Гипоксия-подобный эффект L-аргинина в семенных пузырьках и эпидидимисе крыс

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

L-Арг — L-аргинин

АТФ — аденозинтрифосфат

АФК — активные формы кислорода

ЛДГ — лактатдегидрогеназа

МФ — митохондриальная фракция

НАД — никотинамидадениндинуклеотид

НАДН — никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

СДГ — сукцинатдегидрогеназа

ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия

ЦО — цитохромоксидаза

ЦФ — цитоплазматическая фракция

ЭТЦ — электрон-транспортная цепь

ASS — argininosuccinate synthetase (аргининосукцинатсинтетаза)

COX — cytochrome c oxidase (цитохромоксидаза)

eNOS — endothelial NO-synthase (эндотелиальная синтаза оксида азота (II))

HIF — hypoxia-inducible factor (гипоксией индуцируемый фактор)

iNOS — inducible NO-synthase (индуцибельная синтаза оксида азота (II))

nNOS — neuronal NO-synthase (нейрональная синтаза оксида азота (II))

NOS — nitric oxide synthase (синтаза оксида азота (II))

PHD — prolyl hydroxylase domain (пролилгидроксилаза)

VEGF — vascular еndothelial growth factors (факторы роста эндотелия сосудов)

ВВЕДЕНИЕ

Протеиногенная аминокислота L-аргинин (L-Арг) имеет большое значение для организма не только в качестве структурного компонента белков, но и как донор атомов азота в синтезе полиаминов, мочевины и при образовании аммонийных солей, а также для синтеза NO. Сигнальная роль оксида азота (II) уже не вызывает сомнений и не ограничивается регуляцией вазодилатации, что делает L-Арг привлекательным объектом исследований.

Ключевым ферментом синтеза L-Арг является аргининосукцинатсинтетаза (англ.: argininosuccinate synthetase, ASS) [1], в то время как сама аминокислота может использоваться в качестве субстрата при синтезе NO c помощью NO-cинтаз (англ.: nitric oxide synthase, NOS), а также подвергаться распаду до мочевины при участии аргиназы, причем оба фермента конкурируют друг с другом [2]. NOS представлена тремя изоформами: двумя Са-зависимыми конститутивными, названными по тем тканям, где впервые были обнаружены — эндотелиальной (англ.: endothelial NO-synthase, eNOS) и нейрональной (англ.: neuronal NO-synthase, nNOS), а также Са-независимой индуцибельной (англ.: inducible NO-synthase, iNOS).

В литературе отмечается взаимное влияние друг на друга аргиназы и всех трех изоформ NOS. Большое количество исследований в этой области посвящено вопросу участия этих ферментов в развитии эндотелиальной дисфункции [3]. Повышение синтеза NO способствует S-нитрозилированию аргиназы, что приводит к ее активации, и уменьшению уровня субстрата — L-Арг [4]. Получение экзогенного L-Арг вызывает дозозависимое повышение количества оксида азота (II) в крови и увеличивает экспрессию eNOS [5] и iNOS [6]. Нарушение связывания кальция вследствие снижения фосфорилирования eNOS по остатку серина в 1177 положении и увеличения фосфорилирования треонина в 495 приводит к уменьшению активности этого фермента, что наблюдается при гипоксии. При этом отмечается усиление экспрессии аргиназы [7]. Таким образом, участие L-Арг в насыщении тканей кислородом может оказаться решающим из-за прямого влияния на синтез оксида азота (II) при гипоксии. Применение этому эффекту находят в лечении почечной недостаточности, в т.ч. благодаря активации сигнальных путей оксида азота (II) [8], нарушений костной ткани [9], хронической обструктивной болезни легких [10], при хронической маточно-плацентарной ишемии [11], а также половой дисфункции [12]. Оценка уровня NO в крови является важным диагностическим критерием развития патологических процессов, а также имеет прогностический характер [13]. Повышение продукции NO при гипоксии может быть успешным механизмом адаптации не только с позиции усиления вазодилатации, но и с позиции сигналинга, так как, активируя гуанилатциклазу, оксид азота (II) индуцирует синтез фетального гемоглобина, который имеет более высокое сродство к кислороду по сравнению с гемоглобином взрослого.

Ожидаемый эффект повышения синтеза NO в ответ на введение L-Арг опровергается в исследованиях на линии клеток нейробластомы человека NB9, экспрессирующих nNOS [14]. В эксперименте показано переключение работы синтазы оксида азота с продукции NO на генерацию активных форм кислорода (АФК) в присутствии высокого количества аргинина, что возможно объясняется ускорением перехода в этих условиях оксида азота (II) в пероксинитрит — сильный окислитель, относящийся к активным формам азота. Этот феномен рассматривается как один из механизмов косвенного токсического действия аминокислоты. Имеются свидетельства нейротоксичности оксида азота (II), синтезируемого nNOS и iNOS, при гипоксии [15–16].

Кроме перечисленных путей метаболизма L-Арг, в поддержании пула этой аминокислоты важное место занимает один их ферментов орнитинового цикла ASS, экспрессия которого регулируется гипоксией индуцируемым фактором (англ.: hypoxia-inducible factor, HIF): замедление транскрипции обусловлено связыванием HIF с энхансером в промоторе гена энзима ASS1 [1]. У млекопитающих HIF представлен тремя формами: HIF1, HIF2, HIF3. Все три варианта активны в виде гетеродимера, состоящего из α и β субъединиц. HIF1α — кислородчувствительный мономер HIF — в условиях нормоксии подвергается гидроксилированию и полиубиквитинированию с помощью пролилгидроксилазы (англ.: prolyl hydroxylase domain, PHD) и белка фон Гиппеля–Линдау соответственно, что приводит к его протеасомной деградации. В случаях, когда этому белку удается избежать протеолиза, HIF1α ассоциируется с HIF1β, проникает в ядро и выполняет функцию транскрипционного фактора. Среди неканонических, т. е. негипоксических, путей сохранения высокой концентрации HIF1α называют повышение его нитрозилирования [17] и одновременное ингибирование PHD оксидом азота (II) [18]. Эти механизмы позволяют предположить, что получение экзогенного L-Арг животными в условиях нормоксии может способствовать переключению метаболизма клетки на получение энергии анаэробным путем, вызывая псевдогипоксию. Еще один неканонический путь активации HIF связан с дефицитом сукцинатдегидрогеназы (СДГ), что приводит к повышению содержания сукцината, который аллостерически ингибирует PHD [19].

В целом, нарушение работы митохондрий может спровоцировать аномальный ответ на гипоксию. Так, накопление пирувата способствует активации HIF, однако нарастание восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) [20] так же, как и дефицит лактата, активирует PHD, что ведет к деградации HIF и развитию псевдонормоксии — состояния, при котором в условиях кислорододефицита не развивается адаптационный ответ, типичный для гипоксии. Стабилизированный транскрипционный фактор активирует экспрессию генов, кодирующих ферменты гликолиза, в том числе лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Можно предположить, что активность этого фермента, в этом случае будет решающей в формировании адаптации, а лактату отводится сигнальная роль триггера этих изменений.

Кроме того, HIF участвует в регуляции метаболизма митохондрий, активируя экспрессию второго типа IV субъединицы цитохром с оксидазы (англ.: cytochrome c oxidase, COX), которая заменяет COX4I1, экспрессирующуюся в условиях нормоксии. Такая замена сопровождается уменьшением продукции АФК. Кроме того, снижению АФК способствует реверсия работы комплекса II электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) — сукцинатдегидрогеназы, что также контролируется NO [21].

Транскрипционный ответ на гипоксию, опосредованный HIF, реализуется лишь через несколько часов. Однако, для клеток важно быстрое реагирование на снижение уровня кислорода и перестраивание метаболизма в первые минуты гипоксического воздействия. Одним из механизмов раннего реагирования считается связывание HIF1α с белками на внешней мембране митохондрий, благодаря чему контролируется мембранный потенциал, синтез АТФ, выход цитохрома из межмембранного пространства, и в итоге снижается риск апоптоза [22].

Вторая стратегия адаптации к гипоксии направлена не на внутриклеточную перестройку, а на улучшение снаб- жения тканей кислородом путем усиленной вазодилатации и ангиогенеза, чему способствует HIF через активацию экспрессии iNOS и факторов роста эндотелия сосудов (англ.: vascular endothelial growth factors, VEGF).

Нарушение обеспечения клетки энергией вследствие гипоксии и реоксигенации лежат в основе патогенеза различных состояний, в частности, мужского бесплодия. L-Арг входит в состав препаратов, применяемых для решения проблемы половой дисфункции [23]. Эффекты этой аминокислоты опосредованы как участием в синтезе белков, так и действием продуцируемого NO: усиление притока крови к мужским половым органам и активация сперматогенеза, нормализация эрекции, антиоксидантная защита. Необходимо учитывать, что не все ткани нуждаются в усилении снабжения кислородом для правильной работы. Так, эпидидимис, где осуществляется накопление, созревание и хранение сперматозоидов, относится к тканям малочувствительным к гипоксии [24], что препятствует ранней активации половых клеток.

