Гипоксия-подобный эффект L-аргинина в семенных пузырьках и эпидидимисе крыс
- Авторы: Марсянова Ю.А.1, Звягина В.И.1
-
Учреждения:
- Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
- Выпуск: Том 31, № 3 (2023)
- Страницы: 345-356
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 06.06.2022
- Статья одобрена: 14.09.2022
- Статья опубликована: 12.10.2023
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/108589
- DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ108589
- ID: 108589
Цитировать
Аннотация
Введение. Влияние L-аргинина на обменные процессы опосредуется оксидом азота (II), пул которого регулируется несколькими ферментами. В литературе отмечается взаимное влияние дефицита кислорода и продукции NO. Кроме того, оба процесса можно регулировать с помощью экзогенного L-аргинина.
Цель. Оценить участие L-аргинина в развитии адаптационного ответа на хроническую нормобарическую гипоксию тканей мужской репродуктивной системы крыс и изучить его влияние на изменение метаболизма в условиях нормоксии.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на крысах сток Wistar (самцы, n = 8), которые были разделены на следующие группы: (1) животные, получавшие в течение 10 дней инъекции L-аргинина 500 мг/кг массы тела; (2) животные контрольной группы, получавшие 0,9% раствор NaCl; (3) животные, подвергшиеся хронической нормобарической гипоксии, ежедневно наблюдались в гермокамере до снижения концентрации кислорода 10% в воздухе один раз в день в течение 14 дней; (4) животные контрольной группы, наблюдались в вентилируемой камере; (5) животные, подвергшиеся гипоксии и инъекциям L-аргинина. Материалом для анализа послужили митохондрии и безмитохондриальная фракция цитоплазмы семенных пузырьков, головки и хвоста эпидидимиса. Оценка показателей проводилась фотометрически с помощью диагностических наборов и наборов иммуноферментного анализа.
Результаты. При получении животными L-аргинина относительно группы контроля наблюдалось повышение в цитоплазме количества α-субъединицы гипоксией индуцируемого фактора в семенных пузырьках на 132% (р = 0,01), в хвосте эпидидимиса на 32% (р = 0,02) и снижение в митохондриях на 45% (р = 0,01) и 60% (р = 0,002) соответственно, снижение уровня сукцината на 40% (р = 0,005) и 51% (р = 0,0009), повышение концентрации молочной кислоты в цитоплазме на 194% (р = 0,03) и 253% (р = 0,018), снижение активности цитохромоксидазы с 0,96 [0,66; 1,69] у.е./мг белка до 0,27 [0,23; 0,32] (р = 0,0009) и с 1,04 [0,84; 1,33] до 0,26 [0,14; 0,37] (р = 0,003). Наблюдаемые изменения характерны для состояния гипоксии и объясняются переключением клетки на получение энергии гликолитическим путем, в отличие от митохондриального при нормоксии. Совместное влияние гипоксии и аргинина частично усиливали эффекты друг друга.
Заключение. L-аргинин вызывает в клетках гипоксия-подобное состояние посредством активации α-субъединицы гипоксией индуцируемого фактора, снижения активности цитохромоксидазы и увеличения функции гликолиза, а также частично усиливает эффекты хронической нормобарической гипоксии.
Ключевые слова
Полный текст
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
L-Арг — L-аргинин
АТФ — аденозинтрифосфат
АФК — активные формы кислорода
ЛДГ — лактатдегидрогеназа
МФ — митохондриальная фракция
НАД — никотинамидадениндинуклеотид
НАДН — никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
СДГ — сукцинатдегидрогеназа
ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия
ЦО — цитохромоксидаза
ЦФ — цитоплазматическая фракция
ЭТЦ — электрон-транспортная цепь
ASS — argininosuccinate synthetase (аргининосукцинатсинтетаза)
COX — cytochrome c oxidase (цитохромоксидаза)
eNOS — endothelial NO-synthase (эндотелиальная синтаза оксида азота (II))
HIF — hypoxia-inducible factor (гипоксией индуцируемый фактор)
iNOS — inducible NO-synthase (индуцибельная синтаза оксида азота (II))
nNOS — neuronal NO-synthase (нейрональная синтаза оксида азота (II))
NOS — nitric oxide synthase (синтаза оксида азота (II))
PHD — prolyl hydroxylase domain (пролилгидроксилаза)
VEGF — vascular еndothelial growth factors (факторы роста эндотелия сосудов)
ВВЕДЕНИЕ
Протеиногенная аминокислота L-аргинин (L-Арг) имеет большое значение для организма не только в качестве структурного компонента белков, но и как донор атомов азота в синтезе полиаминов, мочевины и при образовании аммонийных солей, а также для синтеза NO. Сигнальная роль оксида азота (II) уже не вызывает сомнений и не ограничивается регуляцией вазодилатации, что делает L-Арг привлекательным объектом исследований.
Ключевым ферментом синтеза L-Арг является аргининосукцинатсинтетаза (англ.: argininosuccinate synthetase, ASS) [1], в то время как сама аминокислота может использоваться в качестве субстрата при синтезе NO c помощью NO-cинтаз (англ.: nitric oxide synthase, NOS), а также подвергаться распаду до мочевины при участии аргиназы, причем оба фермента конкурируют друг с другом [2]. NOS представлена тремя изоформами: двумя Са-зависимыми конститутивными, названными по тем тканям, где впервые были обнаружены — эндотелиальной (англ.: endothelial NO-synthase, eNOS) и нейрональной (англ.: neuronal NO-synthase, nNOS), а также Са-независимой индуцибельной (англ.: inducible NO-synthase, iNOS).
В литературе отмечается взаимное влияние друг на друга аргиназы и всех трех изоформ NOS. Большое количество исследований в этой области посвящено вопросу участия этих ферментов в развитии эндотелиальной дисфункции [3]. Повышение синтеза NO способствует S-нитрозилированию аргиназы, что приводит к ее активации, и уменьшению уровня субстрата — L-Арг [4]. Получение экзогенного L-Арг вызывает дозозависимое повышение количества оксида азота (II) в крови и увеличивает экспрессию eNOS [5] и iNOS [6]. Нарушение связывания кальция вследствие снижения фосфорилирования eNOS по остатку серина в 1177 положении и увеличения фосфорилирования треонина в 495 приводит к уменьшению активности этого фермента, что наблюдается при гипоксии. При этом отмечается усиление экспрессии аргиназы [7]. Таким образом, участие L-Арг в насыщении тканей кислородом может оказаться решающим из-за прямого влияния на синтез оксида азота (II) при гипоксии. Применение этому эффекту находят в лечении почечной недостаточности, в т.ч. благодаря активации сигнальных путей оксида азота (II) [8], нарушений костной ткани [9], хронической обструктивной болезни легких [10], при хронической маточно-плацентарной ишемии [11], а также половой дисфункции [12]. Оценка уровня NO в крови является важным диагностическим критерием развития патологических процессов, а также имеет прогностический характер [13]. Повышение продукции NO при гипоксии может быть успешным механизмом адаптации не только с позиции усиления вазодилатации, но и с позиции сигналинга, так как, активируя гуанилатциклазу, оксид азота (II) индуцирует синтез фетального гемоглобина, который имеет более высокое сродство к кислороду по сравнению с гемоглобином взрослого.
Ожидаемый эффект повышения синтеза NO в ответ на введение L-Арг опровергается в исследованиях на линии клеток нейробластомы человека NB9, экспрессирующих nNOS [14]. В эксперименте показано переключение работы синтазы оксида азота с продукции NO на генерацию активных форм кислорода (АФК) в присутствии высокого количества аргинина, что возможно объясняется ускорением перехода в этих условиях оксида азота (II) в пероксинитрит — сильный окислитель, относящийся к активным формам азота. Этот феномен рассматривается как один из механизмов косвенного токсического действия аминокислоты. Имеются свидетельства нейротоксичности оксида азота (II), синтезируемого nNOS и iNOS, при гипоксии [15–16].
Кроме перечисленных путей метаболизма L-Арг, в поддержании пула этой аминокислоты важное место занимает один их ферментов орнитинового цикла ASS, экспрессия которого регулируется гипоксией индуцируемым фактором (англ.: hypoxia-inducible factor, HIF): замедление транскрипции обусловлено связыванием HIF с энхансером в промоторе гена энзима ASS1 [1]. У млекопитающих HIF представлен тремя формами: HIF1, HIF2, HIF3. Все три варианта активны в виде гетеродимера, состоящего из α и β субъединиц. HIF1α — кислородчувствительный мономер HIF — в условиях нормоксии подвергается гидроксилированию и полиубиквитинированию с помощью пролилгидроксилазы (англ.: prolyl hydroxylase domain, PHD) и белка фон Гиппеля–Линдау соответственно, что приводит к его протеасомной деградации. В случаях, когда этому белку удается избежать протеолиза, HIF1α ассоциируется с HIF1β, проникает в ядро и выполняет функцию транскрипционного фактора. Среди неканонических, т. е. негипоксических, путей сохранения высокой концентрации HIF1α называют повышение его нитрозилирования [17] и одновременное ингибирование PHD оксидом азота (II) [18]. Эти механизмы позволяют предположить, что получение экзогенного L-Арг животными в условиях нормоксии может способствовать переключению метаболизма клетки на получение энергии анаэробным путем, вызывая псевдогипоксию. Еще один неканонический путь активации HIF связан с дефицитом сукцинатдегидрогеназы (СДГ), что приводит к повышению содержания сукцината, который аллостерически ингибирует PHD [19].
В целом, нарушение работы митохондрий может спровоцировать аномальный ответ на гипоксию. Так, накопление пирувата способствует активации HIF, однако нарастание восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) [20] так же, как и дефицит лактата, активирует PHD, что ведет к деградации HIF и развитию псевдонормоксии — состояния, при котором в условиях кислорододефицита не развивается адаптационный ответ, типичный для гипоксии. Стабилизированный транскрипционный фактор активирует экспрессию генов, кодирующих ферменты гликолиза, в том числе лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Можно предположить, что активность этого фермента, в этом случае будет решающей в формировании адаптации, а лактату отводится сигнальная роль триггера этих изменений.
Кроме того, HIF участвует в регуляции метаболизма митохондрий, активируя экспрессию второго типа IV субъединицы цитохром с оксидазы (англ.: cytochrome c oxidase, COX), которая заменяет COX4I1, экспрессирующуюся в условиях нормоксии. Такая замена сопровождается уменьшением продукции АФК. Кроме того, снижению АФК способствует реверсия работы комплекса II электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) — сукцинатдегидрогеназы, что также контролируется NO [21].
Транскрипционный ответ на гипоксию, опосредованный HIF, реализуется лишь через несколько часов. Однако, для клеток важно быстрое реагирование на снижение уровня кислорода и перестраивание метаболизма в первые минуты гипоксического воздействия. Одним из механизмов раннего реагирования считается связывание HIF1α с белками на внешней мембране митохондрий, благодаря чему контролируется мембранный потенциал, синтез АТФ, выход цитохрома из межмембранного пространства, и в итоге снижается риск апоптоза [22].
Вторая стратегия адаптации к гипоксии направлена не на внутриклеточную перестройку, а на улучшение снаб- жения тканей кислородом путем усиленной вазодилатации и ангиогенеза, чему способствует HIF через активацию экспрессии iNOS и факторов роста эндотелия сосудов (англ.: vascular endothelial growth factors, VEGF).
Нарушение обеспечения клетки энергией вследствие гипоксии и реоксигенации лежат в основе патогенеза различных состояний, в частности, мужского бесплодия. L-Арг входит в состав препаратов, применяемых для решения проблемы половой дисфункции [23]. Эффекты этой аминокислоты опосредованы как участием в синтезе белков, так и действием продуцируемого NO: усиление притока крови к мужским половым органам и активация сперматогенеза, нормализация эрекции, антиоксидантная защита. Необходимо учитывать, что не все ткани нуждаются в усилении снабжения кислородом для правильной работы. Так, эпидидимис, где осуществляется накопление, созревание и хранение сперматозоидов, относится к тканям малочувствительным к гипоксии [24], что препятствует ранней активации половых клеток.
Таким образом, L-Арг способен оказывать влияние на изменение метаболизма клеток, способствуя развитию гипоксия-подобного ответа. В совокупности фактов о влиянии L-Арг представляется интересным исследовать его эффекты на клеточный метаболизм и работу митохондрий в условиях кислородного голодания in vivo.
Цель — оценить участие L-аргинина в развитии адаптационного ответа на хроническую нормобарическую гипоксию тканей мужской репродуктивной системы крыс и изучить его влияние на изменение метаболизма в условиях нормоксии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа с животными. Исследование с участием животных одобрено на заседании Комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных (Протокол № 16, 2018 г.), работа осуществлялась в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), Приказом МЗ РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Животные содержались в стандартных условиях.
Эксперимент выполнен на 40 половозрелых крысах-самцах сток Wistar массой тела 200–280 г, которые были разделены на 5 групп (n = 8):
- группа 1 (нормоксия) — контроль к группе 2;
- группа 2 (хроническая нормобарическая гипоксия, ХНГ) — моделирование ХНГ;
- группа 3 (NaCl) — контроль к группе 4;
- группа 4 (L-Арг) — введение экзогенного L-аргинина;
- группа 5 (ХНГ + L-Арг) — введение экзогенного L-аргинина при ХНГ; сравнением служили группы 2 и 4.
Моделирование ХНГ. Для моделирования ХНГ использовали герметичную камеру объемом 1,2 л (длина × ширина × высота: 10,5 × 10,5 × 11,0 см), которая была подключена к многоканальному газоанализатору МАГ-6-П-К (О2: интервал измерения 0%–100%; СО2: интервал измерения 0%–12%) так, что камера и газоанализатор составляли замкнутое пространство. Длительность нахождения животного в гермокамере определялась не временными рамками, а индивидуально для каждого животного по показателю газоанализатора, эксперимент длился до тех пор, пока уровень кислорода в камере не снижался до 10%. Манипуляции повторяли ежедневно один раз в день в утренние часы на протяжении 14 дней. Контрольная группа животных во время эксперимента помещалась в вентилируемую камеру [25].
Введение препарата L-аргинина. Животные в течение 10 дней получали экзогенный L-Арг (98,5%; Диаэм, Россия) из расчета 500 мг L-Арг на кг массы тела животного в виде 20% раствора в 0,9% NaCl, инъекции выполняли внутрибрюшинно одноразовым инсулиновым шприцем один раз в день в утренние часы. Контрольной группе животных вводили 0,9% раствор NaCl.
Животные, подвергшиеся ХНГ, которым назначили инъекции экзогенного L-Арг, получали препарат с 5 по 14 день эксперимента по моделированию гипоксии за 30 мин до сеанса.
Получение биоматериала. На 14 день эксперимента сразу после окончания процедур крысам вводили наркоз (смесь «Золетил® 100» и «Ксиланит®» в дозировке 6 мг/кг массы тела одноразовым инсулиновым шприцем внутримышечно). Далее отбирали семенные пузырьки, головку и хвост придатка яичка, из которых получали гомогенаты с помощью гомогенизатора Potter S (Sartorius AG, Германия) в Трис-HCl буфере pH = 7,4, содержащем 0,25 М раствор сахарозы, в соотношении 1 часть ткани (мг) к 9 частям буфера (мл). Все процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Полученные гомогенаты центрифугировали дважды: по 15 мин при 3000 g — для осаждения ядер и неразрушенных клеток и при 14000 g — для осаждения митохондрий. В качестве материала для исследования использовали безмитохондриальную цитоплазматическую фракцию (ЦФ) и ресуспендированный в среде выделения осадок митохондрий — митихондриальную фракцию (МФ) — с добавлением детергента Тритон-Х100.
Лабораторные методы анализа. Концентрацию метаболитов NO определяли по интенсивности розовой окраски, образующейся в реакции азосочетания нафтилэтилендиамина с диазотированным сульфаниламидом (реактив Грисса; НеваРеактив, Россия), который образуется в присутствии нитритов, интенсивность окраски зависит от количества нитритов и нитратов, которые восстанавливаются в нитриты с помощью VCl3 (Acros Organics, США), выражали в нмоль/мг белка.
Концентрацию сукцината определяли с помощью набора «Succinate Colorimetric Assay Kit» (Sigma-AldrichCo, США) по интенсивности окраски, образующейся в сопряженной реакции сукцинатоксидаза/пероксидаза, выражали в мкмоль/мг белка.
Количество HIF1α определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа «Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha» (Cloud-Clone Corp., США), выражали в нг/мг белка.
Измерения вышеперечисленных показателей проводили в 96-луночном микропланшете на фотометре планшетного типа Stat Fax 3200 (Awareness Technology Inc., США).
Концентрацию молочной кислоты определяли с помощью набора «Молочная кислота-Ольвекс» (Ольвекс Диагностикум, Россия) по интенсивности окраски, образующейся в сопряженной реакции лактатоксидаза/пероксидаза, выражали в мкмоль/мг белка.
Активность лактатдегидрогеназы определяли с помощью набора «ЛДГ» (Ольвекс Диагностикум, Россия) кинетическим методом по реакции восстановления пирувата в лактат и окисления НАДН в НАД+. Скорость окисления НАДН в НАД+ пропорциональна активности ЛДГ. Активность фермента выражали в у.е./мг белка.
Активность цитохромоксидазы (ЦО) определяли кинетическим методом по убыли оптической плотности раствора восстановленного цитохрома С в результате реакции окисления цитохрома кислородом в присутствии фермента, скорость реакции, пропорциональную активности фермента, выражали в у.е./мг белка.
Определяли вышеперечисленные показатели фотометрически с помощью биохимического анализатора Stat Fax 1904+ (Awareness Technology Inc., США).
Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли по убыли оптической плотности раствора феррицианида калия в результате реакции восстановления в присутствии фермента, скорость реакции, пропорциональную активности фермента, определяли фотометрически с помощью спектрофотометра СФ-2000 (ОКБ Спектр, Россия), выражали в нмоль сукцината/мг белка.
Содержание общего белка определяли фотометрически (фотоколориметр КФК-3-01-ЗОМЗ, Россия) по методу Лоури с помощью набора «КлиниТест-БЛ» (ЭКО Сервис, Россия).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel 2013 (Microsoft, США) и Statistica 12.0 (Stat Soft Inc., CША). Характер распределения определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для оценки уровня значимости в группах использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Результаты представлены в виде Медианы [Квартиль 1; Квартиль 3] — Me [Q1; Q3]. Уровень различий при сравнении двух независимых выборок считали статистически значимым при вероятности ошибки p < 0,05, при сравнении трех независимых выборок применяли поправку Бонферрони и считали статистически значимым уровень различий при вероятности ошибки p < 0,0167. При значении 0,05 ≤ р < 0,10 считали вероятной тенденцию к изменению показателей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При моделировании ХНГ в тканях семенных пузырьков, головке и хвосте эпидидимиса снижалась активность ЦО, ЛДГ МФ и содержание лактата МФ — в семенных пузырьках и головке эпидидимиса, концентрация метаболитов NO и активность ЛДГ ЦФ — в хвосте эпидидимиса, наблюдалось уменьшение содержания метаболитов NO и повышение молочной кислоты ЦФ в семенных пузырьках (табл. 1).
Таблица 1. Изменение биохимических показателей семенных пузырьков, головки и хвоста эпидидимиса крыс при хронической нормобарической гипоксии (n = 8; Me [Q1; Q3])
Показатель | Группа 1 (нормоксия) | Группа 2 (ХНГ) | р |
СЕМЕННЫЕ ПУЗЫРЬКИ | |||
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка | 974 [906; 1064] | 717 [628; 784] | 0,003 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | 0,024 | ||
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | 0,16 | ||
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 1123 [989; 1453] | 828 [617; 957] | 0,007 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | 0,71 | ||
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | 0,01 | ||
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | 0,008 | ||
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 798 [602; 1146] | 1125 [1003; 1379] | 0,21 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 3061 [2211; 3907] | 1272 [1224; 2550] | 0,13 |
ЦО, у.е./мг белка | 0,0005 | ||
ГОЛОВКА ЭПИДИДИМИСА | |||
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка | 1023 [900; 1544] | 897 [667; 1046] | 0,13 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | 0,27 | ||
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | 0,43 | ||
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 1202 [1092; 1868] | 838 [660; 928] | 0,0039 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | 0,49 | ||
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | 0,0009 | ||
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | 0,24 | ||
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 3383 [1659; 4088] | 804 [709; 977] | 0,001 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 5799 [5431; 6590] | 3088 [2247; 3724] | 0,00009 |
ЦО, у.е./мг белка | 0,007 | ||
ХВОСТ ЭПИДИДИМИСА | |||
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка | 1055 [902; 1207] | 825 [766; 868] | 0,01 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | 20,5 [19; 23] | 0,01 | |
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | 0,014 | ||
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 1355 [1240; 1608] | 958 [760; 1078] | 0,03 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | 0,96 | ||
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | 0,48 | ||
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | 0,16 | ||
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 2732 [1592; 3140] | 2882 [2394; 3529] | 0,37 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 7158 [5684; 7359] | 3532 [2810; 4327] | 0,018 |
ЦО, у.е./мг белка | 0,03 |
Примечания: L-Арг — L-аргинин; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; ЦФ — цитоплазматическая фракция; МФ — митохондриальная фракция; СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ЦО — цитохромоксидаза, HIF — hypoxia-inducible factor (гипоксией индуцируемый фактор)
В эксперименте с введением животным экзогенного L-Арг в митохондриях всех исследуемых тканей наблюдалось снижение количества HIF1α, содержания метаболитов оксида азота (II) и сукцината, активности ЦО; в митохондриях семенных пузырьков — снижение уровня молочной кислоты и активности ЛДГ, в митохондриях хвоста эпидидимиса — снижение лактата при одновременном увеличении активности ЛДГ (табл. 2). В цитоплазме исследуемых тканей наблюдалось повышение следующих показателей: в семенных пузырьках, головке и хвосте эпидидимиса — молочной кислоты, в семенных пузырьках и хвосте придатка яичка — HIF1α, активность ЛДГ только в хвосте эпидидимиса.
Таблица 2. Влияние аргинина на изменение биохимических показателей семенных пузырьков, головки и хвоста эпидидимиса крыс при хронической нормобарической гипоксии (n = 8; Me [Q1; Q3])
Показатель | Группа 3 (NaCl) | Группа 4 (L-Арг) | Группа 5 (ХНГ + L-Арг) |
СЕМЕННЫЕ ПУЗЫРЬКИ | |||
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка | 792 [703; 911] | 650 [578; 713] р3–4 = 0,03 | 734 [601; 1007] р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,43 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,01 | р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,16 | |
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,01 | р2–5 = 0,007 р4–5 = 0,43 | |
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 985 [847; 1376] | 594 [533; 655] р3–4 = 0,005 | 644 [624; 690] р2–5 = 0,49 р4–5 = 0,23 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | р3-4 = 0,96 | р2-5 = 0,13 р4-5 = 0,04 | |
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,007 | р2–5 = 0,007 р4–5 = 0,005 | |
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,03 | р2–5 = 0,052 р4–5 = 0,56 | |
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 1440 [741; 2373] | 565 [384; 783] р3–4 = 0,04 | 625 [426; 1040] р2–5 = 0,19 р4–5 = 1,0 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 4071 [2823; 5028] | 3542 [1909; 5909] р3–4 = 0,75 | 3448 [2935; 3970] р2–5 = 0,014 р4–5 = 0,96 |
ЦО, у.е./мг белка | р3–4 = 0,0009 | р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,07 | |
ГОЛОВКА ЭПИДИДИМИСА | |||
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка | 999 [876; 1225] | 651 [609; 701] р3–4 = 0,001 | 1043 [910; 1576] р2–5 = 0,13 р4–5 = 0,0009 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,002 | р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,0009 | |
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,32 | р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,007 | |
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 1140 [928; 1456] | 539 [448; 599] р3–4 = 0,0009 | 1295 [1276; 1459] р2–5 = 0,0009 р4–5 = 0,0009 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | р3–4 = 0,43 | р2–5 = 0,1 Р4–5 = 0,56 | |
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,16 | р2–5 = 0,0009 р4–5 = 0,003 | |
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,001 | р2–5 = 0,43 р4–5 = 0,03 | |
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 1175 [720; 1839] | 1741 [1438; 2627] р3–4 = 0,27 | 2466 [1328; 3284] р2–5 = 0,004 р4-5 = 0,71 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 3765 [3294; 4511] | 4607 [4010; 5515] р3–4 = 0,23 | 4088 [3247; 4775] р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,27 |
ЦО, у.е./мг белка | р3–4 = 0,00002 | р2–5 = 0,04 р4–5 = 0,005 | |
ХВОСТ ЭПИДИДИМИСА | |||
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка | 1239 [881; 1568] | 520 [476; 568] р3–4 = 0,002 | 712 [665; 846] р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,01 |
HIF1α МФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,002 | р2–5 = 0,31 р4–5 = 0,08 | |
HIF1α ЦФ, нг/мг белка | р3–4 = 0,02 | р2–5 = 0,13 р4–5 = 0,1 | |
Сукцинат, мкмоль/мг белка | 1606 [1211; 2006] | 794 [682; 867] р3–4 = 0,0009 | 1161 [895; 1491] р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,007 |
СДГ, нмоль сукцината/мг белка | р3–4 = 0,31 | р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,013 | |
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,03 | р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,03 | |
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка | р3–4 = 0,018 | р2–5 = 0,014 р4–5 = 0,43 | |
ЛДГ МФ, у.е./мг белка | 1685 [902; 2556] | 3456 [2993; 3895] р3–4 = 0,046 | 3475 [2331; 5748] р2–5 = 0,79 р4–5 = 0,79 |
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка | 5289 [4088; 5845] | 8375[7407; 10510] р3–4 = 0,005 | 6507 [4636; 8196] р2–5 = 0,08 р4–5 = 0,16 |
ЦО, у.е./мг белка | р3–4 = 0,003 | р2–5 = 0,001 р4–5 = 0,27 |
Примечания: L-Арг — L-аргинин; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; МФ — митохондриальная фракция; СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; ЦО — цитохромоксидаза; ЦФ — цитоплазматическая фракция
При коррекции гипоксии с помощью экзогенного L-арг наблюдалось нарастание концентрации лактата в митохондриях семенных пузырьков по сравнению с ХНГ, а в цитоплазме — количества HIF1α и активности ЛДГ; в митохондриях головки эпидидимиса — увеличение уровня сукцината, молочной кислоты и активности ЛДГ; в митохондриях хвоста эпидидимиса — снижение активности ЦО, а в цитоплазме — возрастание содержания лактата и активности ЛДГ (табл. 1, 2). Сочетанное воздействие факторов (ХНГ + L-Арг) по сравнению с действием только L-Арг привело к повышению содержания лактата в митохондриях семенных пузырьков; метаболитов NO и сукцината — в обеих частях придатка яичка; количества HIF1α (МФ и ЦФ), молочной кислоты и активности ЦО — в головке эпидидимиса; активности СДГ — в митохондриях хвоста эпидидимиса.
ОБСУЖДЕНИЕ
Некоторые изменения, наблюдаемые в условиях получения экзогенного L-Арг, имеют сходную тенденцию с моделью ХНГ. В частности, это прослеживается в накоплении молочной кислоты [26], HIF1α [27] и в активности ЦО [25]. Повышение количества HIF1α, вызванное влиянием различных веществ даже в условиях нормального напряжения кислорода, характеризуют как состояние псевдогипоксии. Транскрипционная активность HIF1α способствует дальнейшим преобразованиям метаболизма, что объясняет характер изменений в концентрации лактата и активности ЦО. Другими словами, можно сказать, что L-Арг проявляет гипоксия-подобный (англ.: hypoxia-like) эффект.
Влияние L-арг на стабилизацию HIF1α объясняет схожесть метаболического ответа в этой экспериментальной модели с ответом при ХНГ. Однако при этом наблюдается тканеспецифичность реакции. Так, в семенных пузырьках L-Арг способствовал почти полному соответствию изменений, характерных для гипоксии (увеличение концентрации лактата, количества HIF1α и активности ЛДГ в цитоплазме, снижение активности ЦО), при этом в эксперименте с экзогенным получением животными L-Арг на фоне ХНГ накопление HIF1α в цитоплазме происходило эффективнее, чем в условиях только гипоксии. Возможно, сочетанное влияние этих факторов произвело некоторый кумулятивный эффект, что и послужило причиной повышения активности ЛДГ в цитоплазме клеток семенных пузырьков относительно состояния гипоксии и накопления лактата относительно как ХНГ, так и L-Арг в митохондриях. Предположительно в основе этих изменений лежит опосредованная HIF активация экспрессии ЛДГ. Наблюдаемое снижение содержания HIF1α в МФ в условиях гипоксии или при получении L-Арг можно связать с повышением его транскрипционной активности, вызванной систематическим воздействием этих факторов. Мы предполагаем, что за время эксперимента удалось добиться стабильного транскрипционного ответа, благодаря чему необходимость острого реагирования путем непосредственного связывания HIF1α с белками внешней мембраны митохондрий становится менее значимой.
Отсутствие статистически значимых изменений в активности СДГ, но при этом истощение пула сукцината, как и накопление лактата, говорит о переключении работы ЭТЦ с основного поставщика протонов в условиях нормоксии комплекса I на работу комплекса II. Таким образом, клетка пытается компенсировать неэффективное в обсуждаемых условиях окисление кофермента НАДН, восстанавливая пируват в лактат, для поддержания работы гликолиза и цитратного цикла, а работа ЭТЦ поддерживается за счет окисления в основном сукцината. При этом получение L-Арг не повлияло на активность АТФ-синтазы.
В эпидидимисе эффект назначения экзогенного L-Арг оказался схожим с таковым в семенных пузырьках. Отличительной особенностью явилось накопление лактата в цитоплазме тканей и повышение активности ЛДГ в хвосте эпидидимиса. Ранее в наших исследованиях мы описывали различия между функциональными участками придатка яичка в накоплении лактата и HIF1α [25–27] в условиях ХНГ. Назначение экзогенного L-Арг демонстрирует противоположные эффекты: повышение активности ЛДГ в хвосте при отсутствии изменений в головке придатка яичка. Интересно, что у животных в группе ХНГ + L-Арг наблюдалось повышение активности ЦО в головке эпидидимиса, но в хвосте отмечалось самое низкое значение активности фермента. Повышение активности СДГ и накопление сукцината при этом могут свидетельствовать о перестройке работы ЭТЦ: в отсутствии эффективного транспорта электронов через цитохромоксидазу конечным акцептором может являться фумарат, что и приводит к увеличению концентрации сукцината, а также усилению его сигнальной функции и снижению образования АФК. Известно, что даже в условиях нормоксии ткани по-разному насыщены кислородом и хвост эпидидимиса отличается пониженным его содержанием, а также более активной экспрессией HIF1α [24], в связи с чем можно сделать предположение о влиянии экзогенного аргинина при гипоксии на клетки хвоста эпидидимиса, как мощного стимула для сигналинга и переключения метаболизма на получение энергии путем гликолиза.
Понижение концентрации метаболитов оксида азота (II) при гипоксии можно объяснить возможным замедлением под влиянием HIF1 экспрессии ASS, отвечающей за биосинтез аргинина в большинстве тканей организма [2], следствием чего становится снижение биодоступности этой аминокислоты как субстрата для синтеза NO. Курсовое назначение экзогенного L-Арг в дозе 500 мг/кг массы тела не привело к ожидаемому повышению NO в тканях на момент завершения эксперимента. Объяснить данный феномен можно, с одной стороны, гипоксия-подобным эффектом L-Арг, а с другой стороны, активацией аргиназы с помощью нитрозилирования [4], что в совокупности способствовало снижению уровня метаболитов NO. Возможно, такой механизм лежит в основе адаптации тканей и защите их от избытка оксида азота (II).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Парентеральное получение животными L-Аргинина вызывает в клетках семенных пузырьков и хвоста эпидидимиса развитие псевдогипоксии, что частично усиливает эффекты, наблюдаемые при хронической нормобарической гипоксии. В головке эпидидимиса эта закономерность выражена меньше. Являясь предшественником оксида азота (II) L-Аргинин способствует понижению активности цитохромоксидазы во всех изучаемых тканях, увеличению роли гликолиза в эпидидимисе, о чем свидетельствует повышение активности лактатдегидрогеназы и накопление лактата.
Особенно выражены изменения в каудальном отделе придатка яичка, где также наблюдается реверсия работы сукцинатдегидрогеназы, что обеспечивает клетку лучшей защитой в условиях хронической нормобарической гипоксии. Таким образом, L-Аргинин проявляет гипоксия-подобный эффект посредством регуляции активности гипоксией индуцируемого фактора и ферментов, участвующих в энергетическом обмене, благодаря чему экзогенное назначение этой аминокислоты позволяет контролировать процессы при адаптации к дефициту кислорода.
ДОПОЛНИТЕЛЬНО
Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов: Марсянова Ю. А. — проведение основных этапов исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка, анализ и интерпретация данных, написание текста статьи; Звягина В. И. — разработка концепции и дизайна исследования, оценка интерпретации данных, проверка и редактирование статьи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).
Об авторах
Юлия Александровна Марсянова
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
Автор, ответственный за переписку.
Email: yuliyamarsyanova@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-4948-4504
SPIN-код: 4075-3169
Россия, Рязань
Валентина Ивановна Звягина
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
Email: vizvyagina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789
SPIN-код: 7553-8641
к.б.н., доцент
Россия, РязаньСписок литературы
- Kuo M.T., Savaraj N., Feun L.G. Targeted cellular metabolism for cancer chemotherapy with recombinant arginine-degrading enzymes // Oncotarget. 2010. Vol. 1, No. 4. P. 246–251. doi: 10.18632/oncotarget.135
- Shin W., Cuong T.D., Lee J.H., et al. Arginase Inhibition by Ethylacetate Extract of Caesalpinia sappan Lignum Contributes to Activation of Endothelial Nitric Oxide Synthase // Korean J. Physiol. Pharmacol. 2011. Vol. 15, No. 3. P. 123–128. doi: 10.4196/kjpp.2011.15.3.123
- Berkowitz D.E., White R., Li D., et al. Arginase reciprocally regulates nitric oxide synthase activity and contributes to endothelial dysfunction in aging blood vessels // Circulation. 2003. Vol. 108, No. 16. P. 2000–2006. doi: 10.1161/01.CIR.0000092948.04444.C7
- Kim J.H., Bugaj L.J., Oh Y.J., et al. Arginase inhibition restores NOS coupling and reverses endothelial dysfunction and vascular stiffness in old rats // J. Appl. Physiol. 2009. Vol. 107, No. 4. P. 1249–1257. doi: 10.1152/japplphysiol.91393.2008
- Liu P.–Q., Lu W., Pan J.–Y. Molecular mechanism of nitric oxide in preventing cardiomyocytes from hypertrophic response induced by angiotensin II // Sheng Li Xue Bao. 2002. Vol. 54, No. 3. P. 213–218.
- Agawa H., Ikuta K., Minamiyama Y., et al. Down-regulation of spontaneous Epstein-Barr virus reactivation in the P3HR-1 cell line by L-arginine // Virology. 2002. Vol. 304, No. 1. P. 114–124. doi: 10.1006/viro.2002.1709
- Prieto C.P., Krause B.J., Quezada C., et al. Hypoxia-reduced nitric oxide synthase activity is partially explained by higher arginase-2 activity and cellular redistribution in human umbilical vein endothelium // Placenta. 2011. Vol. 32, No. 12. P. 932–940. doi: 10.1016/j.placenta.2011.09.003
- Ito K., Chen J., Seshan S.V., et al. Dietary arginine supplemen- tation attenuates renal damage after relief of unilateral ureteral obstruction in rats // Kidney Int. 2005. Vol. 68, No. 2. P. 515–528. doi: 10.1111/j.1523-1755.2005.00429.x
- Гудырев О.С., Файтельсон А.В., Соболев М.С., и др. Изучение остеопротективного действия l-аргинина, l-норвалина и розувастатина на модели гипоэстроген-индуцированного остеопороза у крыс // Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2019. Т. 27, № 3. C. 325–332. doi: 10.23888/PAVLOVJ2019273325-332
- Урясьев О.М., Шаханов А.В., Канатбекова Ж.К. Оксид азота и регуляторы его синтеза при хронической обструктивной болезни легких // Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2021. Т. 29, № 3. C. 427–434. doi: 10.17816/PAVLOVJ62681
- Bednov A., Espinoza J., Betancourt A., et al. L-arginine prevents hypoxia-induced vasoconstriction in dual-perfused human placental cotyledons // Placenta. 2015. Vol. 36, No. 11. P. 1254–1259. doi: 10.1016/j.placenta.2015.08.012
- Kim N.N., Christianson D.W., Traish A.M. Role of arginase in the male and female sexual arousal response // J. Nutr. 2004. Vol. 134, No. 10. P. 2873S–2879S, 2895S. doi: 10.1093/jn/134.10.2873S
- Калинин Р.Е., Сучков И.А., Мжаванадзе Н.Д., и др. Метаболиты оксида азота при развитии осложнений после открытых реконструктивных вмешательств у пациентов с периферическим атеросклерозом // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2021. Т. 9, № 3. С. 407–414. doi: 10.23888/HMJ202193407-414
- Todoroki S., Goto S., Urata Y., et al. High concentration of L-arginine suppresses nitric oxide synthase activity and produces reactive oxygen species in NB9 human neuroblastoma cells // Mol. Med. 1998. Vol. 4, No. 8. P. 515–524.
- Huang Z., Huang P.L., Panahian N., et al. Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase // Science. 1994. Vol. 265, No. 5180. P. 1883–1885. doi: 10.1126/science.7522345
- Moro M.A., Cárdenas A., Hurtado O., et al. Role of nitric oxide after brain ischaemia // Cell Calcium. 2004. Vol. 36, No. 3–4. P. 265–275. doi: 10.1016/j.ceca.2004.02.011
- Li F., Sonveaux P., Rabbani Z.N., et al. Regulation of HIF-1alpha stability through S-nitrosylation // Mol. Cell. 2007. Vol. 26, No. 1. С. 63–74. doi: 10.1016/j.molcel.2007.02.024
- Fong G.–H., Takeda K. Role and regulation of prolyl hydroxylase domain proteins // Cell Death Differ. 2008. Vol. 15, No. 4. С. 635–641. doi: 10.1038/cdd.2008.10
- Selak M.A., Armour S.M., MacKenzie E.D., et al. Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-alpha prolyl hydroxylase // Cancer Cell. 2005. Vol. 7, No. 1. P. 77–85. doi: 10.1016/j.ccr.2004.11.022
- Iommarini L., Porcelli A.M., Gasparre G., et al. Non-Canonical Mechanisms Regulating Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha in Cancer // Front. Oncol. 2017. Vol. 7. P. 286. doi: 10.3389/fonc.2017.00286
- Banerjee R., Kumar R. Gas regulation of complex II reversal via electron shunting to fumarate in the mammalian ETC // Trends Biochem. Sci. 2022. Vol. 47, No. 8. P. 689–698. doi: 10.1016/j.tibs.2022.03.011
- Pahima H., Reina S., Tadmor N., et al. Hypoxic-induced truncation of voltage-dependent anion channel 1 is mediated by both asparagine endopeptidase and calpain 1 activities // Oncotarget. 2018. Vol. 9, No. 16. P. 12825–12841. doi: 10.18632/oncotarget.24377
- Al Khayal A.M., Balaraj F.K., Alferayan T.A., et al. Empirical therapy for male factor infertility: Survey of the current practice // Urol. Ann. 2021. Vol. 13, No. 4. P. 346–350. doi: 10.4103/UA.UA_22_20
- Palladino M.A., Powell J.D., Korah N., et al. Expression and Localization of Hypoxia-Inducible Factor-1 Subunits in the Adult Rat Epididymis // Biol Reprod. 2004. Vol. 70, No. 4. P. 1121–1130. doi: 10.1095/biolreprod.103.023085
- Марсянова Ю.А., Звягина В.И., Сучкова О.Н. Способ моделирования нормобарической хронической гипоксии у крыс самцов сток WISTAR // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2022. Т. 10, № 2. С. 147–156. doi: 10.23888/HMJ2022102147-156
- Марсянова Ю.А., Звягина В.И. Влияние сукцината на некоторые показатели биоэнергетического обмена в семенных пузырьках и эпидидимисе у самцов крыс в условиях хронической гипоксии // Вопросы биологической, медицинской и фарма- цевтической химии. 2021. Т. 24, № 2. С. 49–54. doi: 10.29296/25877313-2021-02-08
- Марсянова Ю.А., Звягина В.И. Изменение количества HIF1α при хронической нормобарической гипоксии и на фоне получения сукцината // Известия ГГТУ. Медицина, фармация. 2021. № 4. С. 72–80.