EPITHELIAL AND STROMAL COMPONENTS IN DUCTAL BREAST CANCER

Full Text

В настоящее время большинство научных работ сосредоточено на изучении эпителиально-стромальных взаимоотношений играющих важную роль в прогрессии эпителиальных опухолей в сторону дедифференцированного, т.е. более злокачественного фенотипа [2, 7, 8]. Рак молочной железы (РМЖ) - является агрессивным заболеванием [3]. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в изучении протокового рака молочной железы и развитии подходов к его хирургическому и комбинированному лечению, выживаемость больных остается на низком уровне [10]. Одной из причин этого является выраженная десмо-пластическая реакция стромы опухоли, составляющая до 70-80% объема опухолевой ткани [2, 4, 6, 11], проявляющаяся гиперэкспрессией белков внеклеточного матрикса и пролиферацией миофибробластов [2, 4, 5]. Ряд исследований подчеркивают важную роль развитой десмопла-стической стромы РМЖ, в «защите» от химиотерапии опухоли и/или увеличении риска метастазирования опухолевых клеток [10, 17, 23]. При РМЖ, так же как и при других опухолях, значительная роль в прогрессии опухоли отводится одному из ключевых моментов - эпителиальномезенхимальному переходу (ЭМП) [1, 8, 21]. Известно, что утрата полярности клеток в карциномах ведет к изменению их цитоскелета, при этом одним из признаков ЭМП является утрата клетками цито-кератиновых промежуточных филаментов и приобретение виментиновых. Также, ЭМП сопровождается изменением профилей транскрипции генов, в том числе компонентов цитоскелета и внеклеточного матрикса, а также протеолитических 99 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. ферментов, участвующих в деградации последнего [11, 12, 15]. Фенотипические изменения ЭМП включают снижение экспрессии белков эпителиальных маркеров (таких как Е-кадгерин, десмоплакин и др.) и появление и/или усиление экспрессии белков мезенхимальных маркеров (виментин, фибронектин, гладкомышечный актин и др.) [14, 16, 20, 21, 22]. Изменение микроокружения и утрата полярности могут способствовать снижению дифференцировки опухолевых клеток [12, 18], однако полной утраты тканеспецифических свойств никогда не происходит - при потере дифференцировки эпителиальные опухоли продолжают сохранять часть признаков исходной ткани и способность к редифференцировке [9, 13]. Кроме того, в процессе утраты диф-ференцировки опухолевых клеток может происходить возобновление синтеза эм-бриоспецифических белков, характерных для незрелых клеток [5, 13]. Цель нашего исследования - изучение морфологических свойств анапласти-ческих участков опухоли и окружающей стромы при протоковом раке молочной железы. Материалы и методы Выполнен анализ операционного материала от 118 больных протоковым РМЖ, находившихся на лечении в медицинских учреждениях г. Москвы в период с 2009 по 2015 гг. Возраст больных колебался от 40 до 80 лет. Средний возраст пациенток - 61 год. Материал фиксировали в 10% забу-ференном растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 2 мкм по стандартой методике с применением следующей панели поликлональных антител: р63, гладкомышечный актин (ГМА), общий цитокератин, цитокератин 7, виментин, Е-кадгерин (Dako, Lab Vision Flex). Интенсивность пероксидазной метки для каждого цитоплазматического маркера оценивали полуколиче-ственным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Иммуногистохими-ческая реакция оценивалась как негативная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умеренная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и выраженная («+++» ->50% клеток высокой интенсивности окраски). Для проведения ИГХ-реакции применялась техника tissue microarrays (TMA), сконструированная в формате multitumor arrays. Данная модель состояла из 24 образцов первичной опухоли от разных больных, при этом от одного больного использовались образцы с разной степенью дифференцировки опухолевых клеток. Таким образом, это позволило осуществить скрининг определенного молекулярного повреждения во всем разнообразии представленных опухолей с наименьшей затратой реактивов и времени. Для получения цветного изображения использовали сканер Mirax desk (Zeiss). Силу и значимость связи между анализируемыми признаками оценивали с помощью корреляционного-регрессион-ного анализа. Для количественных признаков вычисляли корреляционный коэффициент Пирсона. За уровень статистической значимости принимали р<0,05. Результаты и их обсуждение Макроскопически протоковый рак молочной железы имеет вид узла неправильной формы без четких границ, размерами от 2 до 10 см, на разрезе матового белесовато-серого или беловато-желтого цвета, плотноватой консистенции. Нередко в центре опухоли можно обнаружить очаги распада с формированием полостей различной формы. Микроскопически в большинстве случаев 78,8% (93/118) опухоль представлена железистыми структурами неправильной формы, выраженной десмопластической реакцией стромы, как правило, занимающей большой процент площади опухолевой массы (от 50-80%). Однако, в 21,2% (25/118) случаев в классическом гистологическом варианте 100 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. протокового РМЖ в опухоли наряду с железистыми структурами обнаружен анапластический (саркомо-подобный) компонент, представленный крупными полиморфными или веретенообразными клетками с гиперхромными ядрами, иногда многоядерными, с минимальным стромальным компонентом (рис. 1 а,б). Рис. 1а,б. Светооптическая характеристика протокового рака молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. х 100 Объем анапластического компонента разнился и составил от 5 до 20% общей массы опухоли, но во всех случаях не являлся преобладающим. При проведении ИГХ реакции обнаружены различия в экспрессии маркеров в железистом и анапластическом компонентах протокового РМЖ. Так, выраженная экспрессия гладкомышечного актина (+++) отмечена только в десмопластиче-ской строме, окружающей железистые структуры. В опухолях с анапластиче-ским компонентом также отмечена выраженная положительная реакция с ГМА, выявленная как в гладкомышечных волокнах, так и в единичных крупных ана-пластических опухолевых клетках. Помимо этого, как в строме, так и в эпителиальном анапластическом компоненте отмечена выраженная диффузная реакция с виментином (+++) (рис. 2.), отсутствующая в железистых структурах (рис. 3). Рис. 2. Экспрессия виментина в недифференцированном компоненте. Иммуногистохимическая реакция Ув. ><100 101 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. Рис. 3. Экспрессия виментина в железистом компоненте. Иммуногистохимическая реакция Ув. »200 Одновременно в отдельных анапла-стических клетках отмечалась потеря экспрессии общего цитокератина и цитокератина 7 при сохраненной экспрессии эпителиально-мембранного антигена. Также, в ядрах анапластических клеток отмечена положительная реакция с маркером базальных стволовых клеток р63. В опухолях без анапластического компонента, процент окрашенных ядер с анти телами к р63 был ниже и представлен единично окрашенными ядрами по периферии железистых структур. Также при раке молочной железы происходила редукция экспрессии белка Е-кадгерина и изменение полярности его экспрессии, а именно исчезновение мембранного окрашивания и появление цитоплазматического с разной степенью интенсивности (рис. 4). Рис. 4. Экспрессия белка Е-кадгерина в протоковом РМЖ. Иммуногистохимическая реакция Ув. »100 В опухолевых клетках железистых структур РМЖ в 66,7% (62 из 93 случаев) наблюдалась умеренно-выраженная (++) цитоплазматическая экспрессия данного белка; в 30,1% (28/93) - выраженная цитоплазматическая (+++). Мембранная реакция наблюдалась только в 3,2% (3/93) случаев. В анапластическом компоненте во всех случаях отмечена отрицательная как мембранная, так и цитоплазматическая экспрессия белка Е-кадгерина (рис. 5). 102 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. ' » . *- * 1 * ' v\, , * г * > . ' V ' < • "ш* -У > > ypt''f-У . . *^,3/«, ; /t .0. - і - Рис. 5. Отрицательная мембранная и цитоплазматическая экспрессия белка Е-кадгерина в анапластическом протоковом РМЖ. Иммуногистохимическая реакция Ув. *200 Заключение Классический вариант протокового РМЖ по своей гистологической структуре, как правило, неоднородная опухоль, представленная полями различной диф-ференцировки от высокой до низкой, включая анапластический компонент. В исследуемой серии анапластический компонент присутствовал в 21,2% (25/118) случаев. По нашему убеждению, его необходимо выделять даже при минимальном его объеме от общей массы опухоли, поскольку опухоли с анапластиче-ским компонентом имеют не только различия в гистологическом строении, но и в злокачественном потенциале, а также по экспрессии эпителиальных, миоэпители-альных и мезенхимальных иммуно-гистохимических маркеров. Гистологически десмоплазия стромы, которая характерна для протокового РМЖ, полностью отсутствует в анапла-стических участках. Опухолевые клетки, плотно располагаясь, друг к другу как бы создают «стромальный каркас» из самих себя. Кроме того, выявленная в анапла-стических клетках диффузная экспрессия с виментином, гладкомышечным актином и р63 подтверждает, что в процессе потери дифференцировки опухолевые клетки приобретают миоэпителиальный и/или мезенхимальный фенотип. Данный факт, вероятно, связан с эпителиальномезенхимальным переходом в опухоли, основными критериями которого, являются утрата эпителиальной полярности, разделение на отдельные клетки и дисперсия при приобретении клеточной подвижности. При этом происходит разрушение плотных адгезионных контактов (редукция и изменение полярности экспрессии Е-кадгерина) и реорганизация комплексов, обеспечивающих прикрепление клетки к субстрату. Однако частично сохраненная экспрессия цитокератинов и эпителиально-мембранного антигена свидетельствует о сохранении цитокеартино-вых рецепторов и возможной обратной трансформации при изменении микроокружения. По данным некоторых авторов показано, что ингибирование трансформирующего фактора роста - ß в раке может приводить к обратному мезенхимальноэпителиальному переходу и потере мезенхимального и восстановлению эпителиального фенотипа [4, 6, 8, 12]. Таким образом, возрастающий интерес исследователей к эпителиально-стромальным взаимодействиям в протоковом РМЖ обусловлен его агрессивным биологическим поведением, резистентностью к химиотерапевтическому лечению и различной выживаемость в зависимости от дифференцировки опухоли. Гетеро 103 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2015 г. генность протокового рака проявляется в появлении анапластического (саркомоподобного) компонента, в котором прослеживается способность эпителиальных опухолевых клеток приобретать свойство мезенхимальных клеток, не требующих стромы и обладающих агрессивным злокачественным потенциалом, влияющем на выживаемость больных.

References

Supplementary files