Таким образом, L-Арг способен оказывать влияние на изменение метаболизма клеток, способствуя развитию гипоксия-подобного ответа. В совокупности фактов о влиянии L-Арг представляется интересным исследовать его эффекты на клеточный метаболизм и работу митохондрий в условиях кислородного голодания in vivo.

Цель — оценить участие L-аргинина в развитии адаптационного ответа на хроническую нормобарическую гипоксию тканей мужской репродуктивной системы крыс и изучить его влияние на изменение метаболизма в условиях нормоксии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа с животными. Исследование с участием животных одобрено на заседании Комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных (Протокол № 16, 2018 г.), работа осуществлялась в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), Приказом МЗ РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Животные содержались в стандартных условиях.

Эксперимент выполнен на 40 половозрелых крысах-самцах сток Wistar массой тела 200–280 г, которые были разделены на 5 групп (n = 8):

- группа 1 (нормоксия) — контроль к группе 2;

- группа 2 (хроническая нормобарическая гипоксия, ХНГ) — моделирование ХНГ;

- группа 3 (NaCl) — контроль к группе 4;

- группа 4 (L-Арг) — введение экзогенного L-аргинина;

- группа 5 (ХНГ + L-Арг) — введение экзогенного L-аргинина при ХНГ; сравнением служили группы 2 и 4.

Моделирование ХНГ. Для моделирования ХНГ использовали герметичную камеру объемом 1,2 л (длина × ширина × высота: 10,5 × 10,5 × 11,0 см), которая была подключена к многоканальному газоанализатору МАГ-6-П-К (О₂: интервал измерения 0%–100%; СО₂: интервал измерения 0%–12%) так, что камера и газоанализатор составляли замкнутое пространство. Длительность нахождения животного в гермокамере определялась не временными рамками, а индивидуально для каждого животного по показателю газоанализатора, эксперимент длился до тех пор, пока уровень кислорода в камере не снижался до 10%. Манипуляции повторяли ежедневно один раз в день в утренние часы на протяжении 14 дней. Контрольная группа животных во время эксперимента помещалась в вентилируемую камеру [25].

Введение препарата L-аргинина. Животные в течение 10 дней получали экзогенный L-Арг (98,5%; Диаэм, Россия) из расчета 500 мг L-Арг на кг массы тела животного в виде 20% раствора в 0,9% NaCl, инъекции выполняли внутрибрюшинно одноразовым инсулиновым шприцем один раз в день в утренние часы. Контрольной группе животных вводили 0,9% раствор NaCl.

Животные, подвергшиеся ХНГ, которым назначили инъекции экзогенного L-Арг, получали препарат с 5 по 14 день эксперимента по моделированию гипоксии за 30 мин до сеанса.

Получение биоматериала. На 14 день эксперимента сразу после окончания процедур крысам вводили наркоз (смесь «Золетил® 100» и «Ксиланит®» в дозировке 6 мг/кг массы тела одноразовым инсулиновым шприцем внутримышечно). Далее отбирали семенные пузырьки, головку и хвост придатка яичка, из которых получали гомогенаты с помощью гомогенизатора Potter S (Sartorius AG, Германия) в Трис-HCl буфере pH = 7,4, содержащем 0,25 М раствор сахарозы, в соотношении 1 часть ткани (мг) к 9 частям буфера (мл). Все процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Полученные гомогенаты центрифугировали дважды: по 15 мин при 3000 g — для осаждения ядер и неразрушенных клеток и при 14000 g — для осаждения митохондрий. В качестве материала для исследования использовали безмитохондриальную цитоплазматическую фракцию (ЦФ) и ресуспендированный в среде выделения осадок митохондрий — митихондриальную фракцию (МФ) — с добавлением детергента Тритон-Х100.

Лабораторные методы анализа. Концентрацию метаболитов NO определяли по интенсивности розовой окраски, образующейся в реакции азосочетания нафтилэтилендиамина с диазотированным сульфаниламидом (реактив Грисса; НеваРеактив, Россия), который образуется в присутствии нитритов, интенсивность окраски зависит от количества нитритов и нитратов, которые восстанавливаются в нитриты с помощью VCl₃ (Acros Organics, США), выражали в нмоль/мг белка.

Концентрацию сукцината определяли с помощью набора «Succinate Colorimetric Assay Kit» (Sigma-AldrichCo, США) по интенсивности окраски, образующейся в сопряженной реакции сукцинатоксидаза/пероксидаза, выражали в мкмоль/мг белка.

Количество HIF1α определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа «Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha» (Cloud-Clone Corp., США), выражали в нг/мг белка.

Измерения вышеперечисленных показателей проводили в 96-луночном микропланшете на фотометре планшетного типа Stat Fax 3200 (Awareness Technology Inc., США).

Концентрацию молочной кислоты определяли с помощью набора «Молочная кислота-Ольвекс» (Ольвекс Диагностикум, Россия) по интенсивности окраски, образующейся в сопряженной реакции лактатоксидаза/пероксидаза, выражали в мкмоль/мг белка.

Активность лактатдегидрогеназы определяли с помощью набора «ЛДГ» (Ольвекс Диагностикум, Россия) кинетическим методом по реакции восстановления пирувата в лактат и окисления НАДН в НАД+. Скорость окисления НАДН в НАД+ пропорциональна активности ЛДГ. Активность фермента выражали в у.е./мг белка.

Активность цитохромоксидазы (ЦО) определяли кинетическим методом по убыли оптической плотности раствора восстановленного цитохрома С в результате реакции окисления цитохрома кислородом в присутствии фермента, скорость реакции, пропорциональную активности фермента, выражали в у.е./мг белка.

Определяли вышеперечисленные показатели фотометрически с помощью биохимического анализатора Stat Fax 1904+ (Awareness Technology Inc., США).

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли по убыли оптической плотности раствора феррицианида калия в результате реакции восстановления в присутствии фермента, скорость реакции, пропорциональную активности фермента, определяли фотометрически с помощью спектрофотометра СФ-2000 (ОКБ Спектр, Россия), выражали в нмоль сукцината/мг белка.

Содержание общего белка определяли фотометрически (фотоколориметр КФК-3-01-ЗОМЗ, Россия) по методу Лоури с помощью набора «КлиниТест-БЛ» (ЭКО Сервис, Россия).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel 2013 (Microsoft, США) и Statistica 12.0 (Stat Soft Inc., CША). Характер распределения определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для оценки уровня значимости в группах использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Результаты представлены в виде Медианы [Квартиль 1; Квартиль 3] — Me [Q1; Q3]. Уровень различий при сравнении двух независимых выборок считали статистически значимым при вероятности ошибки p < 0,05, при сравнении трех независимых выборок применяли поправку Бонферрони и считали статистически значимым уровень различий при вероятности ошибки p < 0,0167. При значении 0,05 ≤ р < 0,10 считали вероятной тенденцию к изменению показателей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При моделировании ХНГ в тканях семенных пузырьков, головке и хвосте эпидидимиса снижалась активность ЦО, ЛДГ МФ и содержание лактата МФ — в семенных пузырьках и головке эпидидимиса, концентрация метаболитов NO и активность ЛДГ ЦФ — в хвосте эпидидимиса, наблюдалось уменьшение содержания метаболитов NO и повышение молочной кислоты ЦФ в семенных пузырьках (табл. 1).

 

Таблица 1. Изменение биохимических показателей семенных пузырьков, головки и хвоста эпидидимиса крыс при хронической нормобарической гипоксии (n = 8; Me [Q1; Q3])

Показатель	Группа 1 (нормоксия)	Группа 2 (ХНГ)	р
СЕМЕННЫЕ ПУЗЫРЬКИ
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка	974 [906; 1064]	717 [628; 784]	0,003
HIF1α МФ, нг/мг белка	25,2 [20, 6; 35, 2]	14,8 [11, 6; 20]	0,024
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	4,4 [3, 9; 5]	3 [2, 9; 4, 3]	0,16
Сукцинат, мкмоль/мг белка	1123 [989; 1453]	828 [617; 957]	0,007
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,32 [0, 02; 0, 41]	0,32 [0, 24; 0, 46]	0,71
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	5,87 [4, 62; 6, 92]	1,76 [1, 41; 1, 95]	0,01
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	0,75 [0, 62; 0, 85]	1,66 [1, 2; 1, 99]	0,008
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	798 [602; 1146]	1125 [1003; 1379]	0,21
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	3061 [2211; 3907]	1272 [1224; 2550]	0,13
ЦО, у.е./мг белка	1,34 [1, 14; 1, 72]	0,31 [0, 25; 0, 41]	0,0005
ГОЛОВКА ЭПИДИДИМИСА
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка	1023 [900; 1544]	897 [667; 1046]	0,13
HIF1α МФ, нг/мг белка	14 [12; 20, 5]	12,2 [10; 16, 8]	0,27
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	4 [3, 9; 4, 4]	3,9 [2, 8; 4, 1]	0,43
Сукцинат, мкмоль/мг белка	1202 [1092; 1868]	838 [660; 928]	0,0039
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,35 [0, 1; 0, 52]	0,4 [0, 28; 0, 67]	0,49
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	5,65 [4, 38; 7, 47]	2,65 [2, 23; 3, 03]	0,0009
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	1,71 [1, 19; 1, 93]	1,94 [1, 66; 2, 2]	0,24
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	3383 [1659; 4088]	804 [709; 977]	0,001
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	5799 [5431; 6590]	3088 [2247; 3724]	0,00009
ЦО, у.е./мг белка	0,89 [0, 64; 1, 05]	0,35 [0, 26; 0, 49]	0,007
ХВОСТ ЭПИДИДИМИСА
Метаболиты оксида азота (II), нмоль/мг белка	1055 [902; 1207]	825 [766; 868]	0,01
HIF1α МФ, нг/мг белка	20,5 [19; 23]	12,8 [11, 1; 13, 7]	0,01
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	2,5 [2, 3; 3]	4,3 [3, 9; 4, 6]	0,014
Сукцинат, мкмоль/мг белка	1355 [1240; 1608]	958 [760; 1078]	0,03
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,22 [0, 18; 0, 67]	0,26 [0, 19; 0, 63]	0,96
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	6,25 [4, 84; 8, 12]	4,38 [2, 75; 6, 55]	0,48
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	1,18 [0, 82; 1, 6]	1,6 [1, 58; 1, 65]	0,16
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	2732 [1592; 3140]	2882 [2394; 3529]	0,37
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	7158 [5684; 7359]	3532 [2810; 4327]	0,018
ЦО, у.е./мг белка	1,23 [0, 91; 2, 21]	0,54 [0, 36; 0, 64]	0,03

Примечания: L-Арг — L-аргинин; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; ЦФ — цитоплазматическая фракция; МФ — митохондриальная фракция; СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ЦО — цитохромоксидаза, HIF — hypoxia-inducible factor (гипоксией индуцируемый фактор)

 

В эксперименте с введением животным экзогенного L-Арг в митохондриях всех исследуемых тканей наблюдалось снижение количества HIF1α, содержания метаболитов оксида азота (II) и сукцината, активности ЦО; в митохондриях семенных пузырьков — снижение уровня молочной кислоты и активности ЛДГ, в митохондриях хвоста эпидидимиса — снижение лактата при одновременном увеличении активности ЛДГ (табл. 2). В цитоплазме исследуемых тканей наблюдалось повышение следующих показателей: в семенных пузырьках, головке и хвосте эпидидимиса — молочной кислоты, в семенных пузырьках и хвосте придатка яичка — HIF1α, активность ЛДГ только в хвосте эпидидимиса.

 

Таблица 2. Влияние аргинина на изменение биохимических показателей семенных пузырьков, головки и хвоста эпидидимиса крыс при хронической нормобарической гипоксии (n = 8; Me [Q1; Q3])

Показатель	Группа 3 (NaCl)	Группа 4 (L-Арг)	Группа 5 (ХНГ + L-Арг)
СЕМЕННЫЕ ПУЗЫРЬКИ
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка	792 [703; 911]	650 [578; 713] р3–4 = 0,03	734 [601; 1007] р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,43
HIF1α МФ, нг/мг белка	23,6 [20, 4; 30, 4]	13 [9, 6; 17, 7] р3–4 = 0,01	10,5 [8, 9; 13] р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,16
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	3,1 [2, 9; 4, 5]	7,2 [5; 8, 2] р3–4 = 0,01	5,3 [4, 7; 6, 2] р2–5 = 0,007 р4–5 = 0,43
Сукцинат, мкмоль/мг белка	985 [847; 1376]	594 [533; 655] р3–4 = 0,005	644 [624; 690] р2–5 = 0,49 р4–5 = 0,23
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,25 [0, 12; 0, 36]	0,26 [0, 15; 0, 36] р3-4 = 0,96	0,52 [0, 33; 0, 64] р2-5 = 0,13 р4-5 = 0,04
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	4,76 [3, 96; 7, 76]	2,59 [2, 27; 2, 99] р3–4 = 0,007	4,8 [4, 38; 5, 69] р2–5 = 0,007 р4–5 = 0,005
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	0,94 [0, 61; 1, 86]	2,76 [1, 6; 3, 66] р3–4 = 0,03	2,49 [1, 99; 3, 07] р2–5 = 0,052 р4–5 = 0,56
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	1440 [741; 2373]	565 [384; 783] р3–4 = 0,04	625 [426; 1040] р2–5 = 0,19 р4–5 = 1,0
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	4071 [2823; 5028]	3542 [1909; 5909] р3–4 = 0,75	3448 [2935; 3970] р2–5 = 0,014 р4–5 = 0,96
ЦО, у.е./мг белка	0,96 [0, 66; 1, 69]	0,27 [0, 23; 0, 32] р3–4 = 0,0009	0,46 [0, 35; 0, 66] р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,07
ГОЛОВКА ЭПИДИДИМИСА
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка	999 [876; 1225]	651 [609; 701] р3–4 = 0,001	1043 [910; 1576] р2–5 = 0,13 р4–5 = 0,0009
HIF1α МФ, нг/мг белка	12,4 [10, 6; 15, 5]	5,9 [5, 6; 7, 4] р3–4 = 0,002	16,2 [15, 5; 17, 1] р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,0009
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	3,2 [2, 4; 3, 3]	2,7 [2, 3; 3, 1] р3–4 = 0,32	3,8 [3, 5; 4, 8] р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,007
Сукцинат, мкмоль/мг белка	1140 [928; 1456]	539 [448; 599] р3–4 = 0,0009	1295 [1276; 1459] р2–5 = 0,0009 р4–5 = 0,0009
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,43 [0, 23; 0, 55]	0,48 [0, 38; 0, 58] р3–4 = 0,43	0,36 [0, 33; 0, 40] р2–5 = 0,1 Р4–5 = 0,56
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	4,47 [3, 84; 5, 92]	2,72 [1, 71; 5, 36] р3–4 = 0,16	12,1 [10, 86; 13, 4] р2–5 = 0,0009 р4–5 = 0,003
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	1,4 [0, 96; 1, 83]	2,61 [2, 41; 2, 79] р3–4 = 0,001	2,75 [2, 42; 3, 86] р2–5 = 0,43 р4–5 = 0,03
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	1175 [720; 1839]	1741 [1438; 2627] р3–4 = 0,27	2466 [1328; 3284] р2–5 = 0,004 р4-5 = 0,71
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	3765 [3294; 4511]	4607 [4010; 5515] р3–4 = 0,23	4088 [3247; 4775] р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,27
ЦО, у.е./мг белка	0,9 [0, 81; 1, 05]	0,29 [0, 21; 0, 34] р3–4 = 0,00002	0,70 [0, 47; 1, 19] р2–5 = 0,04 р4–5 = 0,005
ХВОСТ ЭПИДИДИМИСА
Метаболиты NO (II), нмоль/мг белка	1239 [881; 1568]	520 [476; 568] р3–4 = 0,002	712 [665; 846] р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,01
HIF1α МФ, нг/мг белка	22 [17; 24, 3]	8,8 [7, 8; 10, 5] р3–4 = 0,002	12,3 [9, 8; 14, 3] р2–5 = 0,31 р4–5 = 0,08
HIF1α ЦФ, нг/мг белка	3,1 [2, 7; 3, 9]	4,1 [3, 9; 4, 7] р3–4 = 0,02	6,2 [4, 7; 6, 4] р2–5 = 0,13 р4–5 = 0,1
Сукцинат, мкмоль/мг белка	1606 [1211; 2006]	794 [682; 867] р3–4 = 0,0009	1161 [895; 1491] р2–5 = 0,23 р4–5 = 0,007
СДГ, нмоль сукцината/мг белка	0,24 [0, 15; 0, 5]	0,19 [0, 11; 0, 22] р3–4 = 0,31	0,3 [0, 26; 0, 35] р2–5 = 0,71 р4–5 = 0,013
Молочная кислота МФ, мкмоль/мг белка	6,76 [4, 96; 8, 77]	3,07 [2, 69; 5, 1] р3–4 = 0,03	7,63 [5, 42; 10, 09] р2–5 = 0,16 р4–5 = 0,03
Молочная кислота ЦФ, мкмоль/мг белка	1,12 [0, 77; 1, 49]	3,95 [1, 95; 4, 63] р3–4 = 0,018	2,35 [1, 85; 2, 99] р2–5 = 0,014 р4–5 = 0,43
ЛДГ МФ, у.е./мг белка	1685 [902; 2556]	3456 [2993; 3895] р3–4 = 0,046	3475 [2331; 5748] р2–5 = 0,79 р4–5 = 0,79
ЛДГ ЦФ, у.е./мг белка	5289 [4088; 5845]	8375[7407; 10510] р3–4 = 0,005	6507 [4636; 8196] р2–5 = 0,08 р4–5 = 0,16
ЦО, у.е./мг белка	1,04 [0, 84; 1, 33]	0,26 [0, 14; 0, 37] р3–4 = 0,003	0,16 [0, 1; 0, 22] р2–5 = 0,001 р4–5 = 0,27

Примечания: L-Арг — L-аргинин; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; МФ — митохондриальная фракция; СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ХНГ — хроническая нормобарическая гипоксия; ЦО — цитохромоксидаза; ЦФ — цитоплазматическая фракция

 

При коррекции гипоксии с помощью экзогенного L-арг наблюдалось нарастание концентрации лактата в митохондриях семенных пузырьков по сравнению с ХНГ, а в цитоплазме — количества HIF1α и активности ЛДГ; в митохондриях головки эпидидимиса — увеличение уровня сукцината, молочной кислоты и активности ЛДГ; в митохондриях хвоста эпидидимиса — снижение активности ЦО, а в цитоплазме — возрастание содержания лактата и активности ЛДГ (табл. 1, 2). Сочетанное воздействие факторов (ХНГ + L-Арг) по сравнению с действием только L-Арг привело к повышению содержания лактата в митохондриях семенных пузырьков; метаболитов NO и сукцината — в обеих частях придатка яичка; количества HIF1α (МФ и ЦФ), молочной кислоты и активности ЦО — в головке эпидидимиса; активности СДГ — в митохондриях хвоста эпидидимиса.

ОБСУЖДЕНИЕ

Некоторые изменения, наблюдаемые в условиях получения экзогенного L-Арг, имеют сходную тенденцию с моделью ХНГ. В частности, это прослеживается в накоплении молочной кислоты [26], HIF1α [27] и в активности ЦО [25]. Повышение количества HIF1α, вызванное влиянием различных веществ даже в условиях нормального напряжения кислорода, характеризуют как состояние псевдогипоксии. Транскрипционная активность HIF1α способствует дальнейшим преобразованиям метаболизма, что объясняет характер изменений в концентрации лактата и активности ЦО. Другими словами, можно сказать, что L-Арг проявляет гипоксия-подобный (англ.: hypoxia-like) эффект.

Влияние L-арг на стабилизацию HIF1α объясняет схожесть метаболического ответа в этой экспериментальной модели с ответом при ХНГ. Однако при этом наблюдается тканеспецифичность реакции. Так, в семенных пузырьках L-Арг способствовал почти полному соответствию изменений, характерных для гипоксии (увеличение концентрации лактата, количества HIF1α и активности ЛДГ в цитоплазме, снижение активности ЦО), при этом в эксперименте с экзогенным получением животными L-Арг на фоне ХНГ накопление HIF1α в цитоплазме происходило эффективнее, чем в условиях только гипоксии. Возможно, сочетанное влияние этих факторов произвело некоторый кумулятивный эффект, что и послужило причиной повышения активности ЛДГ в цитоплазме клеток семенных пузырьков относительно состояния гипоксии и накопления лактата относительно как ХНГ, так и L-Арг в митохондриях. Предположительно в основе этих изменений лежит опосредованная HIF активация экспрессии ЛДГ. Наблюдаемое снижение содержания HIF1α в МФ в условиях гипоксии или при получении L-Арг можно связать с повышением его транскрипционной активности, вызванной систематическим воздействием этих факторов. Мы предполагаем, что за время эксперимента удалось добиться стабильного транскрипционного ответа, благодаря чему необходимость острого реагирования путем непосредственного связывания HIF1α с белками внешней мембраны митохондрий становится менее значимой.

Отсутствие статистически значимых изменений в активности СДГ, но при этом истощение пула сукцината, как и накопление лактата, говорит о переключении работы ЭТЦ с основного поставщика протонов в условиях нормоксии комплекса I на работу комплекса II. Таким образом, клетка пытается компенсировать неэффективное в обсуждаемых условиях окисление кофермента НАДН, восстанавливая пируват в лактат, для поддержания работы гликолиза и цитратного цикла, а работа ЭТЦ поддерживается за счет окисления в основном сукцината. При этом получение L-Арг не повлияло на активность АТФ-синтазы.

В эпидидимисе эффект назначения экзогенного L-Арг оказался схожим с таковым в семенных пузырьках. Отличительной особенностью явилось накопление лактата в цитоплазме тканей и повышение активности ЛДГ в хвосте эпидидимиса. Ранее в наших исследованиях мы описывали различия между функциональными участками придатка яичка в накоплении лактата и HIF1α [25–27] в условиях ХНГ. Назначение экзогенного L-Арг демонстрирует противоположные эффекты: повышение активности ЛДГ в хвосте при отсутствии изменений в головке придатка яичка. Интересно, что у животных в группе ХНГ + L-Арг наблюдалось повышение активности ЦО в головке эпидидимиса, но в хвосте отмечалось самое низкое значение активности фермента. Повышение активности СДГ и накопление сукцината при этом могут свидетельствовать о перестройке работы ЭТЦ: в отсутствии эффективного транспорта электронов через цитохромоксидазу конечным акцептором может являться фумарат, что и приводит к увеличению концентрации сукцината, а также усилению его сигнальной функции и снижению образования АФК. Известно, что даже в условиях нормоксии ткани по-разному насыщены кислородом и хвост эпидидимиса отличается пониженным его содержанием, а также более активной экспрессией HIF1α [24], в связи с чем можно сделать предположение о влиянии экзогенного аргинина при гипоксии на клетки хвоста эпидидимиса, как мощного стимула для сигналинга и переключения метаболизма на получение энергии путем гликолиза.

Понижение концентрации метаболитов оксида азота (II) при гипоксии можно объяснить возможным замедлением под влиянием HIF1 экспрессии ASS, отвечающей за биосинтез аргинина в большинстве тканей организма [2], следствием чего становится снижение биодоступности этой аминокислоты как субстрата для синтеза NO. Курсовое назначение экзогенного L-Арг в дозе 500 мг/кг массы тела не привело к ожидаемому повышению NO в тканях на момент завершения эксперимента. Объяснить данный феномен можно, с одной стороны, гипоксия-подобным эффектом L-Арг, а с другой стороны, активацией аргиназы с помощью нитрозилирования [4], что в совокупности способствовало снижению уровня метаболитов NO. Возможно, такой механизм лежит в основе адаптации тканей и защите их от избытка оксида азота (II).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Парентеральное получение животными L-Аргинина вызывает в клетках семенных пузырьков и хвоста эпидидимиса развитие псевдогипоксии, что частично усиливает эффекты, наблюдаемые при хронической нормобарической гипоксии. В головке эпидидимиса эта закономерность выражена меньше. Являясь предшественником оксида азота (II) L-Аргинин способствует понижению активности цитохромоксидазы во всех изучаемых тканях, увеличению роли гликолиза в эпидидимисе, о чем свидетельствует повышение активности лактатдегидрогеназы и накопление лактата.

Особенно выражены изменения в каудальном отделе придатка яичка, где также наблюдается реверсия работы сукцинатдегидрогеназы, что обеспечивает клетку лучшей защитой в условиях хронической нормобарической гипоксии. Таким образом, L-Аргинин проявляет гипоксия-подобный эффект посредством регуляции активности гипоксией индуцируемого фактора и ферментов, участвующих в энергетическом обмене, благодаря чему экзогенное назначение этой аминокислоты позволяет контролировать процессы при адаптации к дефициту кислорода.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Марсянова Ю. А. — проведение основных этапов исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка, анализ и интерпретация данных, написание текста статьи; Звягина В. И. — разработка концепции и дизайна исследования, оценка интерпретации данных, проверка и редактирование статьи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Об авторах

Юлия Александровна Марсянова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: yuliyamarsyanova@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-4948-4504
SPIN-код: 4075-3169
Россия, Рязань

Валентина Ивановна Звягина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: vizvyagina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789
SPIN-код: 7553-8641

к.б.н., доцент

Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы