Разработка ВЭЖХ методики количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината в плазме крови крыс и кроликов

Аннотация

Разработана методика количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием в плазме крови кроликов и крыс. Методика характеризуется высокой точностью, воспроизводимостью, простотой выполнения и быстротой анализа.

Полный текст

Оценка динамики плазменной концентрации лекарственных веществ является существенным разделом анализа их фармакокинетики, позволяющим выявить особенности абсорбции, характера распределения, метаболизма и экскреции. Подобные исследования проводятся как на доклиническом этапе разработки лекарственных средств, так и на этапе их клинической апробации, а также после выпуска препарата на рынок с целью оптимизации фармакотерапии [4]. 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат («Мексидол», ООО НПК «Фармасофт», Россия) - оригинальный отечественный синтетический антиоксидант и антигипоксант, обладающий высокой биологической активностью. Наиболее выраженный терапевтический эффект этилметилгидроксипириди-на сукцинат оказывает при сосудистых и дегенеративных заболеваниях головного мозга, таких как ишемический и геморрагический инсульты, транзитор-ная ишемическая атака, дисциркулятор-ная энцефалопатия, болезни Альцгеймера и Паркинсона, травмы головного мозга, судорожные состояния, стрессы, алкогольная энцефалопатия [2]. Для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии c использованием этилметилгидроксипиридина сукцина-та актуально дальнейшее исследование особенностей его фармакокинетики: механизмов проникновения в головной мозг через гематоэнцефалический барьер, распределения в различных отделах головного мозга, принадлежности к субстратам, индукторам, ингибиторам семейства цитохромов P450 и белков-транспортеров [7, 9]. В связи с использованием кроликов и крыс в качестве тест-систем для фармакокинетических исследований на доклиническом этапе целью настоящего исследования являлась разработка методики количественного определения этилметилгидрокси-пиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Материалы и методы Исследование выполнено на 15 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500-4300 г, полученных из питомника ООО «Касимов-Миакро» и 30 половозрелых крысах-самцах Wistar массой 220-300 г, прошедших карантинный режим вивария Рязанского государствен- 62 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. ного медицинского университета. В ходе эксперимента животных содержали в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты при температуре 22-24оС, естественном освещении, на подстилках из опилок деревьев лиственных пород. Кормление осуществляли ad libitum, в первой половине дня при свободном доступе к воде. Накануне забора крови животных лишали пищи при свободном доступе к воде. Экспериментальные исследования осуществляли в соответствии с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н). Кроликам этилметилгидроксипири-дина сукцинат (препарат «мексидол», ООО НПК «Фармасофт», Россия) вводили per os в дозе 3 таблетки/кролик (в среднем 100 мг/кг массы) [8], крысам - в дозе 200 мг/кг [6]. Через 15 мин; 30 мин; 1; 1,5; 2; 3; 4 и 5 часов после введения препарата у животных забирали кровь в объеме 2,5 мл из ушной вены (у кроликов) или брюшной вены (у крыс под эфирным наркозом) для определения концентрации этилметилгидроксипири-дина сукцината (действующего вещества мексидола). Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученную плазму хранили при -29°С до последующего анализа. Результаты и их обсуждение Концентрацию этилметилгидрокси-пиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс определяли в изократиче-ском режиме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием по оригинальной методике. В работе использовали субстанцию этилметилгидроксипиридина сукцината, предоставленную фирмой-производителем («Фармасофт»). Матричный раствор этилметилгидроксипиридина сукцината с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием метанола (ч. д. а.), из которого готовили растворы стандартных образцов. Для экстракции и элюирования использовали вещества категорий «ХЧ», и «Для хроматографии»: этилацетат («ACROS ORGANICS»), ацетонитрил («ACROS OR-GANICS»), триэтиламин («ACROS ORGANICS»), кислота ортофосфорная («ХИМ-МЕД»), вода деионизированная. Для экстракции этилметилгидроксипиридина сукцината к 1 мл плазмы крови кроликов или крыс добавляли 3 мл этилацетата, встряхивали на приборе Vortex (Elmi, Латвия) и помещали на встряхиватель для пробирок «Shaker» (Elmi, Латвия) на 10 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Органический слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе (Heidolph instruments, Германия). Сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы и 100 мкл раствора вводили в хроматограф. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Beckman Coulter» (США), оснащенном авто-самплером «Rheodyne» (США) и УФ спектрофотометрическим детектором «Beckman Coulter» (США) при длине волны 296 нм в изократическом режиме. При анализе использовали хроматографическую колонку - Beckman Coulter (США) 4,6*150 мм (зернение 5 мкм). Температура разделения - 28°С. Скорость потока - 0,5 мл/мин. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды в объемном отношении 20:80 с добавлением триэтиламина до объемной доли 0,05% и ортофосфорной кислоты до pH 4,5. Время удерживания этилметилгидроксипиридина сукцината в данных условиях составило 18,1 мин. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Калибровочную кривую получали в результате анализа проб плазмы крови кроликов или крыс с добавками известных количеств стандарта определяемого соединения. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 100 - 1000 нг/мл. Данная зависимость для кроликов и крыс описывалась следующими уравнениями: Кролики: C = 10,9747+1,3717*105*h (r = 0,9948), 63 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Крысы: С = 1,6922+1,3796*105*h (r = 0,9926), где h - высота хроматографического пика, С - концентрация этилметилгид-роксипиридина сукцината (нг/мл). Соответствующие калибровочные графики зависимости высоты пика этил-метилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови кроликов и крыс представлены на рисунках 1 и 2. Экстинкция Рис. 1. Калибровочный график зависимости высоты пика этилметилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови кроликов Экстинкция Рис. 2. Калибровочный график зависимости высоты пика этилметилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови крыс Образцы полученных хроматограмм представлены на рисунках 3-4. Пики этилметилгидроксипиридина сукцината отделены от пиков эндогенных соединений, что позволяет достоверно определить исследуемое вещество. Предел количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината для плазмы крови кроликов и крыс составил 40 нг/мл и 20 нг/мл соответственно. 64 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Рис. 3. Хроматограмма пробы интактной плазмы крови кролика Рис. 4. Хроматограмма пробы плазмы крови кролика при однократном введении этилметилгидроксипиридина сукцината В доступной литературе нами обнаружено несколько ВЭЖХ-методик определения концентрации этилметилгидроксипиридина сукцината. В отличие от методики, описанной П.А. Барановым и соавт. (2009) [3], в нашей работе мы применяли не масс-спектрометрический, а более доступный УФ-способ детектирования, а также жидкостную экстракции вместо твердофазной, что позволяет существенно удешевить метод исследования. По сравнению с методиками А.К. Сариева и др. (2005) [5] и С.Б. Середенина и соавт. (2005) [1] использована более простая подготовка проб и изменен состав подвижной фазы. Выводы Разработана хроматографическая методика количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс, характеризующаяся высокой точностью, воспроизводимостью, простотой выполнения и быстротой анализа.