Comparison of cytotoxicity of vascular prostheses in vitro

Roman E. Kalinin; Калинин Роман Евгеньевич; Igor A. Suchkov; Сучков Игорь Александрович; Nina D. Mzhavanadze; Мжаванадзе Нина Джансуговна; Natalya V. Korotkova; Короткова Наталья Васильевна; Aleksandr A. Nikiforov; Никифоров Александр Алексеевич; Ivan Yu. Surov; Суров Иван Юрьевич; Polina Yu. Ivanova; Иванова Полина Юрьевна; Anastasiya D. Bozhenova; Боженова Анастасия Дмитриевна; Ekaterina A. Strelnikova; Стрельникова Екатерина Андреевна

doi:10.23888/PAVLOVJ2020282183-192

Сравнение цитотоксичности синтетических сосудистых протезов in vitro

Авторы: Калинин Р.Е.¹, Сучков И.А.¹, Мжаванадзе Н.Д.¹, Короткова Н.В.¹, Никифоров А.А.¹, Суров И.Ю.¹, Иванова П.Ю.¹, Боженова А.Д.¹, Стрельникова Е.А.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Выпуск: Том 28, № 2 (2020)
Страницы: 183-192
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 01.07.2020
Статья опубликована: 03.07.2020
URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/34905
DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2020282183-192
ID: 34905

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучить и сравнить цитотоксичность ключевых видов синтетических протезов, используемых в артериальной реконструктивной хирургии, включая политетрафторэтилен (ПТФЭ) и полиэтилентерефталат (дакрон).

Материалы и методы. На культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (англ. – human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 3 пассажа проведен MTS-тест, используемый в лабораторных исследованиях с привлечением клеточных технологий для изучения цитотоксичности лекарственных веществ и медицинских изделий. Тест подразумевает использование реагента МТS, представляющего собой 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолиум; дополнительно используется феназина метосульфат (PMS), играющий роль электрон-связывающего реагента. В ходе эксперимента клетки инкубировались с ПТФЭ и дакроном в течение 24 часов при 37°С с содержанием 5% CO₂. Культивированные в стандартной ростовой среде HUVEC выступили в роли контроля. MTS в присутствии PMS восстанавливался митохондриальными дегидрогеназами эндотелиальных клеток в формазан, имеющий синее окрашивание. Супернатант культур клеток фотоколорометрически при помощи анализатора Stat Fax 3200 (microplate reader) Awareness technology Inc. Palm City Fl. (США).

Результаты. Наименьшие средние значения отмечались в группе дакрона – 0,21 (0,20-0,22) единиц оптической плотности, наибольшие отмечены в группе контроля – 0,36 (0,35-0,38); показатели в группе ПТФЭ составили 0,35 (0,33-0,36). При сравнении исследуемых групп статистически значимые различия были обнаружены между группой контроля и дакрона (р<0,001), контроля и ПТФЭ (р=0,037), дакрона и ПТФЭ (р<0,001). Инкубация с дакроном привела к угнетению метаболической активности клеток на 41,7% по сравнению с группой контроля (р<0,001). Метаболическая активность клеток, подверженных воздействию ПТФЭ, была близкой к группе контроля, т.е. соответствовала оптимальным условиям культивирования эндотелиальных клеток in vitro.

Вывод. В сравнении с полиэтилентерефталатом (дакроном) политетрафторэтилен (ПТФЭ) наименее выраженно угнетал метаболическую активность эндотелиоцитов in vitro.

Ключевые слова

цитотоксичность, ПТФЭ, дакрон, HUVEС, in vitro

Полный текст

В открытой реконструктивной хирургии периферических артерий оптимальным способом реваскуляризации является использование аутологичных материалов, в частности, большой подкожной вены. Редко, в сложных клинических ситуациях, применяются свежеприготовленные или криопрезервированные аллогенные венозные либо артериальные протезы, использование которых может ассоциироваться с реакциями иммуносенсибилизации и неконтролируемыми процессами деградации. В случаях, когда аутологичный материал не доступен, применяются сосудистые протезы, преимущественно из политетрафторэтилена (ПТФЭ) и полиэтилентерефталата (дакрон).

Сосудистые кондуиты из ПТФЭ стали использоваться в клинической практике с 1976 г. [1]. Протезы из дакрона применяются в сердечно-сосудистой хирургии уже более 70 лет. В настоящее время большинство дакроновых протезов покрываются коллагеном или желатином, либо импрегнируется серебром; помимо этого, для снижения тромбогенности, протезы покрываются гепарином [2].

В ранних исследованиях было показано, что дакроновые графты могут иметь удовлетворительную проходимость в срок 16 месяцев при использовании коротких участков размером 3,5 мм х 4 см при создании аорто-коронарных шунтов [3]. При этом сосудистые протезы из ПТФЭ в качестве аорто-коронарных шунтов показали лишь 14%-ую проходимость в сроки 45 месяцев [4]. Тем не менее, синтетические графты малого диаметра в настоящее время практически не применяются ввиду высоких рисков развития осложнений.

При этом, в реконструктивной хирургии аорты и магистральных артерий конечностей искусственные протезы получили широкое распространение. Ряд авторов сообщают о том, что дакроновые протезы проявляют не меньший профиль безопасности и надежности, чем ПТФЭ: согласно данным исследований, структурные недостатки отмечаются не более чем в 0,2% случаев в отдаленном после реконструкции периоде [5]. Однако, по сравнению с дакроном, ПТФЭ представляет собой менее пористый материал, ввиду чего отмечается меньшая проницаемость этого материала для крови; несмотря на химическую инертность материала, белки и клеточные элементы крови могут осаждаться и на ПТФЭ [6]. Согласно ряду клинических исследований, проходимость протезов из ПТФЭ и дакрона является сравнимой [7].

Ранние осложнения реконструктивных вмешательств зачастую могут быть объяснены неудовлетворительной биосовместимостью протеза и нативного сосуда. Искусственные графты имеют тенденцию к отсутствию эндотелизации в участках вне зон анастомозов; на неэндотелизированных участках протезов в итоге откладываются белки плазмы, преимущественно, фибриноген, и тромбоциты, образуя так называемую «псевдонеоинтиму», толщина которой, как правило, достигает 1 мм, что, в итоге, предрасполагает протез к развитию тромбоза, а также повышенным рискам инфекции при бактериемии [8]. К более поздним тяжелым осложнениям следует отнести развитие гиперплазии интимы, особенно, в зоне дистальных анастомозов, которая развивается вследствие различных молекулярных механизмов, клеточных взаимодействий и физических факторов как результата имплантации искусственного протеза [9]. Большое количество экспериментальных и клинических исследований in vitro и in vivo посвящено изучению молекулярно-генетических аспектов патогенеза и возможных путей профилактики развития непосредственно самого периферического атеросклероза, так и осложнений реконструктивной хирургии, включая гиперплазию интимы, тромбоз, ишемию-реперфузию [10-13].

В физиологичных условиях эндотелий имеет атромбогенную поверхность, на которой экспрессируются сульфаты хондроитина и гепарина; противосвертывающие свойства интимы также обеспечиваются продукцией простагландина I2, оксида азота (II) и АДФ-азы [14]. Невозможность искусственного сосудистого протеза полностью воссоздать атромбогенные свойства нативного сосуда в целом предопределяет судьбу искусственных материалов в артериальной позиции в хирургии периферических артерий. Порозность материала сосудистых протезов, комплайенс между имплантированным графтом и нативным сосудом, особенности кровотока в зонах анастомоза играют важную роль в развитии осложнений.

Улучшение эндотелизации и гемосовместимости сосудистых протезов, а также модификация их поверхности в целом призваны предотвратить отложение различных белков плазмы крови и повысить отдаленную проходимость искусственных графтов. Подобное изменение внутреннего просвета графтов возможно путем нанесения различных соединений, например, гидрофильного полиэтиленгликоля, цвиттерионных полимеров, гепарина и прочих. Однако избыточная гидрофильность препятствует адгезии эндотелиальных клеток и формированию оптимальной внутренней выстилки протезов. Поэтому многие исследования направлены на улучшение функциональной эндотелизации протезов путем молекулярно-генетических методик [15, 16].

In vitro изучение влияния искусственных материалов, применяемых в сосудистой хирургии, на клетки сосудистой стенки может дать дополнительное понимание механизмов взаимодействия клеточных элементов нативного сосуда, а также крови, и сосудистого протеза. Исследуются особенности адгезии клеток HUVEC на материал ПТФЭ, например, после модификации последнего низкотемпературной плазмой, особенности биосовместимости различных материалов, например, фиброина шелка и полиуретановых мембран при культивировании с клетками HUVEC, проводится in vitro оценка цитотоксичности искусственных материалов при различных видах воздействия [17-19].

Оценка цитотоксичности in vitro в целом широко применяется в доклинических исследованиях для изучения влияния раз-личных лекарственных веществ и медицинских изделий на культуры клеток. Одними из наиболее востребованных в рутинной лабораторной практике являются МТТ и MTS тесты.

МТТ-тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых и метаболически активных клеток превращать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, обладающий различной степенью окрашивания. При добавлении диметилсульфоксида (ДМСО) к формазану последний растворяется, что позволяет измерить оптическую плотность полученного раствора и, таким образом, оценить метаболическую активность исследуемых клеток и соответственно цитотоксичность исследуемого вещества или медицинского изделия.

Похожая методика изучения цитотоксичности использует реагент МТS, представляющий собой 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил) -2Н-тетразолиум в присутствии феназина метосульфата (PMS), который играет роль электрон-связывающего реагента. MTS аналогично МТТ восстанавливается клетками до продукта формазана; степень окрашивания клеточного супернатанта может быть измерена фотоколорометрически (рис. 1) [20].

Рис. 1. Схема восстановления MTS до формазана под воздействием дегидрогеназ

Наиболее популярным объектом для in vitro изучения различных сосудистых заболеваний и патологических состояний являются эндотелиальные клетки пупочной вены человека – клетки HUVEC (англ. – human umbilical vein endothelial cells). Клетки HUVEC имеют ряд преимуществ: это удобство выделения, относительно низкая себестоимость, легкое культивирование в лабораторных условиях. HUVEC были впервые изолированы и культивированы in vitro в 1973 г. E. Jaffe и коллегами [21]. Клеточная линия HUVEC наиболее часто используется в in vitro исследованиях в сфере сосудистой биологии. HUVEC используются для изучения как физиологических процессов, протекающих в эндотелии, так и моделирования различных патологических процессов, проведения фармакологических исследований, изучения эффектов медицинских изделий.

При проведении фундаментальных исследований эндотелиальные клетки пуповины человека часто являются моделью выбора для биомедицинской промышленности и доклинических экспериментов.

Таким образом, цель данного исследования – изучить и сравнить цитотоксичность ключевых видов синтетических протезов, используемых в артериальной реконструктивной хирургии, включая политетрафторэтилен (ПТФЭ) и полиэтилентерефталат (дакрон).

Материалы и методы

В ходе эксперимента использовались культуры первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC 3 пассажа. Изоляция и культивирование клеток проводились в Лаборатории клеточных технологий Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России согласно стандартным общепринятым протоколам. В качестве тестируемых объектов использованы ПТФЭ и полиэтилентерефталат (дакрон) размером 4х4 мм, все идентичной массой 25 мг. Расчетные размер и масса материалов были выбраны с учетом оптимального покрытия площади поверхности мембранных вставок и результатов предварительных экспериментальных исследований; в качестве контроля использовалось добавление в лунку планшета аналогичного остальным лункам количества ростовой эндотелиальной среды ECGM (Cell Applications Sigma/Aldrich, каталожный номер 211-500). Эксперимент выполнялся трижды с разными первичными линиями HUVEC для исключения погрешностей в измерении.

В ходе каждого эксперимента в ряды лунок 12-луночного планшета (Corning, каталожный номер 3512) засеивались первичные HUVEC (3-й пассаж). Срок роста клеток в 12-луночном планшете до внесения тестируемых объектов составил 48 ч при 37°С в термостате с содержанием 5% CO₂ (CO₂ инкубатор WS-180CS, World Science, Корея). По достижении 80%-й конфлюэнтности в мембранные вставки для 12-луночного планшета (Corning, 6,5 мм, область роста 0,33 см², поры 0,4 мкм, каталожный номер 3413) вносились тестируемые объекты массой 25 мг и инкубировались 24 ч при 37°С с содержанием 5% CO₂ (табл. 1).

Таблица 1 Дизайн эксперимента

Время	Контроль	Дакрон	ПТФЭ
0 ч	HUVEC 0.1 х 10⁶	HUVEC 0.1 х 10⁶	HUVEC 0.1 х 10⁶
48 ч	ECGM	25мг дакрона	25мг ПТФЭ
72 ч	MTS/PMS	MTS/PMS	MTS/PMS
73,5 ч	Перенесение содержимого лунок в 96-луночный планшет для измерения оптической плотности

По истечению 24 ч мембранные вставки изымались из планшетов и проводилась экспозиция с реагентами MTS/PMS (Abcam, каталожный номер ab223881) в течение 1,5 часов при 37°С с содержанием 5% CO₂. По прошествии указанного времени полученные растворы (клеточный супернатант) с разной степенью окраски переносились в 96-луночные планшеты (Corning, каталожный номер 3599) для оценки оптической плотности на анализаторе (Stat Fax 3200 (microplate reader), Awareness technology Inc. Palm City Fl., США) при 490 нм (референсное значение – 640 нм); бралось не менее 5 проб из каждой лунки для исключения погрешности измерения (рис. 2).

Рис. 2. 96-луночный планшет с клеточным супернатантом после инкубации с MTS/PMS перед измерением оптической плотности

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программного обеспечения Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США).

Результаты и их обсуждение

Наименьшие средние значения оптической плотности в супернатанте отмечались в группе дакрона – 0,21 (0,2-0,22) единиц оптической плотности (EOП), наибольшие отмечены в группе контроля – 0,36 (0,35-0,38) EOП; показатели в группе ПТФЭ составили 0,35 (0,33-0,36) EOП. При сравнении исследуемых групп статистически значимые различия были обнаружены между группой контроля и дакрона (р<0,001), контроля и ПТФЭ (р=0,037), дакрона и ПТФЭ (р<0,001, рис. 3).

Рис. 3. Сравнение значений оптической плотности в исследуемых группах эксперимента по цитотоксичности

Примечание: все сравнения между группами статически значимы (р<0,05)

Анализ цитотоксичности подразумевает исследование возможности какого-либо материала оказывать влияние на жизнеспособность клеток, например, метаболическую активность, целостность клеточных мембран, клеточный рост. In vitro изучение цитотоксичности и/или жизнеспособности клеток имеет ряд преимуществ, таких как быстрота выполнения исследований, относительно невысокая стоимость, а также возможность использования человеческих клеток без рисков для здоровья пациентов; кроме того, in vitro использование клеточных линий, полученных от человека, может давать более точные данные, чем некоторые эксперименты на животных in vivo.

Существует большое количество методик, используемых для оценки цитотоксичности: 1) методики, исключающие использование каких-либо красителей / видов окрашивания; 2) колориметрические методы; 3) флуорометрические методы; 4) люминометрические методики. Использованный в рамках текущей работы MTS-тест, наряду с методиками MTT, XTT, WST-1, WST-8, LDH, SRB и NRU, относится к колориметрическим методикам [22].

MTS-тест представляет собой быструю, чувствительную и специфичную методику изучения цитотоксичности in vitro. Ограничением метода может служить влияние на результаты времени инкубации и типа клеток. Однако, результаты исследований показывают, что выбор оптимального времени воздействия MTS дает надежные результаты экспериментов [22].

MTS-тест может применяться для изучения цитотоксичности материалов, используемых в различных сферах медицины как при оценке прямого контакта с клетками, так и непрямого, например, с использованием мембранных систем [23]. Изучение цитотоксичности играет и важную роль в сердечно-сосудистой хирургии. Так, ведутся работы по изучению клапанных протезов на основе полиэтилена LLDPE, ПТФЭ, дакрона, бычьего и свиного перикарда, покрытых гиалуроновой кислотой, в рамках которых активно применялись методики оценки цитотоксичности (LDH-методика) [24].

В ходе проведенного авторами статьи эксперимента было показано, что наиболее высокую цитотоксичность в отношении клеток HUVEC показал дакрон: исследование оптической плотности супернатанта, полученного от клеток, инкубированных с данным материалом, продемонстрировало минимальные показали, что соответствует угнетению метаболической активности клеток на 41,7% по сравнению с группой контроля. Метаболическая активность клеток, подверженных воздействию ПТФЭ, была близкой к группе контроля (снижение оптической плотности не более, чем 2,8%), т.е. соответствовала оптимальным условиям функционирования эндотелиальных клеток in vitro.

Оценка цитотоксичности позволяет изучить реакцию клеток на воздействие различных материалов. Проведенная в рамках данного исследования работа по изучению цитотоксичности ключевых материалов, используемых в сосудистой хирургии, с применением MTS-теста на первичных человеческих эндотелиальных клетках пуповинной вены, представляющей собой удобный и доступный материал для in vitro исследований, показала, что возможна относительно простая и доступная лабораторная оценка влияния искусственных протезов на ключевые элементы сосудистой стенки. Данная методика воспроизводима, о чем свидетельствуют результаты повторных экспериментов.

Использованный в рамках данной работы подход может позволить рутинно изучать влияние различных условий внеклеточной среды, покрытий протезов, воздействия химических агентов, на метаболическую активность клеток, что может способствовать расширению знаний о процессах гемосовместимости, эндотелизации сосудистых протезов и гиперплазии интимы в условиях in vitro.

Выводы

Полиэтилентерефталат (дакрон) обладает цитотоксическим действием на первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека in vitro, существенно угнетая метаболическую активность клеток.
В сравнении с полиэтилентерефталатом (дакроном) политетрафторэтилен обладает минимальным повреждающим воздействием на эндотелиоциты in vitro.
MTS-тест может быть использован для рутинного лабораторного изучения влияния материалов, используемых при реконструктивных артериальных вмешательствах, на клетки сосудистой стенки in vitro.