Протективные эффекты L-аргинина на митохондрии эпидидимиса крыс при гипергомоцистеинемии, вызванной длительной метиониновой нагрузкой

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК ― активные формы кислорода

ГГЦ ― гипергомоцистеинемия

е.о.п. ― единица оптической плотности

ЛДГ ― лактатдегидрогеназа

ОМБ ― окислительная модификация белков

ОС ― окислительный стресс

РАП ОМБ ― резервно-адаптационный потенциал окислительной модификации белков

СДГ ― сукцинатдегидрогеназа

СОД ― супероксиддисмутаза

ЭДТА ― этилендиаминтетраацетат

ЭКО ― экстракорпоральное оплодотворение

ADMA ― asymmetric dimethylarginine (асимметричный диметиларгинин)

АGXT-2 ― Alanine-Glyoxylate Aminotransferase 2 (аланин-глиоксилат аминотрансфераза 2)

BCKDC ― branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex (дегидрогеназный комплекс разветвлённых α-кетокислот)

CrAT II ― carnitine acyltransferase II (карнитинацилтрансфераза II)

DDAH ― dimethylarginine dimethylaminohydrolase (диметиларгининдиметиламиногидролаза)

NO ― nitric oxide (II) (оксид азота (II))

NO_x ― total metabolites NO (II) (суммарные метаболиты NO (II))

NOS –nitric oxide synthase (синтаза оксида азота)

NAD+ ― nicotinamide adenine dinucleotide oxidized, (никотинамидадениндинуклеотид окисленный)

NADH ― nicotinamide adenine dinucleotide reduced (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный)

PRMTs ― protein arginine methyltransferases (протеин-аргининметилтрансферазы)

ROS ― reactive oxygen species (активные формы кислорода)

SAH ― S-adenosylhomocysteine (S-аденозилгомоцистеин)

SAM ― S- adenosylmethionine (S-аденозилметионин)

SDMA ― symmetric dimethylarginine (симметричный диметиларгинин)

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время рост распространенности нарушений фертильности становится одной из глобальных проблем здравоохранения [1]. По данным ряда авторов, пик фиксируемых нарушений фертильности приходится на наиболее работоспособный возраст 35–44 года ― в 17,7% случаев у женщин и в 14,9% у мужчин [2]. При этом доля «мужского фактора» в 21,1 ± 2,8% случаев является ключевой причиной невозможности зачать ребенка [3].

Для диагностики фертильности мужчин принято использовать количественные и морфологические критерии сперматозоидов, которые, однако, не позволяют точно предсказать вероятность зачатия у пациентов с идиопатическим бесплодием и обладают невысокой точностью для предсказания результатов процедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [3]. В этой связи, по мнению R. J. Aitken, et al., важная роль в оценке функции сперматозоидов принадлежит исследованию маркеров окислительного стресса (ОС) и антиоксидантной защиты [3, 4].

Среди возможных причин ОС, которые могут лежать в основе окислительного повреждения в клетках мужской репродуктивной системы, важную роль играет митохондриальная дисфункция, связанная с избыточной генерацией митохондриями активных форм кислорода (АФК) и нарушением антиоксидантной защиты, что, в свою очередь, вызывает дисбаланс процессов редокс-регуляции клеточного гомеостаза [5–7].

Необходимо отметить, что антиоксиданты, такие как L-аргинин, L-карнитин, каротиноиды, витамины Е, С и В₉, коэнзим Q, цистеин и ацетил-цистеин, в настоящее время рассматриваются как потенциальные терапевтические агенты для коррекции нарушений фертильности. Вместе с тем результаты их применения до настоящего времени остаются противоречивыми [7, 8]. В связи с этим представляется перспективным подход, учитывающий гетерогенность причин ОС, что отражает потребность в выделении биомаркеров для персонализации терапии нарушений фертильности [9].

Установлено, что L-аргинин характеризуется выраженной антиоксидантной активностью, которая проявляется даже в условиях первичной митохондриальной дисфункции [10], и способен снижать выраженность дефицита синтеза оксида азота II (NO) и ОС, обусловленного гомоцистеином [11], но механизм этого процесса до конца не изучен [12].

Сообщается, что эпидидимальная дисфункция, связанная с нарушением формирования микроокружения для сперматозоидов, может являться существенным фактором мужского бесплодия. Причем каждый сегмент эпидидимиса вносит особый вклад в микроокружение просвета, но тем не менее молекулярные механизмы, участвующие в приобретении подвижности и в способности к оплодотворению, остаются в значительной степени малоизученными [13]. Анализ содержания карнитина, маркеров ОС и активности ферментов митохондрий при экспериментальной гипергомоцистеинемии изолированно и совместно с L-аргинином позволит оценить тканеспецифичность отделов эпидидимиса в ответ на моделируемые патологические состояния [13, 14].

Цель — изучить влияние L-аргинина на показатели энергетического обмена, уровень метаболитов NO, окислительной модификации белков и баланс фракций карнитина в митохондриях головки и хвоста эпидидимиса крыс в условиях гипергомоцистеинемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на крысах-самцах линии Wistar. Эксперименты с животными проведены в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и положениями Биоэтической комиссии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол № 16 от 06.11.2018). Животные содержались в стандартных условиях вивария, для кормления они получали сухой корм «Чара» (Ассортимент-Агро, Россия), содержащий 0,7% метионина-цистина в пересчёте на сухое вещество, все витамины группы B, в том числе B₆ ― 28 мг/кг, B₉ ― 64 мг/кг, B₁₂ ― 0,13 мг/кг.

Экспериментальные животные были поделены на 5 групп:

- 1 группа (ГГЦ, n = 8) ― модель гипергомоцистеинемии: крысы с тяжёлой гипергомоцистеинемией (> 100 мкмоль/л), для этого животным в течение 21 дня внутрижелудочно (через зонд) вводили 25% суспензию метионина в дозе 1,5 г метионина (Sigma-Aldrich, США) на 1 кг массы тела 2 раза в сутки; дополнительно вместо питьевой воды крысы получали 1% водный раствор метионина при свободном доступе к поилкам [15];

- 2 группа (Твин, n = 8) ― контроль модели гипергомоцистеинемии: крысы по аналогичной схеме получали суспензионную основу, в состав которой входили вода, твин-80 (ЗАО Вектон, Россия) и крахмал (ЗАО Вектон, Россия). Поилки для этих животных наполняли обычной питьевой водой;

- 3 группа (ГГЦ + Арг, n = 8) ― модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина 3 группы: животным на фоне гипергомоцистеинемии (аналогично группе 1) с 11 дня по 21 день осуществляли внутрижелудочное введение раствора L-аргинина (Sigma, США) на 0,9% NaCl в дозе 500 мг/кг ежедневно в промежутке между введением суспензии метионина [16];

- 4 группа (L-аргинин, n = 8) ― введение L-аргинина здоровым животным: назначали L-аргинин в дозе 500 мг/кг ежедневно в течение 10 дней;

- 5 группа ― контроль для группы 4 (контроль, n = 8): животные получали в течение того же времени, что и группа 4, внутрижелудочно тот же объем питьевой воды вместо раствора L-аргинина.

Выведение животных из эксперимента осуществлялось утром до приема пищи. Под эфирным рауш-наркозом при сохранённом дыхании и сердцебиении путём обескровливания пересечением брюшной аорты. После этого извлекали эпидидимис, промывали его в среде, содержащей 0,25 М сахарозу (Чехия, перефасовано ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), 0,001 М ЭДТА (ООО Компания Хеликон, Россия) и 0,05 М трис-буфер (рН 7,4) (ЗАО Вектон, Россия), отделяли головку и хвост эпидидимиса, которые использовали для дальнейших исследований [13]. Для гомогенизации использовали гомогенизатор PotterS (Sartorius, Германия).

Гомогенаты центрифугировали 10 минут при 800 g для осаждения ядер и не разрушенных клеток. Надосадочную жидкость центрифугировали 15 минут при 14000 g на рефрижераторной центрифуге K24D (Германская Демократическая Республика) [17]. Осадок содержащий митохондрии ресуспендировали в среде выделения в отношении 1:9. К части суспензии митохондрий добавляли тритон X-100 (ООО Компания Хеликон, Россия) в конечной концентрации 0,02% для разрушения мембран. Все описанные выше процедуры проводили при температуре не выше 4°С. В дальнейшем для анализа использовали:

- сыворотку крови, в которой определяли концентрацию общего гомоцистеина и метаболитов NO (NO_x), т. е. суммарного уровня нитрита и нитрата;

- митохондриальную фракцию с разрушенными мембранами, где оценивали окислительную модификацию белков (ОМБ), концентрацию NO_x, лактата, фракций карнитина, активность ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) и супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1);

- митохондриальную фракцию с не разрушенными мембранами, в которой определяли активность Н⁺-АТФазы (КФ 3.6.3.14) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.5.1).

Концентрацию общего гомоцистеина определяли иммуноферментным анализом с помощью коммерческого набора (Axis Shield, Великобритания). Принцип метода основан на восстановлении гомоцистеина, связанного с белками, в свободный гомоцистеин, который энзиматически превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин с его последующим иммуноферментным анализом.

Содержание общего белка определяли по методу Лоури с помощью набора реактивов (Экосервис, Россия), проводили с использованием фотоколориметра КФК-3-01 ЗОМЗ (Россия).

Фотоколориметрическим методом на анализаторе Stat Fax 3200 (Awareness Technology, США) оценивали суммарный уровень метаболитов NO (NO_x) с использованием реактива Грисса (ООО НеваРеактив, Россия) и хлорида ванадия (III) (AcrosOrganics, США) для определения суммы нитритов и нитратов [18].

Концентрацию молочной кислоты измеряли колориметрически лактатоксидазным методом с использованием набора (Diasys, Федеративная Республика Германия) на анализаторе Stat Fax 1900+ (Awareness Technology, США).

Активность СДГ оценивали спектрофотометрическим методом по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия в ферроцианид калия на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). Активность фермента пропорциональна количеству восстановленного ферроцианида [17].

Активность ЛДГ определяли по снижению концентрации NADH в реакции восстановления пирувата с помощью коммерческого набора (Diasys, Федеративная Республика Германия) на анализаторе Stat Fax 1900+ (Awareness Technology, США).

Активность Н⁺-АТФазы оценивалась по методу Боданского путем определения количества неорганического фосфата по образованию фосфомолибдата аммония, восстанавливаемого аскорбиновой кислотой в молибденовую синь, оптическая плотность которой прямо пропорциональна концентрации неорганического фосфата. Измерение проводили с использованием фотоколориметра КФК-3-01 ЗОМЗ (Россия) [19].

Общую активность митохондриальной СОД оценивали по торможению реакции аутоокисления кверцетина с использованием фотоколориметра КФК-3-01 ЗОМЗ (Россия) [20].

Анализ уровня ОМБ проводили на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) с последующим перерасчётом площади под кривой абсорбции света [21]. Для оценки ОМБ определяли уровень карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Количество карбонильных производных аминокислотных остатков в белках оценивали по площади под кривой, разбивая её на прямоугольные трапеции. Общее количество продуктов спонтанной окислительной модификации белков (СП ОМБ) выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.) на мг белка (е.о.п./ мг белка) [21]. Параллельно определению СП ОМБ проводили определение металл-катализируемого окисления (МК ОМБ) с помощью реакции Фентона, служившее показателем максимально возможного окислительного повреждения белковых молекул, которое принималось за 100%. Затем рассчитывали резервно-адаптационный потенциал окислительного повреждения митохондриальных белков (РАП ОМБ), который выражали в % как отношение СП ОМБ/МК ОМБ. Чем ниже доля продуктов спонтанного окисления (СП ОМБ), тем выше резервно-адаптационный потенциал (РАП ОМБ) [21].

Концентрацию карнитина в митохондриях тканей эпидидимиса крыс определяли на анализаторе StatFax 3200 (Awareness Technology, США) по методу Wan L. и Hubbard R. W. (1998), основанному на образовании свободного KoASH, реагирующего неэнзиматически с 5,5-дитиобис-2-нитробензоатом (англ.: 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoate, DTNB) с образованием окрашенного 5-тио-2-нитробензоата, интенсивность окраски которого измеряли спектрофотометрически при λ = 410 нм [22].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США). Построение графиков осуществляли, используя GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, США). Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с использованием критерия Шапиро–Уилка. Распределение отличалось от нормального, в связи с чем для выявления различий между независимыми группами использовали критерий Краскела–Уоллиса и критерий Манна–Уитни с 2-х этапной поправкой для множественных сравнений Бенджамини–Криегера–Иекутелли или критерий Манна–Уитни при сравнении 2 групп. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Назначение в пищевой рацион крысам-самцам метионина в течение 21 дня приводило к повышению концентрации гомоцистеина в сыворотке крови более 100 мкмоль/л, что соответствовало тяжелой форме ГГЦ. Развившаяся ГГЦ сопровождалась статистически значимым снижением NO_x в сыворотке крови, что отражало индуцированный в модели дефицит синтеза оксида азота эндотелием сосудистой стенки Также было обнаружено значительное снижение концентрации общего и свободного карнитина в сыворотке крови (рис. 1).

 

Рис. 1. Концентрация NO_x, гомоцистеина, общего и свободного карнитина в сыворотке крови исследуемых групп животных, Me [Q1; Q3].

Примечание: ГГЦ ― модель гипергомоцистеинемии, группа 1; Твин ― группа 2; модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина ― группа 3. Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

Оценка уровня NO_x в митохондриях гомогената головки эпидидимиса позволила выявить снижение их концентрации по сравнению с показателем группы, получавшей только суспензионную основу, и подтвердить системный характер дефицита синтеза NO в условиях тяжелой формы гипергомоцистеинемии (рис. 2).

 

Рис. 2. Сравнение уровней метаболитов NO (II) и лактата митохондрий в исследуемых моделях, Me [Q1; Q3].

Примечание: ГГЦ ― модель гипергомоцистеинемии, группа 1; Твин ― группа 2; модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина ― группа 3. Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

В соответствии с рисунком 3 увеличение концентрации гомоцистеина сопровождалось выраженным усилением окислительной модификации белков как в головке, так и хвосте придатка яичка и значительным подъемом активности СОД на 220% (р = 0,03) и 240% (р = 0,04) соответственно относительно группы контроля. Все это могло свидетельствовать о возникновении ОС в тканях придатка яичка в условиях гипергомоцистеинемии (рис. 3).

 

Рис. 3. Сравнение исследуемых показателей окислительного стресса митохондрий в исследуемых моделях, Me [Q1; Q3].

Примечание: ГГЦ ― модель гипергомоцистеинемии, группа 1; Твин ― группа 2; модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина ― группа 3. Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

У животных наблюдалось также уменьшение РАП окислительной модификации только в головке эпидидимиса, что, по-видимому, указывает на более низкую устойчивость головки придатка яичка крыс к окислительному повреждению.

Наряду со значительным увеличением показателей ОС отмечалось и снижение активности исследуемых ферментов, вовлечённых в биоэнергетические процессы митохондрий (СДГ, Н⁺-АТФазы), а также увеличением концентрации митохондриального лактата и статистически значимым падением активности ЛДГ в головке придатка яичка (рис. 2, 4).

 

Рис. 4. Сравнение активностей ферментов митохондрий в исследуемых моделях, Me [Q1; Q3].

Примечание: ГГЦ ― модель гипергомоцистеинемии, группа 1; Твин ― группа 2; модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина ― группа 3. Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

Обнаруженные изменения сопровождались значительным уменьшением концентрации общего карнитина в митохондриях, выделенных из гомогената тканей эпидидимиса, на 270% (р < 0,001 ) в головке эпидидимиса и на 300% (р < 0,001) в хвосте придатка яичка (рис. 5).

 

Рис. 5. Сравнение содержания L-карнитина в митохондриях гомогенатов головки и хвоста эпидидимиса в исследуемых моделях, Me [Q1; Q3].

Примечание: ГГЦ ― модель гипергомоцистеинемии, группа 1; Твин ― группа 2; модель гипергомоцистеинемии на фоне назначения L-аргинина ― группа 3. Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

Следует отметить, что между уровнем сывороточного гомоцистеина и концентрацией общего карнитина в митохондриальной фракции нами обнаружена статистически значимая сильная обратная корреляционная связь в головке эпидидимиса (r = -0,74, p = 0,001); средней силы обратная корреляционная связь в хвосте эпидидимиса (r = -0,61, p = 0,012).

Пероральное введение L-аргинина крысам в дозе 500 мг/кг на фоне моделирования гипергомоцистеинемии приводило к менее выраженному повышению концентрации сывороточного гомоцистеина, а также к увеличению уровня метаболитов оксида азота II в сыворотке крови на 170% (р = 0,006) по сравнению с животными, которым вводили суспензионную основу, и на 80% (р < 0,001) относительно уровня контроля; в митохондриях головки эпидидимиса ― на 82,8% (р = 0,006) относительно серии с введением метионина и на 31% (р < 0,001) относительно контрольных значений. В хвосте придатка яичка статистически значимых изменений содержания метаболитов NO не выявлено.

При моделировании гипергомоцистеинемии на фоне введения L-аргинина также отмечалось статистически значимое снижение общей площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков в обеих исследуемых фракциях эпидидимиса. Также при сочетанном назначении L-аргинина и метионина не происходило значительного снижения резервно-адаптационного потенциала, как в серии с гипергомоцистеинемией (рис. 3).

Наряду с этим при назначении L-аргинина животным на фоне моделирования гипергомоцистеинемии активность СДГ и Н⁺-АТФазы не отличалась от серии животных с тяжелой формой ГГЦ и была ниже уровня контрольных значений.

Для более объективной оценки роли L-аргинина на ткани эпидидимиса крыс-самцов были исследованы аналогичные биохимические показатели в условиях отсутствия окислительного стресса, вызванного избыточной нагрузкой метионина, для этого использовали серию животных с назначением L-аргинина в течение того же времени и той же дозы, что и здоровым животным (рис. 6).

 

Рис. 6. Уровни метаболитов NO (II) и карнитина в сыворотке крови интактных животных и на фоне введения L-аргинина, Me [Q1; Q3].

Примечание: L-аргинин ― группа животных 4, Контроль ― группа животных 5 (контроль для группы 4). Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

Было обнаружено статистически значимое увеличение концентрации метаболитов NO в сыворотке крови (на 150%, р < 0,001), митохондриях хвоста (на 28,6%, р = 0,03) и головки (на 25,75%, р = 0,003) эпидидимиса.

Отмечалось повышение уровня общего и свободного карнитина в хвосте придатка яичка на 31,3% (р = 0,04) и 37,7% (р = 0,01) соответственно. Также имело место снижение активности СОД в головке на 20,0% (р = 0,03) и хвосте на 17,8% (р = 0,02). Другие исследуемые биохимические показатели статистически значимо не изменялись (рис. 7).

 

Рис. 7. Изменения исследуемых показателей митохондрий головки и хвоста эпидидимиса на фоне назначения L-аргинина, Me [Q1; Q3].

Примечание: L-аргинин ― группа животных 4, Контроль ― группа животных 5 (контроль для группы 4). Значения p с точностью до тысячных долей приведены над графиками.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Обнаруженные в серии сочетанного назначения L-аргинина и метионина изменения уровней ОМБ в совокупности со статистически значимым приростом активности СОД как в хвосте, так и головке позволяют предположить протективный эффект L-аргинина, связанный со снижением интенсивности окислительного повреждения белков эпидидимиса у крыс.

Была выявлена различная реакция со стороны митохондрий тканей эпидидимиса головки и хвоста на фоне назначения L-аргинина. Так, в хвосте эпидидимиса наблюдалось повышение уровня активности ЛДГ и снижение концентрации лактата относительно серии животных с ГГЦ, при этом в головке наблюдалось увеличение содержания общего карнитина преимущественно за счет свободной фракции (рис. 2, 4).

В отличие от серии с введением L-аргинина здоровым животным, в условиях гипергомоцистеинемии L-аргинин статистически значимо не изменял уровень общего карнитина в митохондриях головки и хвоста эпидидимиса за счет того, что карнитин, возможно, используется для выведения метаболитов метионина в виде короткоцепочечных эфиров карнитина [23–25]. В этом случае удаление избытка метионина будет предотвращать развитие осложнений, связанных с нарушением его метаболизма, однако физиологическая концентрация карнитина недостаточна для полной элиминации всего поступающего метионина.

При длительном введении метионина (донора метильных групп) создаются условия усиленного образования диметиларгининов (ADMA, SDMA). Эти метилированные производные аргинина, с одной стороны, способны ингибировать клеточное поглощение L-аргинина при участии катионных транспортеров (CAT) [26], за счет чего, предположительно, концентрация метаболитов NO в сыворотке крови возрастает более выражено, чем в митохондриях эпидидимиса. С другой стороны, диметиларгинины, в первую очередь ADMA, являются ингибитором NO-синтазы (КФ 1.14.13), при разобщении которой интенсифицируется процесс образования АФК [27, 28]. В связи с этим мы, вероятно, наблюдаем более значительное повышение активности митохондриальной СОД, фермента антиоксидантной защиты, чем при введении только метионина, также АФК способны стимулировать активность аргининметилтрансфераз (КФ 2.1.1.321) и вновь усиливать синтез диметиларгининов [29, 30].

Из литературных источников известно также, что гомоцистеин ингибирует активность фермента диметиларгининдиметиламиногидролазы (DDAH, КФ 3.5.3.18), который метаболизирует ADMA до неактивных продуктов, вызывая тем самым накопление ADMA и ингибирование синтеза оксида азота [31, 32].

Мы можем предположить, что снижение уровня гомоцистеина и уменьшение степени гипергомоцистеинемии происходило за счет конкурентного транспорта аргинина и метионина. Так, J. W. Robinson, et al. выявили, что поглощение L-метионина сильно ингибируется L-аргинином и цитруллином [33, 34]. Таким образом, уменьшается ингибирующее действие ADMA на NO-синтазу вследствие элиминации ADMA при реактивации DDAH.

На основе результатов исследования и обзора литературы нами предлагается схема, обобщающая представления о механизмах снижения уровня гомоцистеина на фоне назначения L-аргинина (рис. 8).

 

Рис. 8. Схема возможных механизмов снижения уровня гомоцистеина на фоне назначения L-аргинина.

Примечание: АДМА ― асимметричный диметиларгинин, СДМА ― симметричный диметиларгинин, SAM (S-adenosylmethionine) ― S-аденозилметионин, SAH (S-adenosylhomocysteine) ― S-аденозилгомоцистеин, Homocysteine ― гомоцистеин, PRMTs (Protein arginine methyltransferases) ― протеин-аргининметилтрансферазы, АGXT-2 (Alanine-Glyoxylate Aminotransferase 2) ― аланин-глиоксилат аминотрансфераза 2, КАТ II ― карнитинацилтрансфераза II, DDAH (Dimethylarginine dimethylaminohydrolase) ― диметиларгининдиметиламиногидролаза, NOS (nitric oxide synthase) ― синтаза оксида азота. НАД⁺ (Никотинамидадениндинуклеотид) окисленный; НАДН^- (Никотинамидадениндинуклеотид) ― восстановленный; АФК ― активные формы кислорода, NO ― оксид азота (II). NOS (Nitric Oxide Synthase) ― синтаза оксида азота. Красные стрелки указывают на процессы, связанные с повышением уровня гомоцистеина. Зеленые стрелки указывают на возможные механизмы снижения уровня гомоцистеина.

 

Интересен и тот факт, что при назначении L-аргинина крысам группы 4 отмечено снижение активности митохондриальной СОД в эпидидимисе самцов крыс. При сочетанном же введении L-аргинина и метионина имело место выраженное статистически значимое увеличение активности данного фермента, а определение зависимости показателей метаболитов NO и активности СОД в митохондриальной фракции показало наличие прямых, умеренных статистически значимых корреляционных связей между данными показателями в исследуемых отделах эпидидимиса:

- головка эпидидимиса: r = 0,46; р = 0,023;

- хвост эпидидимиса: r = 0,46; р = 0,018.

Хотя L-аргинин обладает прямым антиоксидантным действием [35], не исключено, что в данном случае его антиоксидантное свойство связано с увеличением продукции NO и его последующим участием в инактивации свободных радикалов. Такое антиоксидантное действие NO может быть связано с формированием, в том числе в митохондриях, динитрозильных комплексов железа [36]. Известно, что эти комплексы NO эффективно ингибируют процессы свободнорадикального окисления и окислительной модификации биополимеров [36, 37]. Вместе с тем при взаимодействии супероксидного радикала с NO продуцируется очень сильный окислитель пероксинитрит, который может опосредовать развитие окислительного стресса и приводить к усилению экспрессии CОД [30, 36, 37].

ВЫВОД

Таким образом, L-аргинин уменьшает степень выраженности гипергомоцистеинемии, вызванной длительным введением метионина в высокой дозе, вероятно, за счет ингибирования транспорта метионина в клетки и, как следствие, увеличения концентрации метаболитов оксида азота. В свою очередь, некоторые метаболиты NO, как и сам L-аргинин, проявляют протективные антиоксидантные свойства, препятствуя развитию окислительного стресса, вызванного гиперпродукцией гомоцистеина.

Каудальная часть эпидидимиса оказалась более устойчивой к окислительному повреждению, вызванному длительной метиониновой нагрузкой. Также продемонстрированы различия в адаптивном ответе при моделировании тяжелой гипергомоцистеинемии на фоне применения экзогенного L-аргинина.

В связи с вышеизложенным можно утверждать, что существуют убедительные предпосылки для изучения фармакотерапии нарушенных процессов фертильности у мужчин с включением в их состав L-аргинина, способного усиливать вазодилатирующие эффекты, блокировать процессы перекисного окисления липидов и избыточного образования АФК, а также восстанавливать активность ферментов митохондрий, корригируя развитие митохондриальной дисфункции, вызванной избыточной метиониновой нагрузкой.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Исследование проведено при поддержке гранта Президента РФ МК-4805.2022.3.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Звягина В. И. ― разработка концепции и дизайна, подготовка рукописи, анализ данных, проведение биохимических исследований, окончательное утверждение для публикации рукописи; Шумаев К. Б. ― разработка концепции, редактирование рукописи, проверка критически важного интеллектуального содержания; Бельских Э. С. ― анализ данных, подготовка рукописи, работа над рисунками; Урясьев О. М. ― разработка концепции, редактирование рукописи; Ахмедова C. Р. ― анализ данных, работа над рисунками; Марсянова Ю. А. ― подготовка рукописи, проведение биохимических исследований, воспроизведение экспериментальных моделей на крысах; Шитикова А. М. ― подготовка рукописи, проведение биохимических исследований, воспроизведение экспериментальных моделей на крысах; Сучкова О. Н. ― проведение биохимических исследований. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Об авторах

Валентина Ивановна Звягина

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: vizvyagina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789
SPIN-код: 7553-8641

к.б.н., доцент

Россия, Рязань

Константин Борисович Шумаев

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Email: tomorov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8835-5188
SPIN-код: 7765-3295

д.б.н.

Россия, Москва

Эдуард Сергеевич Бельских

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1803-0542
SPIN-код: 9350-9360

к.м.н.

Россия, Рязань

Олег Михайлович Урясьев

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: uryasev08@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8693-4696
SPIN-код: 7903-4609

д.м.н., профессор

Россия, Рязань

Сабина Руслановна Ахмедова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: danfeyt@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6437-8120
Россия, Рязань

Юлия Александровна Марсянова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: yuliyamarsyanova@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-4948-4504
SPIN-код: 4075-3169

 

Россия, Рязань

Анна Михайловна Шитикова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: anyakudlaeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4004-9058
SPIN-код: 3416-3961

к.б.н.

Россия, Рязань

Ольга Николаевна Сучкова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: suchkovaon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5227-7288
SPIN-код: 2282-3653
Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы