Действие полисахарида крапивы двудомной на физическую работоспособность животных, процессы фагоцитоза и резистентность мембран эритроцитов

Аннотация

Из травы крапивы двудомной выделен полисахаридный комплекс, установлен качественный и количественный моносахаридный состав, изучено его влияние на физическую работоспособность, процессы фагоцитоза, осмотическую, термическую и перекисную резистентность мембран эритроцитов.

Полный текст

Поиск препаратов растительного происхождения, стимулирующих физиологические функции организма, является приоритетным направлением научных исследований. Природные полисахариды растительного происхождения при попадании в организм здорового животного оказывают стимулирующее воздействие на иммунную систему, активируют ферментные системы клеток, усиливая синтетические и защитные функции организма, повышают количество эритроцитов и гемоглобина в крови за счет активации гемопоэза [3]. Повышение синтетической активности тканей и органов, а также усиление притока кислорода способствует повышению уровня обмена веществ и как следствие приводит к повышению физической работоспособности организма. Целью работы явилось изучение качественного и количественного состава полисахаридного комплекса крапивы двудомной и его влияние на физическую работоспособность, процессы фагоцитоза и резистентность мембран эритроцитов. Материалы и методы Из предварительно очищенного 80% раствором этанола воздушно-сухого сырья 1,5 часовой водной экстракцией на кипящей водяной бане выделяли водорастворимый полисахаридный комплекс (ВРПК). Пектиновые вещества извлекали из шрота, оставшегося после получения ВРПК 1% раствором щавелевокислого аммония в соотношении 1:10 на водяной бане при температуре 800 С в течение 1 часа и повторяли три раза для полного выделения пектинов. Полисахариды осаждали избытком 96% этанола. Осадки полисахаридов промывали несколько раз 96% этанолом, ацетоном, эфиром, очищали диализом и переосаждением [2]. Качественный и количественный моносахаридный состав полисахаридов определяли после 9-часового гидролиза 1 н. серной кислотой. Идентификацию моносахаридов проводили методом нисходящей бумажной хроматографии в системе бутанол-1-уксусная кислота-вода (4:1:5). Нейтральные сахара проявляли анилинфталатом. Количество уроновых кислот определяли комплексонометриче-ским методом [1]. Удельную вязкость водного раствора полисахаридного комплекса крапивы двудомной определяли вискозиметриче-ским методом на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,54 мм. Значение характеристической вязкости было опре 153 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. делено графическим методом. Константы для полисахаридов были установлены нами, исходя из имеющихся в литературе данных по определению средней молярной массы амилозы разных сортов риса вискозиметрическим методом [9]. рН водных растворов полисахарида определяли при помощи лабораторного рН - метра рН -150МИ. Изучение влияния полисахаридного комплекса на физическую работоспособность выполняли на 40 крысах-самках линии Wistar массой 200-250 грамм, содержащихся в стандартных условиях вивария. Полисахаридный комплекс для биологических исследований растворяли в физиологическом растворе, получали 5% раствор. Для изучения влияния полисахарида на физическую работоспособность и на изменение массы тела животных препарат вводили животным 1 раз в сутки в дозе 0,1 г/кг массы тела животных per os в течение 25 дней (n=20). Контрольные животные получали в те же сроки равный объем физиологического раствора (n=20). Исследование физической работоспособности проводили на 1,5,10,15,20,25 сутки введения препарата и на 7 день отмены для оценки последействия. В эти же сроки определяли массу тела животных. Физическую работоспособность крыс оценивали при помощи экспериментальной модели плавания. Для этого к задней лапке животного привязывали груз массой 10% от массы тела животного. Животное с грузом помещали в стеклянный цилиндр диаметром 18 см с высотой водного столба 40 см (температура воды поддерживалась в пределах 29-300С) и отмечали время плавания животного на поверхности воды [4, 6]. Исследования действия полисахаридов на фагоцитоз и резистентность мембран эритроцитов проводили in vitro с кровью здоровых доноров. Для этого к десяти миллилитрам крови добавляли 0,025 мл 5% раствора полисахарида, приготовленного на физиологическом растворе, а в контрольные пробирки с кровью - равный объем физиологического раствора. Все пробы выдерживали в тер мостате при 370С в течение 1,5 часов, затем добавляли культуру бифидобактерий и выдерживали в термостате при той же температуре еще 1,5 часа. По окончании термостатирования готовили мазки, которые фиксировали и окрашивали по Рома-новскому-Гимзе, и считали процент фагоцитировавших клеток - показатель фагоцитарной активности и среднее количество микробов в каждой клетке с учетом всех опытов - фагоцитарное число. Определяли количество микробных тел, подвергшихся разрушению в одном фагоците - индекс завершенности фагоцитоза [7]. Для исследования влияния полисахарида крапивы на осмотическую резистентность мембран эритроцитов готовили 0,9% раствор хлорида натрия на фосфатном буфере с рН 7,4, из которого составляли серию разведений с концентрациями 0,85; 0,75; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40%. Ко всем растворам добавляли по 0,1 мл крови здорового донора в контрольных образцах и по 0,1 мл крови с полисахаридом в дозе 1*10-4 в опытных. Все пробы выдерживали 30 мин при 370С в термостате, а затем определяли степень гемолиза на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 500 нм и светофильтре №5 [8]. Для изучения действия полисахарида на перекисную резистентность мембран эритроцитов в опытные пробы с 5 мл физиологического раствора на фосфатном буфере добавляли по 0,1 мл крови с полисахаридом в дозе 1*10-4, а в контрольные - по 0,1 мл крови без полисахарида. Все пробы выдерживали в термостате 30 мин, а затем в каждую вносили 3,75% раствор пероксида водорода. Степень гемолиза определяли на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 500 нм и светофильтре №5 [8]. Для определения термической резистентности пробы крови с полисахаридом и контрольные помещали в термостат и нагревали до температур 52, 54, 56, 58, 60, 62 и 640С. При достижении каждой температуры пробирки выдерживали 3 -5 минут, центрифугировали и степень гемолиза определяли как указано выше [8]. 154 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математикостатистической обработке с использованием программы Statistica 6.0. Характер распределения данных определяли с помощью критерия Шапиро - Уилка. Для установления статистически достоверных межгрупповых различий применяли критерий Манна - Уитни [5]. Достоверными считали различия при значении р< 0,05. Результаты и их обсуждение Суммарный выход полисахарида, полученного из стандартизированного воздушно-сухого сырья крапивы двудомной по описанной выше методике, соста- Моносахаридный состав полисаха вил 12%. Полисахарид, впервые выделенный нами, представляет собой аморфное вещество светло-серого цвета, без специфического запаха, хорошо растворимое в воде и физиологическом растворе. Методом кислотного гидролиза в сочетании с бумажной хроматографией был установлен качественный и количественный состав нейтральных моносахаридов полисахарида травы крапивы двудомной и общее количество уроновых кислот. Большое количество уроновых кислот в составе полисахарида дает возможность отнести его к классу пектинов. Полученные данные представлены в таблице 1. Таблица 1 ов травы крапивы двудомной (в %) Название растения уроновые кислоты глюкоза галактоза арабиноза ксилоза рамноза Крапива двудомная 84,6 З1,9 22,1 28,1 4,6 15,3 рН 5% водных растворов полученных полисахаридов находится в пределах 4,68-4,72. Значение средней молярной массы полисахаридов, полученное вискозимет-рическим методом, составило 6,4·103, что приблизительно соответствует среднемассовому значению. Введение крысам полисахаридного комплекса приводило к изменениям общего состояния животных. У них повышался аппетит, улучшался внешний вид, лоснилась шерсть, животные становились более спокойными. Под влиянием введения полисахарида увеличивалось время плавания животных по сравнению с контролем, что происходило на протяжении всего времени эксперимента. При введении полисахарида в течение 5 дней время плавания подопытных животных увеличивается незначительно. На 10 сутки введения полисахарида время плавания подопытных крыс максимально превосходит время плавания контрольных животных на 20,6% (p<0,05). К 15 суткам эксперимента происходит снижение физической работоспособности экспериментальных животных. На 20 и 25 сутки опыта физическая работоспособность контрольных и опытных животных практически не отличались друг от друга. По окончании срока последействия препарата (7 суток) физическая работоспособность возрастает как у контрольных - на 18,6% (p <0,05), так и у подопытных крыс - на 28,7% (p<0,05) (рис. 1). Введение полисахарида способствует нарастанию массы тела подопытных животных в течение всего времени проведения эксперимента. Максимальный прирост массы тела подопытных животных наблюдался на 25 сутки эксперимента и составил 11,3% (p<0,05). Прирост массы тела контрольных крыс к этому времени - 6,3% (p<0,05). С момента прекращения введения препарата подопытным животным за время последействия (7 суток) масса тела не изменялась и оставалась на прежнем уровне, незначительно превосходя массу контрольных крыс (рис. 2). 155 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. 2,5 Рис. 1. Влияние ВРПК на физическую работоспособность Рис. 2. Изменение массы тела при приеме ВРПК в дозе 0,1г/кг массы тела Под действием полисахарида процент фагоцитоза повышался незначительно, а фагоцитарное число увеличилось на 21% (p<0,05) по сравнению с контролем, что свидетельствует об активации процесса фагоцитоза и увеличении поглощенных микробных тел одним фагоцитом. Незначительно повышался индекс завершенности фагоцитоза по отношению к контролю, что, скорее всего, связано с небольшой активацией ферментных систем фагоцитов. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Таблица 2 Влияние полисахаридов травы крапивы двудомной на процессы фагоцитоза % Фагоцитоза Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс Препарат контроль (п=6) опыт (п=6) контроль (п=6) опыт (п=6) контроль (п=6) опыт (п=6) ВРПК крапивы двудомной 60,3 66,1 3,8±0,19 4,5* 1,09 1,12 (4,1;5,1) (1,05;1,10) (1,11;1,15) * Примечание: здесь и далее - статистически достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05). Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. Добавление раствора полисахарида крапивы двудомной объемом 0,025 мл к 10 мл крови здорового донора приводило к снижению процента гемолизированных клеток в опытных пробах по сравнению с контрольными. Особенно значительно снижается количество разрушенных клеток при температурах 580С и 600С, когда Изучение влияния полисахарида крапивы на осмотическую резистентность мембран эритроцитов показало, что в опытных пробах количество гемолизиро-ванных клеток меньше, чем в контрольных образцах. В растворах с концентрацией хлорида натрия 0,5% и 0,45% про Добавление полисахарида к крови здорового донора показало, что препарат защищает мембраны эритроцитов от процесса перекисного окисления липидов. Процесс гемолиза уменьшается в 3,5 раза по сравнению с контролем (p<0,05). Выводы 1. Из травы крапивы двудомной впервые выделен полисахарид, относящийся к классу пектинов. 2. Введение полисахарида достоверно увеличивает физическую работоспособность подопытных животных по сравнению с контролем на 10 сутки эксперимента. 3. Введение полисахарида крапивы двудомной повышает массу эксперимен процент гемолиза в опытных пробах в 3,4 и в 2,74 раза (p<0,05) соответственно ниже, чем в контроле. При 620С процент гемолиза в пробах с полисахаридом в 1,3 раза (p<0,05) ниже, чем в контроле, а при 640С гемолиз и в контроле, и в опыте практически достигает 100%. Все данные представлены в таблице 3. цент гемолиза в опытных образцах снижается на 15,8% (p<0,05) и 19,3% (p<0,05) соответственно. В растворах с концентрацией хлорида натрия 0,4% наблюдается практически полный гемолиз как в контроле, так и в опыте (табл. 4). тальных животных на 25 сутки эксперимента по сравнению с контролем. 4. Добавление полисахарида к крови здорового донора приводит к повышению фагоцитарного числа лейкоцитов по отношению к контролю. 5. Введение полисахарида крапивы двудомной повышает термическую, осмотическую и перекисную резистентность мембран эритроцитов донорской крови.