Внутриклеточная локализация и функция ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) в условиях моделирования окислительного стресса in vitro

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК ― активная форма кислорода

ДТНБ ― 5,5′-ди-тиобис(2-нитро)-бензойная кислота

МТТ ― 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид

ОП ― оптическая плотность

ОС ― окислительный стресс

СОД ― супероксиддисмутаза

ARE ― antioxidant respons(iv)e element (элемент антиоксидантного ответа)

Cul3 ― cullin 3 (куллин 3)

keap1 ― kelch-like ECH associated protein 1 (келч-подобный ассоциированный с ECH белок 1)

Maf ― musculoaponeurotic fibrosarcoma (мышечно-апоневротическая фибросаркома)

Nrf2 ― nuclear factor E2-related factor 2 (ядерный фактор эритроидного происхождения 2)

Ub ― ubiquitin (убиквинтин)

АЕМ1 ― antioxidant respons(iv)e element expression modulator (модулятор экспрессии элемента антиоксидантного ответа)

ВВЕДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в организме в результате внутриклеточного метаболизма или внешнего воздействия прооксидантов. АФК, образующиеся в ответ на физиологические изменения, действуют как важные сигнальные молекулы, регулируя такие процессы, как деление клеток, воспаление, иммунная реакция, аутофагия и ответ на стресс [1]. Гиперпродукция свободных радикалов, сопровождающаяся снижением антиоксидантной активности клетки, приводит к развитию окислительного стресса (ОС), который ухудшает клеточные функции и способствует развитию многих патологий [2].

Механизм сигнального действия АФК осуществляется через активацию транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, связываясь с промоторами генов, запускают экспрессию ряда белков [1].

Ядерный фактор эритроидного происхождения 2 (англ.: nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) является членом семейства cap‘n’collar (CNC) подсемейства факторов транскрипции лейциновой молнии (bZIP) [3]. Nrf2 представляет собой транскрипционный фактор, который регулирует клеточную защиту от воздействия токсичных веществ и окислителей [4].

Доказано, что Nrf2 стимулирует индукцию ферментов (глутатион S-трансфераза и NAD(P)H-дегидрогеназа, оксидоредуктаза и др.), участвующих в метаболизме ксенобиотиков, что приводит к биотрансформации и выведению экзогенных и эндогенных химических веществ [5]. В этом случае Nrf2 функционирует как активированный ксенобиотиком рецептор (англ.: хenobiotic-activated receptors, XAR) [4]. Тем не менее основной функцией Nrf2 является его роль, определяющая устойчивость клетки к ОС.

Известно, что нокаут Nrf2 у мышей повышал их чувствительность к широкому спектру химических веществ и патологиям, связанным с ОС [6]. Отмечено, что повышение активности Nrf2 под действием химических веществ защищает животных от ОС [7, 8].

Таким образом, Nrf2, индуцируя экспрессию антиоксидантных ферментов и сигнальных белков, проявляет защитные эффекты при воздействии токсичных веществ и развитии патологических состояний, протекающих на фоне ОС, поэтому выяснение протективных механизмов Nrf2 является актуальным направлением исследований, т. к. позволит определить пути адаптации к ОС и избежать негативного воздействия АФК.

Цель ― определить локализацию, механизм активации и роль Nrf2 в условиях окислительного стресса in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2, ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4 500 мг/л) с добавлением L-глутамина (4 мМ), 15% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (все составляющие производства Sigma-Aldrich, Германия) соответственно. Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки [9].

ОС моделировали добавлением в питательную среду пероксида водорода (Н₂О₂, Sigma-Aldrich, Германия) в концентрациях 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100 мкМ и инкубацией 24 и 72 ч. К контрольным клеткам в эквивалентном объеме прибавляли воду для инъекций (растворитель Н₂О₂).

При оценке участия Nrf2 в адаптационных механизмах защиты клетки в условиях ОС в питательную среду за 30 мин до добавления Н₂О₂ вносили ингибитор ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) ― N-(1,3-бензодиоксол-5-илметил)-5-(4-фторфенил)-тиено[2, 3-d]пиримидин-4-амин (англ.: antioxidant respons(iv)e element expression modulator, AEM1, Sigma Aldrich, Германия) в концентрации 5 мкМ [10].

Для исследования жизнеспособности клетки высевали в 96-луночный планшет (Сorning, США), для изучения влияния Н₂О₂ на количество Nrf2, концентрацию белковых SH-групп и карбонильных производных белков, активность Сu,Zn-супероксиддисмутазы (СОД) клетки культивировали в 6-луночных планшетах (Сorning, США).

Цитотоксический тест (МТТ-тест). Клетки засевали в 96-луночный планшет из расчета 10⁴ клеток на каждую лунку и культивировали в течение 21 сут, затем добавляли питательную среду с Н₂О₂. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл 0,5% раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия (МТТ) и инкубировали в течение 2 ч, затем раствор МТТ удаляли и добавляли 200 мкл 1% раствора диметилсульфоксида (ПанЭко, Российская Федерация) [11]. Поглощение измеряли через 10 мин при 530 нм на спектрофотометре для планшетов Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США).

Жизнеспособность клеток Сасо-2 в присутствии Н₂О₂ рассчитывали по формуле:

$Жизнеспособность=\frac{ОП опытных лунок- ОП среды}{ОП контрольных лунок-ОП среды}\times 100\%$

где ОП — оптическая плотность.

Получение цитоплазматической и ядерной фракций клеточных лизатов для анализа. Клетки засевали в 6-луночные планшеты из расчета 10⁵ клеток на каждую лунку и культивировали в течение 21 сут, затем добавляли культуральную среду с H₂O₂. После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия). Клетки в количестве 1 × 10⁶ трехкратно промывали фосфатным буфером pH 7,4 (ПанЭко, Российская Федерация) и разделяли на цитоплазматическую и ядерную фракции коммерческим набором (Protein extraction kit (cytoplasmic/nuclear), BioRad, CША). Полученные лизаты использовали для количественного определения Nrf2 в цитоплазме и ядре.

Количественный анализ содержания Nrf2 в клетках линии Caco-2. В лизате клеток методом гетерогенного иммуноферментного анализа определяли количество Nrf2 коммерческим набором (Human Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ELISA Kit, Bluegene, Китай). Светопоглощение измеряли при 450 нм на иммуноферментном планшетном анализаторе Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США).

Приготовление тотальных клеточных лизатов для определения активности СОД, концентрации карбонильных производных белков и белковых SH-групп. Клетки снимали с 6-луночных планшетов после экспозиции с Н₂О₂ раствором трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия), трехкратно промывали фосфатным буфером рН 7,4 (ПанЭко, Российская Федерация) и лизировали ледяным буфером для лизиса, содержащим 50 мМ трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ KCl, 0,5% тритон X-100 и ингибиторы протеиназ (4-(2 аминоэтилбензенсульфонил флуорида гидрохлорид (AEBSF) 2 мМ, апротинин 0,3 мкМ, бестатин 130 мкМ, ЭДТА 1 мМ, транс-эпоксисукцинил-L-лейциламидо(-гуанидино)бутан (Е-64) 14 мкМ, лейпептин 1 мкМ, Sigma-Aldrich, Германия), встряхивали на шейкере. Клетки инкубировали на льду в течение 10 мин, после чего центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g (CM-50, Eppendorf, Германия) для осаждения ядер. Супернатант использовали для выполнения биохимических анализов.

Метод определения карбонильных производных белков основан на их взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали при длине волны 375 нм. Концентрацию карбонильных производных белков рассчитывали исходя из коэффициента экстинкции ε₃₇₅ = 22 мМ^–1см^–1 [12]. Анализ выполняли на иммуноферментном планшетном анализаторе Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США).

Определение концентрации белковых SH-групп. Концентрацию белковых тиоловых групп определяли по разнице между уровнем общих и низкомолекулярных SH-групп. Анализ содержания общих SH-групп в лизате клеток проводили по методу Эллмана с 5,5′-ди-тиобис(2-нитро)-бензойной кислотой (ДТНБ) [13]. К 100 мкл образца добавляли 100 мкл 2 мМ ДТНБ (Serva, Германия) в 1 М Tris-HCl буфере (pH 8,0) и 1000 мкл дистиллированной воды. После 30 мин экспозиции количественно оценивали содержание 5-тио-2-нитробензойной кислоты при 412 нм на Stat Fax 2100 (Awareness Technology, США). Концентрацию SH-групп рассчитывали исходя из коэффициента экстинкции ε₄₁₂ = 13,6 мМ⁻¹см⁻¹ [14]. Для определения содержания низкомолекулярных SH-групп пробу предварительно смешивали с охлажденной 5%-ной трихлоруксусной кислотой (Химмед, Российская Федерация), инкубировали на льду 15 мин, затем центрифугировали при 11 000 g (CM450, Eppendorf, Германия) 5 мин при 4°C. Полученный супернатант нейтрализовали с помощью 1%-ного NaOH (Химмед, Российская Федерация) и использовали для определения низкомолекулярных SH-групп по реакции с ДТНБ.

Активность СОД оценивали по регистрации степени торможения реакции окисления кверцетина, фиксируемой по изменению оптической плотности реакционной смеси при длине волны λ = 406 нм. Определение процента ингибирования окисления кверцетина за 3 мин проводили по формуле:

$\% ингибирования=∆D_x-∆D_0/∆D_x\times 100\%$,

где ∆D_х — изменение оптической плотности при 406 нм за 3 мин в контрольной пробе, без СОД; ∆D₀ — изменение оптической плотности при 406 нм за 3 мин в опытной пробе, содержащей СОД [15].

За одну условную единицу действия (Ед) принимали 50%-ное ингибирование. Активность фермента выражали в Ед/мг белка.

Количество белка в пробах анализировали методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, ThermoFisher, США).

Полученные результаты анализировали с помощью программ Statistica 13.0 (Stat Soft Inc., США) и Excel (Microsoft, США). Результаты представлены в виде средней (M) и стандартного отклонения (SD). Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена–Кейлса. Корреляционный анализ проводили с помощью критерия Пирсона. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка степени развития окислительного стресса и антиоксидантной защиты при воздействии пероксида водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ в клетках линии Сасо-2 in vitro. Степень развития ОС оценивали по концентрации белковых SH-групп и уровню карбонильных производных белков, степень антиоксидантной защиты ― по активности СОД.

При инкубации клеток линии Сасо-2 в течение 24 ч содержание белковых SH-групп в клетках статистически значимо снижалось относительно значений контроля при воздействии Н₂О₂ во всем диапазоне изученных концентраций:

0,1 мкМ ― на 46,6% (p = 0,0003),

0,5 мкМ ― на 53,0% (p = 0,0002),

1 мкМ ― на 62,6% (p = 0,0002),

5 мкМ ― на 51,3% (p = 0,0002),

10 мкМ ― на 41,4% (p = 0,0002),

50 мкМ ― на 27,2% (p = 0,0036),

100 мкМ ― на 36,4% (p = 0,0009, рис. 1а).

 

Рис. 1. Оценка развития окислительного стресса в клетках линии Сасо-2 при воздействии пероксида водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ в течение 24 и 72 часов: концентрация белковых SH-групп (а), концентрация карбонильных производных белков (б). Примечание: * — статистически значимые отличия от контроля, р < 0,05 (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

Увеличение времени инкубации до 72 ч вызывало статистически значимое снижение содержания белковых SH-групп в клетках при воздействии Н₂О₂ в концентрациях 10, 50 и 100 мкМ на 52,4% (p = 0,02), 38,1% (p = 0,02) и 40,4% (p = 0,02) соответственно по сравнению с данными контрольной группы (рис. 1а).

Инкубация клеток линии Сасо-2 в течение 24 ч привела к значимому повышению относительно контрольных значений уровня карбонильных производных белков при воздействии Н₂О₂ в концентрациях 5, 10, 50 и 100 мкМ на 96,3% (р = 0,03), 137,1% (р = 0,003), 174,1% (р = 0,001) и 148,1% (р = 0,003) соответственно (рис. 1б).

При воздействии в течение 72 ч Н₂О₂ в концентрации 50 мкМ уровень карбонильных производных белков существенно возрастал на 36,7% (р = 0,001), а в концентрации — 100 мкМ на 110% (р = 0,001) по сравнению с контролем. В остальных концентрациях прооксидант не оказывал статистически значимого влияния на изученный показатель (рис. 1б).

При воздействии Н₂О₂ в течение 24 ч в концентрациях 0,1; 0,5; 1; 5 и 10 мкМ активность СОД возрастала на 216,1% (р = 0,0002), 187,4% (р = 0,0002), 206,7% (р = 0,0002), 86,9 (р = 0,03) и 78,9% (р = 0,03) соответственно относительно значений контрольной группы (рис. 2).

 

Рис. 2. Активность супероксиддисмутазы в клетках линии Сасо-2 при воздействии пероксида водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ в течение 24 и 72 часов. Примечание: * — статистически значимые отличия от контроля, р < 0,05 (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

Воздействие Н₂О₂ длительностью 72 ч в диапазоне 0,1–5 мкМ не оказывало влияния на активность СОД, а в концентрации 10 мкМ приводило к увеличению активности СОД на 111,8% (р = 0,006) в сравнении с контрольной группой (рис. 2). При концентрациях Н₂О₂ 50 и 100 мкМ и времени инкубации 24 ч и 72 ч отмечалась тенденция к снижению активности СОД.

Количественная оценка ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) в клетках линии Сасо-2 in vitro при воздействии Н₂О₂ в концентрациях 0,1–100 мкМ. При воздействии Н₂О₂ в концентрациях 0,1; 0,5 и 1 мкМ в течение 24 ч на клетки линии Сасо-2 количество Nrf2 в цитоплазме снижалось на 56,5% (р = 0,03), 48,6% (р = 0,02) и 51,7% (р = 0,03) и возрастало в ядре на 55,2% (р = 0,003), 38,1% (р = 0,001) и 37,0% (р = 0,001) соответственно относительно значений контрольной группы (рис. 3а). При концентрации Н₂О₂ 100 мкМ количество Nrf2 в цитоплазме не изменялось и снижалось в ядре на 80,6% (р = 0,001).

 

Рис. 3. Количество ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) в цитоплазме и ядре клеток линии Сасо-2 in vitro при воздействии пероксида водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ в течение 24 часов (а) и 72 часов (б). Примечание: к ― контроль; * − статистически значимые отличия от контроля, р < 0,05 (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

При инкубации клеток с Н₂О₂ в течение 72 ч и концентрациях 10 и 50 мкМ количество Nrf2 снижалось на 58,8% (р = 0,009) и 64,7% (р = 0,009) соответственно в цитоплазме и возрастало на 47,7% (р = 0,003) и 25,8% (р = 0,05) соответственно в ядре. Н₂О₂ в концентрации 100 мкМ при длительности воздействия 72 ч вызывала снижение уровня Nrf2 в цитоплазме на 55,6% (р = 0,005) и в ядре на 85,1% (р = 0,0002) в сравнении с группой контроля (рис. 3б).

При проведении корреляционного анализа была выявлена прямая зависимость между концентрацией белковых SH-групп и количеством Nrf2 в цитоплазме клеток при их инкубации с Н₂О₂ длительностью 24 ч (r = 0,44; р = 0,03), 72ч (r = 0,34; р = 0,05). В свою очередь, количество Nrf2 в ядре положительно коррелировало с активностью COД в клетках при воздействии Н₂О₂ в течение 24 ч (r = 0,77; р = 0,0001) и 72 ч (r = 0,36; р = 0,06).

Защитную функцию Nrf2 оценивали по жизнеспособности клеток линии Сасо-2 при воздействии Н₂О₂ и при воздействии Н₂О₂ в присутствии ингибитора Nrf2 ― AEM1.

Инкубация клеток с Н₂О₂ в концентрациях 50 мкМ и 100 мкМ в течение 24 и 72 ч привела к статистически значимому снижению жизнеспособности клеток относительно контроля на 45,9% (p = 0,001) и 41,2% (p = 0,02), на 73,2% (p = 0,0003) и на 65,7% (p = 0,002) соответственно (рис. 4). При внесении в питательную среду ингибитора Nrf2 (АЕМ1, 5 мкМ) за 30 мин до инкубации с прооксидантом жизнеспособность клеток статистически значимо снижалась при концентрациях Н₂О₂ ― 0,1–10 мкМ (инкубация 24 ч) и 0,5–10 мкМ (инкубация 72 ч) относительно значений жизнеспособности клеток, которые инкубировали только с Н₂О₂, что указывает на защитную роль Nrf2 в условиях ОС (рис. 4).

 

Рис. 4. Жизнеспособность клеток линии Сасо-2 при воздействии пероксида водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ в течение 24 часов (а) и 72 часов (б) самостоятельно (1) и в условиях ингибирования синтеза Nrf2 (2). Примечание: к ― контроль; * ― статистически значимые отличия от контроля, р < 0,05 (критерий Ньюмена–Кейлса); # ― статистически значимые отличия от группы Н₂О₂, р < 0,05 (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Гиперпродукция АФК при сниженной емкости антиоксидантной защиты клетки приводит к повреждению макромолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот) [16, 17]. Наиболее чувствительными к действию прооксидантов являются остатки цистеина в белковых молекулах. Реакционноспособные сульфгидрильные (SH) группы ― это регуляторные центры, которые являются молекулярными переключателями активности белков [18].

На изменение соотношения восстановленных и окисленных SH-групп в белках реагирует Nrf2-редокс-чувствительный транскрипционный фактор. Его экспрессия повышается при развитии ОС и направлена на защиту клетки от воздействия свободных радикалов [19]. В нормальных условиях данный транскрипционный фактор находится в комплексе с белком-репрессором Keap1, их связывание регулируется рядом протеинкиназ. Keap1, с одной стороны, способствует убиквитинированию и протеосомной деградации Nrf2 (необходимым условием для этого процесса является наличие двух остатков цистеина в молекуле Keap1), а с другой ― предотвращает его проникновение из цитоплазмы в ядро (рис. 5) [20].

 

Рис. 5. Механизм защитного действия транскрипционного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) в условиях окислительного стресса, индуцируемого пероксидом водорода в концентрациях 0,1–100 мкМ in vitro. Примечания: АФК ― активные формы кислорода; ARE ― antioxidant respons(iv)e element (элемент антиоксидантного ответа); Cul3 ― cullin 3 (белок куллин 3); keap1 ― kelch-like ECH associated protein 1 (келч-подобный ассоциированный с ECH белок 1); Maf ― musculoaponeurotic fibrosarcoma (мышечно-апоневротическая фибросаркома); Nrf2 ― nuclear factor E2-related factor 2 (ядерный фактор эритроидного происхождения 2); SOD ― супероксиддисмутаза; Ub ― белок убиквинтин.

 

После активации комплекс Keap1–Nrf2 диссоциирует, и Nrf2 транслоцируется в ядро, где связывается с элементами антиоксидантного ответа (англ.: antioxidant respons(iv)e element, ARE) и активирует транскрипцию защитных ферментов [20].

Полученные результаты демонстрируют, что при развитии ОС под действием Н₂О₂ происходит диссоциация Keap1-Nrf2 за счет окисления белковых SH-групп и транслокация Nrf2 в ядро (рис. 5), что подтверждается корреляционной взаимосвязью изученных показателей.

Антиоксидантные ферменты играют важную роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза и защите клеток от повреждения и апоптоза, особенно при воздействии прооксидантов. Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1) является ключевым ферментом антиокислительных систем всех аэробных организмов, катализирующим превращение анион-радикала кислорода (О₂^-) в перекись водорода и молекулярный кислород.

Увеличение количества Nrf2 в ядре приводит к возрастанию активности COД, что подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью при действии Н₂О₂ (рис. 5).

При воздействии прооксиданта в течение 72 ч статистически значимой корреляционной взаимосвязи между активностью СОД и количеством Nrf2 в ядре получено не было. Вероятно, при длительном воздействии Н₂О₂ (72 ч) защитный механизм Nrf2, направленный на сохранение жизнеспособности клеток, реализуется не только через активацию СОД, но и другие антиоксидантные ферменты, в индукции которых участвует Nrf2.

Описанный каскад биохимических процессов имеет важное значение для сохранения жизнеспособности клеток в условиях ОС. При воздействии на клетки линии Сасо-2 Н₂О₂ в концентрациях 0,1–10 мкМ длительностью 24 ч и в концентрациях 0,5–10 мкМ длительностью 72 ч жизнеспособность клеток поддерживалась за счет транскрипционного фактора Nrf2, что подтверждается значимым снижением процента выживших клеток в условиях ингибирования Nrf2 с помощью АЕМ1.

ВЫВОД

Пероксид водорода при определенном диапазоне концентраций и длительности воздействия индуцирует ядерную транслокацию Nrf2, что способствует активации антиоксидантного фермента СОД и сохранению жизнеспособность клеток линии Сасо-2 в условиях ОС in vitro.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Абаленихина Ю. В. — проведение основных этапов эксперимента, анализ и интерпретация данных, написание статьи; Ерохина П. Д. — культивирование клеток и проведение основных этапов эксперимента; Сеидкулиева А. А. — культивирование клеток и проведение биохимических анализов; Завьялова О. А. — проведение биохимических анализов; Щулькин А. В. — разработка концепции и дизайна, проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение для публикации рукописи; Якушева Е. Н. — анализ и интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests.

Contribution of the authors: Yu. V. Abalenikhina — conducting the main stages of the experiment, analyzing and interpreting data, writing an article; P. D. Erokhina — cell cultivation and conducting the main stages of the experiment; A. A. Seidkuliyeva — cell cultivation and biochemical analyses; O. A. Zav’yalova ― conducting biochemical analyses; A. V. Shchul’kin — concept and design development, verification of critical intellectual content, final approval for publication of the manuscript; E. N. Yakusheva — data analysis and interpretation, verification of critical intellectual content. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Об авторах

Юлия Владимировна Абаленихина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: abalenihina88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0427-0967
SPIN-код: 4496-9027

к.б.н., доцент

Россия, Рязань

Пелагея Дмитриевна Ерохина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: erokhina.pelageya96@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4802-5656
SPIN-код: 1480-6854

ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО

Россия, Рязань

Адамиана Аманмамедовна Сеидкулиева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: adamiana@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-4434-8415
SPIN-код: 2431-6897
Россия, Рязань

Ольга Алексеевна Завьялова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: olga.zavyalova.1999@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9010-385X
SPIN-код: 7590-9135

ассистент кафедры фармацевтической химии

Россия, Рязань

Алексей Владимирович Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702

д.м.н., доцент

Россия, Рязань

Елена Николаевна Якушева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080

д.м.н., профессор

Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы