Functional  activity  of  p-glycoprotein  in  blood-brain barrier during experimental  par-kinson's  syndrome

Ivan V. Chernykh; Черных Иван Владимирович; Aleksey V. Shchulkin; Щулькин Алексей Владимирович; Pavel Yu. Mylnikov; Мыльников Павел Юрьевич; Maria V. Gatsanoga; Гацанога Мария Валериевна; Maria M. Gradinar; Градинарь Мария Михайловна; Anna S. Yesenina; Есенина Анна Сергеевна; Elena N. Yakusheva; Якушева Елена Николаевна

doi:10.23888/PAVLOVJ2019272150-159

Функциональная активность гликопротеина-p в гематоэнцефалическом барьере на фоне экспериментального паркинсонического синдрома

Авторы: Черных И.В.¹, Щулькин А.В.¹, Мыльников П.Ю.¹, Гацанога М.В.¹, Градинарь М.М.¹, Есенина А.С.¹, Якушева Е.Н.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Выпуск: Том 27, № 2 (2019)
Страницы: 150-159
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 28.06.2019
Статья опубликована: 02.07.2019
URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/14533
DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272150-159
ID: 14533

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Гликопротеин-P (Pgp, ABCB1-белок) – мембранный белок-транспортер с широкой субстратной специфичностью, который локализуется в гепатоцитах, энтероцитах, эпителии почечных канальцев, а также в тканевых барьерах, включая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Повышение активности Pgp в ГЭБ является одной из причин фармакорезистентности ряда заболеваний ЦНС.

Цель. Анализ функциональной активности Pgp в ГЭБ при экспериментальном паркинсоническом синдроме.

Материалы и методы. Работа выполнена на 90 крысах-самцах вистар, разделенных на 3 серии (n=30 в каждой). Первой серии (контроль) в течение 7 сут подкожно 1 раз в сут вводили подсолнечное масло, на 8-е сут оценивали активность Pgp в ГЭБ. Второй и третьей серии (контроль патологии) − в течение 7 и 28 сут вводили ротенон подкожно в дозе 2,5 мг/кг 1 раз в сут для моделирования синдрома паркинсонизма, а в конце эксперимента оценивали активность Pgp. Для подтверждения паркинсонического синдрома, помимо клинической картины, у животных методом иммуноферментного анализа определяли уровень дофамина в стриатуме и среднем мозге. Функциональную активность Pgp в ГЭБ оценивали по степени проникновения в кору головного мозга маркерного субстрата транспортера – фексофенадина после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг. Содержание фексофенадина в плазме крови и в коре больших полушарий оценивали по площади под кривой концентрация фексофенадина (в крови или ткани мозга) – время (AUC_0-_{t(плазма)}или AUC_0-_t(мозг)). Для оценки проницаемости ГЭБ рассчитывали соотношение AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)}.

Результаты. Введение ротенона приводило к развитию типичной картины паркинсонизма: ригидность мышц, гипокинезия, нестабильность походки. Отмечалось снижение уровня дофамина в стриатуме на 7 сут на 69,6% (p=0,095), на 28 сут – на 93,9% (p=0,008), в среднем мозге – на 72,7% (р=0,095) и 68,7% (р=0,032) соответственно. При внутривенном введении контрольным крысам фексофенадина AUC_0-_{t(плазма)}и AUC_0-_t(мозг)вещества составили соответственно 266,2 (246,4; 285,6) мкг/мл*мин и 5,9 (5,8; 6,6) мкг/г*мин, AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)}− 0,020 (0,019; 0,022). Введение животным ротенона в течение 7 дней приводило к возрастанию AUC_0-_t(мозг)фексофенадина в 2,02 раза (p=0,0163), AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)} − в 2,4 раза (p=0,0283). 28-дневное введение ротенона сопровождалось возрастанием AUC_0-_t(мозг)фексофенадина в 1,75 раза (p=0,0283), AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)} − в 2,27 раза (p=0,0163).

Вывод. Развитие паркинсонического синдрома, вызванного введением ротенона, снижает функциональную активность Pgp в ГЭБ, что подтверждается накоплением в головном мозге маркерного субстрата транспортера – фексофенадина.

Ключевые слова

болезнь Паркинсона, паркинсонический синдром, гликопротеин-Р, функциональная активность, гематоэнцефалический барьер

Полный текст

Болезнь Паркинсона – социально значимое хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, в основе патогенеза которого лежит гибель нейронов черной субстанции, среднего мозга и ряда других отделов головного мозга, основным нейромедиатором которых является дофамин. Для болезни характерен широкий спектр двигательных, нервно-психических и сенсорных расстройств [1]. Этиология болезни Паркинсона до конца не выяснена, однако среди ее причин доминируют генетические, конституциональные, возрастные и токсические факторы и механизмы. Среди химических агентов выделяют многие пестициды, инсектициды и другие нейротоксины, молекулярной основой действия которых являются изменения конформации молекулы пресинаптического белка α-си-нуклеина и способность существенно ускорять темп образования в нейронах α-синуклеиновых фибрилл и телец Леви [2].

Определенное значение в развитии паркинсонизма придается способности пестицидов нарушать функционирование митохондрий за счет ингибирования комплекса I дыхательной цепи, стимуляции окислительного стресса и реакций апоптоза, снижения активности убиквитин-протеасомной системы [3].

Для болезни Паркинсона и других видов хронической нейродегенерации (болезнь Альцгеймера, шизофрения, аутизм) характерна дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) с нарушением структуры плотных контактов и дизрегуляцией белков-транспортеров. При паркинсонизме проницаемость ГЭБ может возрастать в черном веществе среднего мозга и стриатуме, что связано с изменением экспрессии транспортных белков и белков межклеточных контактов, повреждением сосудов, накоплением активированной микроглии с высвобождением провоспалительных цитокинов и изменением экспрессии белков плотных контактов ZO-1 и окклюдина. Воспалительная гиперэкспрессия белков межклеточной адгезии облегчает миграцию иммунных клеток в область повреждения, увеличивая проницаемость ГЭБ [4].

Гликопротеин-Р (Pgp, ABCB1-белок) − это один из переносчиков, локализованный в эндотелиоцитах ГЭБ, представляющий собой эффлюксный АТФ-зависимый трансмембранный белок с молекулярной массой 170 кДа, препятствующий проникновению из крови в головной мозг большого числа эндогенных и экзогенных веществ различной химической природы, являющихся его субстратами [5].

Функциональная активность Pgp может повышаться или снижаться под влиянием факторов внешней и внутренней среды, а также лекарственных веществ [6]. При ингибировании функции Pgp проницаемость ГЭБ для его субстратов и их содержание в ткани мозга увеличивается, а индукция активности транспортера, напротив, приводит к уменьшению концентрации его субстратов в головном мозге [7].

С повышением активности Pgp в ГЭБ связывают развитие фармакорезистентной эпилепсии, неэффективность лекарственной терапии острого нарушения мозгового кровообращения и болезни Альцгеймера [8]. С другой стороны, ряд авторов сообщает о сниженной активности транспортера как одном из ведущих патогенетических звеньев болезни Паркинсона [9], а фармакологическая индукция Pgp, возможно, является стратегией, позволяющей предотвратить развитие данной патологии.

Целью исследования явилась оценка функциональной активности Pgp в ГЭБ коры больших полушарий головного мозга крыс на фоне экспериментального паркинсонического синдрома.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 90 крысах-самцах вистар массой 280-320 г в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (Приказ МЗ РФ №199н от 1 апреля 2016 г).

Функциональную активность Pgp в ГЭБ оценивали по степени проникновения в кору головного мозга маркерного субстрата белка-транспортера – фексофенадина, который вводили внутривенно (в/в) в дозе 10 мг/кг массы.

Животных разделяли на 3 серии (n=30 в каждой). Животным первой серии (контроль) в течение 7 суток подкожно 1 раз в сут вводили подсолнечное масло, на 8-е сутки им в хвостовую вену вводили фексофенадин. Животным второй и третьей серий (контроль патологии) − в течение соответственно 7 и 28 суток вводили ротенон подкожно в дозе 2,5 мг/кг массы 1 раз в сутки [10] для моделирования синдрома паркинсонизма, затем на 8-е сутки в/в вводили фексофенадин.

В связи с отсутствием лекарственной формы фексофенадина для инъекций производили экстракцию лекарственного вещества из таблеток «Аллегра», «Sanofy», Франция (180 мг) по следующей методике: одну таблетку измельчали и суспендировали в 20 мл ацетонитрила («Acros organics», Бельгия) категории «Для ВЭЖХ», содержимое взбалтывали на приборе Shaker в течение 15 мин с после-дующим центрифугированием 15 мин при 1750 g. Надосадочный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе и сухой остаток растворяли в 10 мл воды для инъекций. Концентрацию фексофенадина определяли методом ВЭЖХ для последующего расчета дозы [11].

Крыс всех серий выводили из эксперимента через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после введения фексофенадина под золетиловым наркозом, брали по 5 животных на каждую временную точку для построения фармакокинетической кривой. Для анализа у них забирали кровь в объеме 4 мл из брюшной аорты, а также кору больших полушарий головного мозга, в которых затем определяли концентрацию фексофенадина методом ВЭЖХ с УФ-детектированием по методике, описанной ранее, после соответствующей пробоподготовки [7, 12].

Общее содержание фексофенадина, попавшее в системный кровоток и в кору больших полушарий, оценивали по площади под кривой концентрация фексофенадина (в крови или ткани коры больших полушарий головного мозга) – время (AUC_0-_{t(плазма)}или AUC_0-_t(мозг)), которые рассчитывали по методу трапеций. В связи с тем, что увеличение параметра AUC_0-_t(мозг)может быть следствием как снижения функциональной активности Pgp локально в ГЭБ, так и возрастания концентрации маркерного субстрата транспортера в плазме крови, целесообразно дополнительно оценивать отношение AUC_0-_t(мозг)/ AUC_0-_{t(плазма)}, изменение которого будет характеризовать активность Pgp именно в ГЭБ [11].

Для подтверждения развития паркинсонического синдрома у животных, помимо оценки его клинической картины, методом иммуноферментного анализа на ИФА анализаторе (Stat Fax – 2100, США) определяли уровень дофамина в стриатуме и среднем мозге выборочно у 5 крыс в каждой из 3-х серий (реактивы: CEA851Ge 96 Tests, Cloud-Clone Corp., США).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Statsoft Statistica 7.0 (США)». Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения данных статистическую значимость различий оценивали с помощью теста ANOVA, попарные сравнения выполняли с помощью критерия Фишера. При распределении данных, отличном от нормального, различия между сериями оценивали с помощью критерия Крускала-Уоллиса. При уровне значимости менее 0,05 проводили парное сравнение параметров с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферонни. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение среднего при нормальном распределении данных или медианы, нижнего и верхнего квартилей при распределении данных, отличном от нормального.

Результаты и их обсуждение

Введение ротенона в течение 7 и 28 дней приводило к развитию типичной картины паркинсонизма: ригидность мышц, гипокинезия, нестабильность и шаткость походки. У животных отмечалось снижение уровня дофамина в стриатуме на 7 сут на 69,6% (p=0,095), на 28 сут – на 93,9% (p=0,008), в среднем мозге – на 72,7% (р=0,095) и на 68,7% (р=0,032) соответственно (табл. 1). Достоверных различий между содержанием дофамина в среднем мозге на 7 и 28 дни введения ротенона выявлено не было (p>0,05), однако, в стриатуме концентрация дофамина на 28 день была ниже значения на 7 день на 80,0% (p=0,056).

Изменение плазменной концентрации фексофенадина и его содержания в гомогенате головного мозга крыс после однократного внутривенного введения в различных экспериментальных сериях представлено на рисунках 1, 2 соответственно.

Таблица 1 Уровень дофамина (пг/мг ткани) в стриатуме и среднем мозге крыс после введения подсолнечного масла (контроль) и ротенона (статистическая значимость представлена по сравнению с контролем)

Серия эксперимента	Уровень дофамина: стриатум	Уровень дофамина: средний мозг
Контроль (n=5)	14,8 (13,1; 16,5)	9,9 (6,6; 15,1)
Ротенон 7 дней (n=5)	4,5 (1,6; 11,3), p=0,095	2,7 (1,5; 8,5), p=0,095
Ротенон 28 дней (n=5)	0,9 (0,5; 1,7), p=0,008	3,1 (1,7; 6,5), p=0,032

Рис. 1. Динамика плазменной концентрации фексофенадина после его внутривенного введения в сериях контроля и введения ротенона в течение 7 и 28 дней (медианы значений)

Рис. 2. Динамика концентрации фексофенадина после его внутривенного введения в гомогенате коры больших полушарий головного мозга в сериях контроля и введения ротенона в течение 7 и 28 дней (медианы значений)

Динамика плазменных концентраций фексофенадина достоверно не отличалась во всех экспериментальных сериях (p>0,05). При этом, максимальная концентрация вещества определялась через 5 мин после введения с постепенным снижением к 60 мин наблюдения. Следует отметить, что в серии 28-дневного введения ротенона, через 15 мин содержание фексофенадина в плазме крови животных было ниже в 1,82 раза (p=0,0472) по сравнению с контролем.

Концентрация фексофенадина в гомогенате коры больших полушарий головного мозга крыс была выше контрольных значений после 7-дневного введения ротенона через 10 и 45 мин на уровне тенденции в 3,91 и в 3,53 раза соответственно (p=0,0758). 28-дневное введение ротенона приводило к возрастанию содержания фексофенадина в мозге через 10 мин в 3,02 раза (p=0,0283) и через 15 мин − в 4,85 раза (тенденция: p=0,0758).

При внутривенном введении контрольным крысам фексофенадина AUC_0-_{t(плазма)}и AUC_0-_t(мозг)вещества составили соответственно 266,2 (246,4; 285,6) мкг/мл * мин и 5,9 (5,8; 6,6) мкг/г*мин, отношение данных параметров AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)}равнялось 0,020 (0,019; 0,022). Введение животным ротенона в течение 7 дней приводило к возрастанию AUC_0-_t(мозг)фексофенадина в 2,02 раза (p=0,0163), отношения AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)} − в 2,4 раза (p=0,0283). 28-дневное введение ротенона вызывало увеличение AUC_0-_t(мозг)фексофенадина в 1,75 раза (p=0,0283), отношения AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)} − в 2,27 раза (p=0,0163). Причем между показателями серий 7- и 28-дневного введения ротенона различий выявлено не было.

Установленные изменения фармакокинетики маркерного субстрата Pgp – фексофенадина свидетельствуют о снижении функциональной активности белка-транспортера в ГЭБ на фоне введения ротенона – пестицида, вызывающего развитие паркинсонического синдрома.

Таблица 2 Значения AUC_0-_t(мозг), AUC_0-_{t(плазма)} и AUC_0-_t(мозг) / AUC_0-_{t(плазма)} фексофенадина в сериях контроля и введения ротенона в течение 7 и 28 дней

Серия/параметр

AUC_0-_t_(мозг), мкг/г*мин

AUC_0-_t_{(плазма)}, мкг/мл*мин

AUC_0-_t_(мозг) / AUC_0-_t_{(плазма)}

Контроль

5915,8

(5783,2; 6645,2)

266181,6

(246356,3; 285630,8)

0,0202

(0,0199; 0,0222)

Ротенон 7 дней

11940,8

(9237,8; 24989,4)*

206994,0

(195394,7; 292076,2)

0,0484

(0,0396; 0,0856)*

Ротенон 28 дней

10343,9

(8448,6; 10770,3)*

235258,6

(231383,8; 267335,3)

0,0458

(0,0447; 0,0569)*

Примечание: * − статистически значимые различия по сравнению с сериeй контроля; данные представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей

Ряд исследований, посвященных изучению корреляции между полиморфизмами гена MDR1, кодирующего Pgp, свидетельствуют о зависимости между функционированием транспортера и развитием болезни Паркинсона. На 606 пациентах японской популяции оценивалась корреляция полиморфизма гена MDR1 C3435T с риском развития заболевания. У пациентов с генотипом TT, ассоциированным со сниженной активностью Pgp, был выявлен повышенный риск развития болезни Паркинсона по сравнению с больными с генотипом CC [13].

На пациентах с болезнью Паркинсона в шведской популяции была показана корреляционная зависимость между полиморфным маркером С1236T гена MDR1 и наличием заболевания, однако полиморфизмы 2677G/T/A и 3435C/T являлись незначимыми для его развития [14].

В европейской и азиатской популяциях выявлено отсутствие корреляции между наличием полиморфного маркера С3435T гена MDR1 и развитием болезни Паркинсона на аллельных, гомозиготных, рецессивных и доминантных моделях, при этом была обнаружена статистическая значимость влияния полиморфизма C1236T на рецессивной модели [15].

Таким образом, в исследованиях по изучению взаимосвязи полиморфизмов гена MDR1 и развитием болезни Паркинсона получены противоречивые результаты, что требует дальнейшего изучения данного вопроса, и не исключает участия Pgp в патогенезе заболевания.

На сегодняшний день также известны исследования, результаты которых свидетельствуют об изменении функциональной активности Pgp при паркинсонизме. Например, методом фотонно-эмиссионной томографии выявлено увеличение проникновения меченного ¹¹С верапамила (субстрата Pgp) в головной мозг пациентов с болезнью Паркинсона [16].

В эксперименте на крысах обнаружено 3-кратное увеличение количества Pgp-позитивных клеток в ГЭБ среднего мозга при паркинсонизме, смоделированном курсовым подкожным введением ротенона [17].

Таким образом, данные о функционировании Pgp на фоне паркинсонизма также неоднозначны.

В ходе настоящего исследования изучалась активность Pgp в ГЭБ коры больших полушарий головного мозга крыс при развитии экспериментального паркинсонического синдрома. Паркинсонический синдром моделировали подкожным ведением ротенона в дозе 2,5 мг/кг 1 раз в день в течение 7 и 28 суток.

В связи с признанием роли нейротоксинов в формирование болезни Паркинсона, ряд подобных веществ (6-гидроксидофамин, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, ротенон и др.) используют для моделирования паркинсонизма в экспериментах in vivo [4]. Причем по мнению многих авторов, оптимальной моделью является подкожное введением крысам ротенона по примененной нами схеме [4, 18]. Преимуществом ротеноновой модели является способность нейротоксина провоцировать дофаминергическую нейродегенерацию, наиболее схожую по своим симптомам и молекулярно-биологическим признакам с таковыми при болезни Паркинсона. Так, введение ротенона ведет к избирательной прогрессирующей дегенерации нигростриарного пути, аналогичной при наличии болезни Паркинсона [19], а также к образованию убиквитин- и α-синуклеин-позитивных включений в нигральных клетках, которые сходны с тельцами Леви.

Активность Pgp в ГЭБ оценивали по проникновению маркерного субстрата транспортера − фексофенадина в головной мозг. Маркерный субстрат – это вещество экзогенного или эндогенного происхождения, фармакокинетика которого зависит в большей степени от функционирования Pgp, то есть он не подвергается биотрансформации и не является субстратом других белков-транспортеров [11].

Введение ротенона, приводило к развитию типичной картины паркинсонизма (вызывало ригидность мышц, гипокинезию, нестабильность и шаткость походки) и снижало уровень дофамина в стриатуме и среднем мозге животных. Также было обнаружено повышение проникновения фексофенадина в кору больших полушарий головного мозга животных, что свидетельствует о снижении активности Pgp в ГЭБ.

Ингибирование активности Pgp в ГЭБ может привести к аккумуляции нейротоксинов − субстратов белка-транс-портера в ткани головного мозга и, как следствие, способствовать развитию нейрогенеративных процессов и манифестации патологии.

Таким образом, одним из перспективных направлений профилактики возникновения и дальнейшего прогрессирования паркинсонизма, особенно у лиц, по роду деятельности контактирующих с токсическими веществами, возможно, является применение индукторов Pgp. В настоящее время индуцирующее влияние на белок-транспортер выявлено у ряда лекарственных средств – дексаметазона, карбамазепина, морфина, рифампицина, ретиноевой кислоты, фенотиазина и др. [20]. Однако помимо влияния на Pgp, они обладают широким спектром основных и побочных эффектов. Безопасных веществ, селективно активирующих транспортер, в настоящее время не синтезировано, а подобное действие известных препаратов, например, из группы нейропротекторов не установлено.

Таким образом, гипотеза целесообразности индукции Pgp в ГЭБ с целью профилактики паркинсонизма, связанного с воздействием нейротоксических веществ, требует экспериментальной проверки.

Вывод

Развитие паркинсонического синдрома, вызванного подкожным введением ротенона в дозе 2,5 мг/кг массы 1 раз в сут в течение 7 и 28 дней, приводит к снижению активности гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере коры больших полушарий головного мозга крыс, что подтверждается накоплением в головном мозге маркерного субстрата белка-транспортера – фексофенадина.