Причины изменения длины конусно-стволового отдела эмбрионального сердца мыши в норме и при условии дегидратации материнского организма

Аннотация

В работе проанализированы гистогенетические перестройки конусностволового отдела эмбрионального сердца мыши (C57BL/6) в нормальных и экспериментальных условиях. В процессе исследования установлено, что причиной укорочения конусно-стволового отдела эмбрионального сердца является физиологическая задержка пролиферативной активности клеток миокардиальной манжетки.

Полный текст

Группа врожденных конусностволовых дефектов сердца у детей является первоочередной среди врожденных пороков сердца по возможностям комбинирования с другими пороками и вовлечения в состав субклинических персистирующих дефектов [2]. Большинство работ, посвященных аномалиям кардиогенеза, базируются на использовании моделей различных патологических состояний, тогда как влияние дегидратации материнского организма на гисто-генетические перестройки эмбрионального сердца остается открытым вопросом. При этом обезвоживание организма матери разной степени тяжести сопровождает ряд заболеваний первого триместра беременности (гестозы, экстрагенитальная патология). Сложность гистогенетических перестроек конусно-стволового отдела эмбрионального сердца на пути формирования магистрального сосудистого поля в достаточно короткий период времени обусловливает выбор именно этого отдела сердца для предпочтительной экспериментальной модели [5, 12]. Целью нашей работы было определить гистогенетические перестройки конусно-стволового отдела (КСО) сердца эмбриона мыши, которые лежат в основе изменения его длины на этапах формирования и развития производных в экспериментальных и нормальных условиях. Среди причин уменьшения длины КСО или «абсорбции луковицы» [4] на сегодня выделяют редукцию конденсированной мезенхимы или клеток нервного гребня путем апоптоза [7]; миокардиали-зацию подушек ствола и гребней конуса, что приводит к уменьшению миоидных клеток КСО [8]; гистогенетические перестройки миокардиальной манжетки. Материалы и методы В работе использовано 127 сердец эмбрионов мышей линии С56BL/6 в условиях нормы и 64 - в условиях дегидратации материнского организма, взятых в период с 10-о по 15-й день гестации (16-24 стадия по K. Theiler) [11]. Среди представленных патологических моделей обезвоживания организма была выбрана модель дегидратации в условиях перорального приема гиперосмолярного раствора. Согласно данным модели эксперимента M.J. McKinley с коллегами, выполненной именно на мышах линии С56BL/6, экспериментальным был выбран вариант введения раствора 0,3 моль/л NaCl с дальнейшей 7 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. водной депривацией [9]. В качестве обез-боливаливающего препарата был выбран тиопентал натрия (3-5 мг/кг в/м), животные умертвлялись путем декапитации. Материал фиксировали в растворе 10%-ного забу-ференого формалина, обезвоживали и заливали в парапласт. Серийные срезы толщиной 5, 7 мкм окрашивали гематоксилином-эозином и по Стидмену. Для создания трехмерных моделей использовали программное обеспечение Photoshop CS5 (подготовка фотографий), Amira for microscopy 5.0 (создание и измерение контуров), 3ds max 8.0 (окончательная обработка и визуализация). Реконструкцию проводили согласно рекомендациям [4]. Для выявления степени пролиферативной активности ядер отдельных клеточных популяций КСО был выбран маркер - моноклональные антитела Ki-67, клон Sp6. Для определения гладких миоцитов КСО использовался маркер а-глад-комышечного актина (aSMA). Иммуногистогимические реакции проводились с использоанием системы визуализации LSAB (Labelled Streptavidin Biotin) (LabVision). Были использованы гистологические, морфометрические [1], стереологи-ческие, иммуногистохимические, биометрические методы [3], а также трехмерное компьютерное моделирование. Результаты и их обсуждение Исследования показали, что длина КСО на 10-й день (16 стадия по Тейлеру) эмбриогенеза составляла 301±25 мкм. При этом индекс пролиферации ядер миоцитов миокардиальной манжетки равнялся 22,4±3,4%, тогда как пролиферативный индекс ядер кардиомиоцитов правого желудочка 23,6±2,5%. В срок 10,5 суток кардиогенеза (стадия 17 по Тейлеру) КСО достоверно удлинялся на 28,4%, в сравнении с предыдущей стадией. Начинался манжетковый этап миокардиализации. Согласно результатам исследования N. Okamoto с коллегами термин «миокардиализация» трактовался, как начало трансдифференцировки миоцитов миокардиальной манжетки в мезенхимные клетки - миокардиально мезенхимная дифференциация [4]. В ходе нашего исследования о начале данного этапа свидетельствовало появление в кардиогеле подушек ствола эмбрионального сердца популяции клеток с положительной реакцией маркера a-SMA (a-SMA+). Индекс пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки повышался на 24,0% (р<0,05) в сравнении с предыдущей стадией, но все равно его значение в сравнении с аналогичным значением кардиомиоцитов правого желудочка было достоверно сниженным (рис. 1). На 11 -й день (стадия 18 по Тейлеру) эмбриогенеза длина КСО увеличивалась на 27,2% (р<0,05), при этом длина левой подушки ствола и переднего конусного гребня значительно превышала длину противоположных эмбриональных структур КСО (рис. 2). Данный отдел сердца в течении 11-х суток достигал максимальной длины 357,6±31,1 мкм. Индекс пролиферации ядер мезенхимных клеток структурных компонентов КСО достоверно возрастал на 33,3%, кардиомиоцитов правого желудочка - на 27,5% (р<0,05). Пролиферативный индекс ядер миоцитов миокардиальной манжетки на данном сроке достоверных отличий от соответствующего показателя на предыдущей стадии не имел. На этом гестационном сроке продолжалась мио-кардиализация стволовых подушек, а именно ее манжетковый этап. В субэндо-кардиальном пространстве структурных компонентов ствола начинали появляться a-SMA+ клетки. Это свидетельствовало о начале субэндокардиального этапа мио-кардиализации. К середине 11 -х суток (стадия 19 по Тейлеру) эмбрионального развития КСО сердца начинал сокращение в длине, укорачиваясь на 28,1% (р<0,05) в сравнении с предыдущим сроком. Индекс пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки в сравнении с аналогичным показателем кардиомиоцитов правого желудочка начал стремительно и достоверно уменьшаться, составляя значении в 2 раза меньше. Мио-кардиализация структурных компонентов КСО продолжалась. Манжетковый этап 8 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Рис. 1. Трехмерные модели эмбрионального сердца мыши (А, В) и конусно-стволового отдела (Б, Г) на 10-й и 11 -й дни эмбриогенеза. Стрелкой указан конусно-стволовой изгиб Рис. 2. Гистологический срез стволового отдела эмбрионального сердца мыши, 10,5 день гестации. Иммуногистохимическая реакция, маркер Кі-67, доокрашивание гематоксилином Майера. А - *100; Б, В - *400. В - инверсированное изображение реакции характеризовался значительным уменьшением и истончением миоидных клеток, тогда как a-SMA+ популяция расширялась в сторону аортопульмонального септационного комплекса, преимущественно над его подковой. a-SMA+ конусная популяция расширялась с появлением миоидных комплексов при трабекулярном миокарде конусных гребней. Таким образом, инициировался трабекулярный этап миокардиализации эндокардиаль-ных структур данного отдела сердца. На 12-е сутки (стадия 20 по Тейлеру) гестации укорачивание КСО продолжалась, и его нынешняя длина составляла 369±41,2 мкм. Миокардиализация структурных компонентов ствола продолжалась и осуществлялась уже в три полноценные стадии: манжетковую, субэндокар-диальную и септационную. На этом строке, a-SMA+ клетки наблюдались среди конден-сованной мезенхимы субэндотелиального пространства новообразованных сосудов. Согласно исследованиям [4], артериализация стенок магистральных сосудов в процессе их гистогенеза проявлялась транс-дифференцировкой мезенхимы в гладкие миоциты медии крупных сосудов. В ходе нашего исследования определялось, что 9 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. начало этого гистогенетического процесса наблюдалось в конце септационного и на протяжении субэндотелиального этапов. Следовательно, нам удалось установить, что последние два этапа миокардиализации структурных компонентов ствола эмбрионального сердца можно назвать артериализа-цией стенок магистральных сосудов. Данный процесс рассматривается в ряде литературных источников либо как продолжение [6], либо как часть миокардиализации [10]. В период 12,5 сут эмбриогенеза (стадия 21 по Тейлеру) показатели длины структурных компонентов КСО продолжали стремительно падать, достоверно уменьшая общую длину КСО на 28,9% (р<0,05). Пролиферация миоцитов миокардиальной манжетки задерживалась на том же уровне. aSMA+ популяция конусных гребней расширялась в виде появления субтрабекулярного слоя миоидных клеток, которые имели меньшую интенсивность реакции и большую степень компактизации, чем подлежащий трабекулярный конусный миокард. Над субтра-бекулярным слоем определялись комплексы миоидных клеток. Артериализа-ция стенки новообразованных сосудов набирала обороты, наиболее интенсивно проявляясь на субэндотелиальном этапе. С 13 -х гестационных суток (стадия 22 по Тейлеру) длина КСО продолжала достоверно уменьшаться за счет очевидного сокращения длины стволовых подушек. Верхние 2/3 данных подушек трансформировались в интраперикардиальные части аорты и легочного ствола, а нижняя 1/3 - в зону полулунных клапанов. aSMA+ клетки бывшей стволовой части наблюдалась в составе субэндотелиальной и частично септационной фракций. aSMA+ конусная клеточная популяция расширялась в дорсо-вентральном направлении. На протяжении 14-х эмбриональных суток (стадия 23 по Тейлеру) окончательно сокращалась длина КСО отдела, за счет редукции конденсированной мезенхимной популяции путем апоптоза. aSMA+ субэн-докардиальная конусная клеточная фракция передвигалась на проводящие края обоих гребней, заполняя полностью их субэндо-кардиальное пространство. На 15-й день эмбрионального развития (стадия 24 по Тейлеру) КСО как промежуточная эмбриональная структура завершал свое существование за счет того, что участок конусных гребней полностью приближался по строению к частям стенок выхода магистральных сосудов из соответствующих желудочков. Изменение качественных особенностей гистогенетических перестроек КСО, которые влияют на показатели его длины в экспериментальных условиях, в ходе нашего исследования были опровергнуты. Количественные показатели в условиях дегидратации материнского организма также не имели достоверных отличий с соответствующими нормальными показателями. Итак, причиной уменьшения длины КСО определялась физиологическая задержка пролиферации миоцитов миокардиальной манжетки. Данная манжетка, не увеличиваясь, сдерживала удлинение КСО. В ходе исследования было установлено, что уменьшение пролиферативной активности миоцитов миокардиальной манжетки было обусловлено их активным участием в процессах миокардиализации структурных компонентов конуса и ствола. Выводы 1. Манжетковый этап миокардиализа-ции подушек ствола сменяет субэндокар-диальный на 11 -е сутки эмбрионального развития. Миокардиализация конусных гребней проходит трабекулярный и субэндокар-диальный этапы, которые начинаются на 11,5 день гестации и продолжаются два дня. 2. Артериализация стенок новообразованных магистральных сосудов проходит септационную и субэндотелиальную стадии. Являясь отдельным этапом гистогенеза КСО, артериализация следует за миокардиализацией. 3. Пролиферативный индекс ядер мио-цитов миокардиальной манжетки достоверно снижен в сравнении с соответствующим показателем ядер кардиомиоцитов правого желудочка на протяжении гистогенетических перестроек КСО эмбрионального сердца.