Изучение остеопротективного действия l-аргинина, l-норвалина и розувастатина на модели гипоэстроген-индуцированного остеопороза у крыс
- Авторы: Гудырев О.С.1, Файтельсон А.В.2, Соболев М.С.2, Покровский М.В.1, Покровская Т.Г.1, Корокин М.В.1, Поветка Е.Е.1, Миллер Э.С.1, Солдатов В.О.1
-
Учреждения:
- ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
- ФГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет Минздрава России
- Выпуск: Том 27, № 3 (2019)
- Страницы: 325-332
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 06.10.2019
- Статья опубликована: 08.10.2019
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/16340
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019273325-332
- ID: 16340
Цитировать
Аннотация
Воздействие на микроциркуляторное русло костной ткани является одним из перспективных подходов в лечении остеопороза. Цель. Изучение антиостеопоротических свойств эндотелиопротекторов: L-аргинина, L-норвалина и розувастатина. Материалы и методы. Исследование остеопротективных свойств L-аргинина, L-норвалина и розувастатина, а также препарата сравнения – стронция ранелата – проведено на 152 самках крыс линии Вистар с использованием модели гипоэстроген-индуцированного остеопороза. Оценку антиостеопоротического и эндотелиопротективного действия препаратов проводили с использованием лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) проксимального метафиза бедренной кости, морфометрии костных трабекул, а также расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции. Результаты. При проведении ЛДФ повышение уровня микроциркуляции проксимального метафиза бедренной кости относительно животных с остеопорозом без лечения (61,52±3,74 перфузионных единиц (ПЕ)) было наиболее выражено при применении L-норвалина (115,25±5,36 ПЕ, p<0,001) и розувастатина (106,57±5,22 ПЕ, p<0,001), менее выраженный эффект продемонстрировали L-аргинин (98,10±4,48 ПЕ, p<0,001) и препарат сравнения – стронция ранелат (86,49±4,99 ПЕ). Сходная тенденция наблюдалась при морфометрии костных трабекул: в группе с остеопорозом без лечения диаметр костных трабекул составил 61,68±1,24 мкм, в группе с применением L-норвалина – 91,86±1,18 мкм (p<0,001), в группе с применением L-аргинина – 86,64±1,39 мкм (p<0,001), в группе с применением розувастатина – 85,56±0,86 мкм (p<0,001)и в группе с применением стронция ранелата – 89,08±1,09 мкм. Заключение. L-аргинин и L-норвалин, а также розувастатин обладают способностью улучшать морфофункциональное состояние костной ткани и могут быть рекомендованы для дальнейшего доклинического изучения.
Ключевые слова
Полный текст
Причиной развития остеопороза является разрегулированность основных процессов остеогенеза – резорбции и образования костной ткани. При нарушении регионального кровоснабжения кости происходит уменьшение количества остеобластов и торможение их активности, одновременно с этим активизируют свою деятельность остеокласты [1, 2]. Следовательно, кровоснабжение играет ключевую роль в процессах ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани. Эндотелиальная дисфункция и эндотелий-ассоциированные патологии чаще всего являются основной причиной ухудшения микроциркуляторного кровотока в костной ткани, что, в свою очередь, приводит к нарушению остеогенеза, вызывая тем самым остеопороз [3].
Принципиально новый подход, базирующийся на связи дисфункции эндотелия с остеопорозом, связан с применением препаратов, улучшающих функцию эндотелия с целью увеличения плотности костной ткани [4]. Данный подход открывает возможность применения ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы), а также L-аргинина и L-норвалина в качестве остеопротективных препаратов [5].
L-аргинин и L-норвалин представляют собой аминокислоты, способствующие увеличению продукции оксида азота (NO) ферментом эндотелиальная NO-синтаза [6, 7]. Ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), помимо гиполипидемического действия, обладают эндотелиопротективной активностью [8]. Ингибируя синтез мевалоновой кислоты, статины предотвращают синтез изопреноидных интермедиатов фарнезилпирофосфата и геранилгеранилпирофосфата, которые необходимы для активации некоторых гетеротримерных G-белков, включая Ras и Rho [9, 10]. Указанные белки регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и структуру цитоскелета [11, 12]. Избыточная активность Ras и Rho приводит к снижению синтеза eNOS, синтезу провоспалительных цитокинов, росту проницаемости сосудистой стенки и увеличению количества пенистых клеток [13, 14].
Описанные свойства положительно влияют на состояние внутрикостной микроциркуляции, тем самым опосредовано улучшают трофику костной ткани, в т.ч. позитивно воздействуют на остеорегенерацию. В связи с этим имеются весомые теоретические предпосылки для изучения антиостеопоротического действия данных препаратов.
Цель – изучение антиостеопоротических свойств эндотелиопротекторов: L-ар-гинина, L-норвалина и розувастатина.
Материалы и методы
Исследование выполнено в соответствии с требованиями Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 24.06.1998 г., правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и ГОСТ Р 53434-2009), директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС), правил Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) и Правил лaбoрaтoрнoй практики, принятых в РФ (Приказ MЗ РФ №708 от 29.08.2010).
Опыты проводили на 152 самках белых крыс линии Вистар массой 250±50 г. Для моделирования экспериментального остеопороза крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг и проводили операцию билатеральной овариэктомии. Развитие остеопороза и антиостеопоротическое действие исследуемых препаратов оценивали через восемь недель (на 57-й день) после проведения овариэктомии путем оценки регионарной микроциркуляции, проведения сосудистых тестов и гистоморфометрического исследования.
Уровень микроциркуляции оценивали в губчатой костной ткани проксимального метафиза правой бедренной кости. Для получения данных микроциркуляции в кости использовали оборудование компании Biopac Systems (США): полиграф MP100-150 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и датчиком TSD144. Регистрация результатов ЛДФ производилась программой Acq Knowledge версий 3.8-4.2, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).
Развитие гипоэстроген-индуцирован-ной эндотелиальной дисфункции оценивали после измерения внутрикостного уровня микроциркуляции, для чего проводили сосудистые пробы на эндотелийзависимую (ацетилхолин внутривенно (в/в) 40 мкг/кг) и эндотелийнезависимую (натрия нитропруссид в/в 30 мкг/кг) вазодилатацию. Используя результаты сосудистых проб, рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина.
Для подтверждения развития остеопороза и для оценки эффективности исследуемых препаратов проводили морфологическое исследование проксимальных метафизов бедренных костей, для этого предметные стекла с гистологическими препаратами подвергали световой микроскопии. Для проведения гистоморфометрии костной ткани использовали предварительно откалиброванную программу Image J версий 1.39-1.43, в которой измеряли ширину костных трабекул и выражали ее в микрометрах.
Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно ежедневно однократно в сутки в течение восьми недель после овариэктомии в виде суспензии в 1% крахмальном клейстере: L-аргинин – в дозе 200 мг/кг, L-норвалин – в дозе 10 мг/кг, розувастатин – в дозе 0,86 мг/кг. В качестве препарата сравнения был выбран эффективный препарат для профилактики и коррекции остеопоротических нарушений – стронция ранелат в дозе 171 мг/кг. Животные с экспериментальным остеопорозом получали внутрижелудочно 1% крахмальный клейстер в качестве плацебо. В группу контрольных крыс входили ложнооперированные животные (ложная операция овариэктомии без удаления яичников), которые в течение восьми недель также получали в качестве плацебо внутрижелудочно 1% крахмальный клейстер.
Полученные в работе экспериментальные данные были подвергнуты анализу с помощью описательной статистики (пакет анализа Micrоsоft Excel). У групповых показателей определялись средние значения (M) и ошибка среднего (m). Анализ статистически значимых различий при межгрупповых сравнениях проводился по гетероскедастическому t-тесту (двухвыборочный t-тест Стьюдента с различными дисперсиями). При анализе большого числа сравнений использовался критерий Стьюдента с поправкой Ньюмена-Кейлса.
Результаты и их обсуждение
На 57-е сут после проведения операции билатеральной овариэктомии оценивали уровень микроциркуляции в проксимальном метафизе правой бедренной кости. Результаты изучения кровоснабжения костной ткани крыс позволили выявить более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани бедра у крыс с остеопорозом (n=30) – 61,52±3,74 ПЕ, по сравнению с контрольными животными (n=42) – 100,51±4,41 ПЕ (р<0,001).
После измерения микроциркуляции в костной ткани бедра проводили функциональные сосудистые тесты эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации, а также рассчитывали значения КЭД для микроциркуляторного звена проксимального метафиза бедренной кости у крыс. Так, в группе контрольных животных получили КЭД=1,30±0,19, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом КЭД=2,38±0,23 (р=0,002), что свидетельствует о развитии у животных с остеопорозом эндотелиальной дисфункции.
Для дальнейших морфологических исследований производился забор костного биоматериала. Гистологические срезы проксимальных отделов бедренных костей животных подвергали микроскопии и гистоморфометрии. Остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии. Во время проведения микроскопии были выявлены патологические изменения в губчатой костной ткани бедра у крыс с экспериментальным остеопорозом. Обнаружили истончение решетчатой сети костных трабекул, а также истончение и перфорацию костных пластинок. В отдельных гистологических препаратах определялись микропереломы костных трабекул.
Выявили уменьшение средней ширины костных трабекул в губчатой ткани проксимального метафиза бедренной кости. Так, средняя ширина костных трабекул в данной локализации у крыс с остеопорозом составила 61,68±1,24 мкм, что меньше, чем данный показатель у контрольных животных – 97,69±1,02 мкм (р<0,001).
Таким образом, развивающаяся у самок крыс в результате овариэктомии эндотелиальная дисфункция, в т.ч. микроциркуляторного русла костной ткани, приводит к заметному ухудшению регионарного кровотока, что, в свою очередь, приводит к разбалансировке процессов костного ремоделирования и возникновению остеопоротических изменений костной ткани.
Было обнаружено, что исследуемые препараты, а также препарат сравнения – стронция ранелат – предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра у крыс с остеопорозом (рис. 1).
Рис. 1. Результаты влияния L-аргинина, L-норвалина, розувастатина и стронция ранелата на кровоснабжение проксимального метафиза бедренной кости через 8 недель после билатеральной овариэктомии
Результаты ЛДФ в группе крыс, получавших L-аргинин (n=20), достоверно превышали таковые в группе крыс с остеопорозом без лечения (р<0,001) и статистически значимо не отличались от показателей в группах препарата сравнения (р=0,091, n=20) и контрольных крыс (р=0,736).
Результаты ЛДФ у животных, получавших L-норвалин (n=20), также превышали значения ЛДФ в группе крыс с остеопорозом без лечения(р<0,001) и животных, получавших стронция ранелат (р<0,001), но не отличались статистически значимо от контрольной группы (p=0,051).
Результаты ЛДФ в группе крыс, получавших розувастатин (n=20), также превышали как показатели группы крыс с остеопорозом без лечения (р<0,001), так и показатели в группе препарата сравнения (р=0,008), а также были сопоставимы с показателями контрольных животных (р=0,412).
При этом все исследуемые препараты обладали эндотелиопротективной активностью, достоверно предотвращая повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции. У крыс, получавших L-аргинин, КЭД=1,34±0,21 (р=0,012), L-норвалин – КЭД=1,37±0,10 (р=0,003), розувастатин – КЭД=1,35±0,12 (р=0,017). Препарат сравнения – стронция ранелат – достоверно не обладал эндотелиопротективной активностью, КЭД=2,14±0,11 (р=0,532).
При микроскопии срезов бедренных костей у крыс, получавших лечение, обнаружили сохранение структуры костной ткани проксимального метафиза бедренной кости. При проведении морфометрических исследований отмечалось предотвращение уменьшения средней ширины костных трабекул в проксимальном метафизе бедра у лабораторных животных под влиянием всех изучаемых препаратов, а также препарата сравнения (рис. 2). Среди исследуемых препаратов наиболее выраженной антиостеопоротической активностью обладал L-норвалин.
Рис. 2. Результаты влияния L-аргинина, L-норвалина, розувастатина и стронция ранелатана среднюю ширину костных трабекул проксимального метафиза бедренной кости через 8 недель после билатеральной овариэктомии
Заключение
Эндотелиальный монослой внутрикостных сосудов играет центральную регуляторную роль, обладая значительной метаболической активностью. К числу функций эндотелия можно отнести регуляцию адгезии лейкоцитов, уровня микроциркуляции, агрегатного состояния крови, анатомии сосудистого русла костной ткани, активности остеокластов и остеобластов [15].
В настоящем исследовании было показано, что аминокислоты L-аргинин и L-норвалин, а также ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы розувастатин обладают способностью улучшать морфофункциональное состояние костной ткани и увеличивать уровень микроциркуляции проксимального метафиза бедренной кости. Полученные данные позволяют рекомендовать данные препараты для дальнейшего доклинического изучения в качестве средств с выраженной антиостеопоротической активностью. В частности, экспериментальной проверки требуют оценка влияния данных препаратов на течение других моделей остеопороза (диабетический, глюкокортикоид-индуцирован-ный), биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции и остеопороза, выявление связи между антиостеопоротической активностью и режимом введения препаратов.
Об авторах
Олег Сергеевич Гудырев
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0097-000X
SPIN-код: 5936-4774
ResearcherId: N-5527-2016
к.м.н., доцент, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, БелгородАлександр Владимирович Файтельсон
ФГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет Минздрава России
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-3759-6373
SPIN-код: 7389-8181
ResearcherId: A-9809-2017
д.м.н., доцент, профессор кафедры травматологии и ортопедии
Россия, КурскМихаил Сергеевич Соболев
ФГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет Минздрава России
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-7839-2049
SPIN-код: 2987-3470
ResearcherId: A-9473-2019
аспирант кафедры травматологии и ортопедии
Россия, КурскМихаил Владимирович Покровский
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1493-3376
SPIN-код: 9201-3580
ResearcherId: A-4427-2017
д.м.н., профессор, заведующий кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, БелгородТатьяна Григорьевна Покровская
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6802-5368
SPIN-код: 8338-0100
ResearcherId: A-5281-2017
д.м.н., профессор, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, БелгородМихаил Викторович Корокин
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697
SPIN-код: 8385-3508
ResearcherId: A-6652-2017
д.м.н., профессор, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, БелгородЕлена Евгеньевна Поветка
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4517-1041
SPIN-код: 3609-4411
ResearcherId: A-8035-2019
студент
Россия, БелгородЭдуард Сергеевич Миллер
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-7982-7518
SPIN-код: 8028-5617
ResearcherId: A-7578-2019
студент
Россия, БелгородВладислав Олегович Солдатов
ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Email: gudyrev@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9706-0699
SPIN-код: 8763-8217
ResearcherId: A-7292-2019
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии
Россия, БелгородСписок литературы
- Noble le F., Noble le J. Bone biology: Vessels of rejuvenation // Nature. 2014. Vol. 507 (7492). P. 313-314. doi: 10.1038/nature13210
- Huang H., Ma L., Kyrkanides S. Effects of vascular endothelial growth factor on osteoblasts and osteoclasts // American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 2016. Vol. 149, №3. P. 366-373. doi: 10.1016/j.ajodo.2015.09.021
- Prisby R.D., Dominguez J.M. II, Muller-Delp J., et al. Aging and Estrogen Status: A Possible Endothelium-Dependent Vascular Coupling Mechanism in Bone Remodeling // PLoS One. 2012. Vol. 7, №11. P.e48564. doi: 10.1371/journal.pone.0048564
- Xu R., Yallowitz A., Qin A., et al. Targeting skeletal endothelium to ameliorate bone loss // Nature Medicine. 2018. Vol. 24, №6. P. 823-833. doi: 10.1038/s41591-018-0020-z
- Rajkumar D.S.R., Gudyrev O.S., Faitelson A.V., et al. Study of the influence of L-norvaline, rosuvastatin and their combination on the level of microcirculation in bone tissue in experimental osteoporosis and fractures on its background // Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology. 2016. Vol. 2, №1. P. 20-24. doi:10.18413/ 2313-8971-2016-2-1-20-24
- Popolo A., Adesso S., Pinto A., et al. L-Arginine and its metabolites in kidney and cardiovascular disease // Amino Acids. 2014. Vol. 46, №10. P. 2271-2286. doi: 10.1007/s00726-014-1825-9
- Ivlitskaya I.L., Korokin M.V., Loktionov A.L. Pharmacological efficiency of statins and L-norvalin at an endotoxin-induced endothelial dysfunction // Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology. 2016. Vol. 2, №2. P. 25-35. doi: 10.18413/2313-8971-2016-2-2-25-35
- Denisyuk T.A., Lazareva G.A., Provotorov V.Ya., et al. Endothelium and cardioprotective effects of HMG-Co-A-Reductase in combination with L-arginine in endothelial dysfunction modeling // Research Result: Pharmacology and Clinical Pharmacology. 2016. Vol. 2, №1. P. 4-8. doi:10.18413/ 2313-8971-2016-2-1-4-8
- Cho K.J., Hill M.M., Chigurupati S., et al. Therapeutic levels of the hydroxmethylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitor lovastatin activate Ras signa-ling via phospholipase D2 // Molecular and Cellular Biology. 2011. Vol. 31, №6. P. 1110-1120. doi: 10.1128/MCB.00989-10
- Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway // Nature. 1990. Vol. 343 (6257). P. 425-430. doi: 10.1038/343425a0
- Van Aelst L., D’Souza-Schorey C. Rho GTPases and signaling networks // Genes & Development. 1997. Vol. 11, №18. P. 2295-2322. doi:10.1101/ gad.11.18.2295
- Laufs U., Liao J.K. Post-transcriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase mRNA stability by Rho GTPase // Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273, №37. P. 24266-24271. doi:10.1074/ jbc.273.37.24266
- Laufs U., La Fata V., Plutzky J., et al. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors // Circulation. 1998. Vol. 97, №12. P. 1129-1135. doi: 10.1161/01.cir.97.12.1129
- Oesterle A., Laufs U., Liao J.K. Pleiotropic Effects of Statins on the Cardiovascular System // Circulation Research. 2017. Vol. 120, №1. P. 229-243. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.308537
- Steyers C.M. III, Miller F.J. Endothelial dysfunction in chronic inflammatory diseases // International Journal of Molecular Sciences. 2014. Vol. 15, №7. P. 11324-11349. doi: 10.3390/ijms150711324
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)