометрии примерно в 2-3 раза выше, чем при использовании прямой микроскопии даже без использования методов машинного обучения.
6. Полученные данные могут быть использованы для поиска общих закономерностей, в том числе для построения объединенных моделей, с помощью которых могут описываться процессы в организме с разных сторон.

Основными условиями создания компьютерной модели являются необходимость навыков работы с такими программами как Photoshop и Exсel (или с их аналогами) и наличие видеоокуляра для микроскопа.

Компьютерное моделирование при проведении морфометрии тканей, выполненное при кистозной мастопатии, может быть использовано и при других заболеваниях молочной железы [5], а также при исследовании разных органов и тканей.

Выводы

1. Компьютерное моделирование при проведении морфометрии тканей даёт много возможностей для проведения более быстрой и качественной научной работы.
2. Компьютерное моделирование имеет значительное преимущество перед прямой микроскопией при анализе полученных результатов гистоморфологических исследований тканей.
3. В дальнейшем построение и усовершенствование компьютерных моделей даст возможность создания объединённых моделей, которые позволят описать функционирование организма на разных уровнях его организации одновременно с разных позиций.
4. Для более точной оценки состояния тканей молочных желез предложен новый параметр – %СР – степень расширения протоков, который особенно эффективно отражает состояние ткани молочной железы при кистозной мастопатии.

Об авторах

Антон Сергеевич Васин

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: anto-vasin@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-3790-4620
SPIN-код: 2387-3689
ResearcherId: A-7261-2018

аспирант кафедры патофизиологии

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Виктор Викторович Давыдов

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: anto-vasin@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-6479-7504
SPIN-код: 1356-7511
ResearcherId: S-3209-2016

д.м.н., профессор кафедры патофизиологии

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Жанна Александровна Свирина

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: anto-vasin@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5895-231X
ResearcherId: D-2931-2018

к.м.н., ассистент кафедры патофизиологии

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Список литературы

Дополнительные файлы