The ifluens of new oxypyridine derivative on the development of toxic hepatitis

Abstract

In conditions of experimental toxic lesion of the liver, hepatoprotective effect of the original chemical compound 2,6-dimethyl-3-oxypyridine adamantane carboxylate has been investigated. It has been shown that this compound effectively reduces the activity of liver enzymes (aspartic and alanine transaminases, lactate dehydrogenase), the content of total bilirubin and activity of free radical oxidation initiated by CCl 4 intoxication. The protective action of the substance on the liver function has been confirmed morphologically.

Full Text

В последние годы возросло количество токсических поражений печени, обусловленных загрязнением окружающей среды, профессиональными и бытовыми вредностями. При заболеваниях печени применяются препараты разных фармакологических групп. Особое место среди них принадлежит гепатопротекторам -лекарственным средствам, улучшающим метаболические процессы в печени и способствующим восстановлению ее функций при различных повреждениях [4, 6]. Однако, эффективность этих средств при поражениях печени различной этиологии недостаточно высока. Свободнорадикальная концепция поражения печени открыла новые возможности для применения в практической гепа-тологии лекарственных средств с антиок-сидантной направленностью действия [1, 10]. Сегодня предложено достаточно много веществ с антиоксидантной и антигипо-ксантной активностью, и их поиск продолжается [3, 5, 9, 16]. В экспериментальных и клинических исследованиях были выявлены гепатопротекторные и гастро-протекторные свойства производного 3оксипиридина - мексидола [8, 13]. Тем не менее, проблема применения синтетических антиоксидантов в качестве гепато-протекторов остается малоизученной. Целью настоящего исследования явилось изучение гепатопротекторных свойств нового производного 3-оксипи-ридина - 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилата. Материалы и методы Опыты проведены на белых лабораторных крысах массой 150-200 г. Токсическое поражение печени вызывали четыреххлористым углеродом (CCl4). Опытным крысам подкожно вводили CCl4 в виде 50% раствора в подсолнечном масле в дозе 0,4 мл на 100 г массы животного 1 раз в день на протяжении 4-х первых дней опыта [7]. Наблюдение за животными вели в течение 7 дней, по истечении которых крысы подвергались одномоментной декапитации. Оригинальное химическое соединение 2,6-диметил-3-оксипиридина адаман-танкарбоксилат под лабораторным шифром ИБХФ (синтезировано в НИИ биохимической физики РАН г. Москва про 54 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. фессором Л.Д. Смирновым) вводили в дозе 10 мг/кг/сут внутрибрюшинно. Препарат сравнения альфа-токоферола ацетат - в дозе 50 мг/кг/сут внутримышечно. Вещества вводили 1 раз в сутки первые 4 дня параллельно с CCl4 за один час до его введения, затем еще три дня. Биохимическому исследованию подвергалась сыворотка крови животных. В ней определяли активность ферментов: аспарагиновой (АсАТ) и аланиновой ами-нотрансфераз (АлАТ), щелочной фосфата-зы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а также общий белок и концентрацию общего билирубина. Эти исследования выполнены на биохимическом анализаторе «Ultra» фирмы «Kone» (Финляндия) с использованием реактивов фирм Vital и Olvex (Россия) и фирмы Human (ФРГ). Оценку активности свободнорадикального окисления (СРО) проводили методом хемилюминесценции в сыворотке крови и супернатанте гомогената ткани печени на отечественном люминометре фирмы «Диалог» с помощью программы <CL3603>. Для инициации ПОЛ в исследуемый материал добавляли 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода и двухвалентное железо (12,5 мМ). Измеряли величину светосуммы, отражающую интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе СРО антиок-сидантных систем [11]. Биоптаты ткани печени подвергали гистологическому исследованию. Для этого образцы ткани печени стандартного размера 3^3x2 см извлекали из левой доли в течение 10 минут после декапитации и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем готовили парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином и по Ван-Г изону. Результаты экспериментальных исследований подвергали статистической обработке на компьютере с помощью пакетов StatGraphics v 5.0 и Maple. Гипотезы о средних значениях проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение В сыворотке крови опытных животных, подвергшихся CCl4-интоксикации, значительно повышалась активность АлАТ и АсАТ, а также фермента ЛДГ. Наряду с возрастанием активности ферментов-маркеров цитолиза в сыворотке крови опытных животных заметно увеличивалась концентрация общего билирубина, свидетельствующая о нарушении резорбции этого соединения из крови клетками печени, дальнейшего связывания его с глюкуроновой кислотой и выведения (табл. 1). Активность щелочной фосфатазы и концентрация общего белка существенно не изменялись (р>0,05). Приведенные результаты экспериментов свидетельствуют о том, что токсическое поражение печени CCl4 сопровождается выраженным синдромом цитолиза гепатоцитотов. Учитывая направленность изменений биохимических показателей в сыворотке крови, свидетельствующих об активации цитолитических процессов в печени, мы провели морфогистологическое изучение биоптатов печени. Морфологическая картина ткани печени крыс на 7 сутки после начала интоксикации CCl4 свидетельствовала о развитии токсического гепатоза, проявлявшегося жировой дистрофией печени, признаками снижения белковосинтетической функции, а также начальными признаками воспаления в виде незначительной лейкоцитарной инфильтрации (рис. 1, 2). Наши результаты по изменению активности ферментов и морфогистологических показателей печени в условиях экзогенной интоксикации организма животных полностью согласуются с данными других авторов, установленных в аналогичных исследованиях [16]. Интоксикация опытных животных тетрахлоридом углерода инициировала значительное усиление процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ). Причем отмечалась достоверная активация СРО как в гомогенате печени, так и в сыворотке крови (табл. 2, 3). Наибольшие нарушения изучаемых показателей происходили в ткани печени, что можно объяснить непосредственным действием ге-патотропного яда на орган-мишень. Как видно из таблицы 1, введение опытным животным соединения ИБХФ и токоферола с целью коррекции токсического гепатита показало положительную 55 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. Таблица 1 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на биохимические показатели сыворотки крови при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных АлАТ (ед/л) АсАТ (ед/л) ЛДГ (ед/л) ЩФ (ед/л) Общий белок (ед/л) Общий билирубин (мкмоль/л) Интактная (контроль) n=10 67,11+ 7,95 195,44+ 13,63 1601,33+ 206,54 555,89+ 72,82 64,0+ 2,43 7,83+ 0,12 СС14 -интоксикация n=12 599,91+ 153,14 p<0,01 623,36+ 40,25 p<0,01 2781,18+ 194,47 P<0,01 583,36+ 37,93 p>0,05 70,4+ 2,43 p>0,05 12,67+ 2,10 P<0,05 ССІ4 + ИБХФ n=10 135,80+ 17,85 p<0,01 p1<0,01 289,70+ 26,49 p<0,01 p1<0,01 1985,40+ 313,70 p>0,05 p1<0,05 583,20+ 62,60 p>0,05 p1>0,05 67,1+ 1,86 p>0,05 p1>0,05 10,30+ 0,76 p>0,05 p1>0,05 ССІ4 + Токоферол n=10 203,27+ 14,74 p<0,01 p1<0,05 255,63+ 30,83 p>0,05 p1<0,01 1514,80+ 175,76 p>0,05 p1<0,01 503,64+ 61,90 p>0,05 p1>0,05 63,0+ 2,33 p>0,05 p1>0,05 8,40+ 0,22 p>0,05 p1<0,05 Примечание. Во всех таблицах достоверность различий: p - по отношению к показателям интактных животных, p1 - по отношению к группе животных с СС14-интоксикацией без лечения динамику изменений биохимических показателей в сыворотке крови. Так, под влиянием 2,6-диметил-3 -оксипиридина адамантанкарбоксилата (ИБХФ) наблюдалось снижение активности АлАТ на 77,4%, АсАТ - на 53,5%, ЛДГ - на 28,6% и снижение содержания общего билирубина на 18,7%. При этом показатели активности щелочной фосфатазы и содержания общего белка в сыворотке крови достоверно не изменялись по сравнению с опытными животными без лечения. При применении препарата сравнения токоферола ацетата для коррекции СС14-интоксикации было отмечено снижение активности АлАТ на 66,1%, АсАТ - на 59%, ЛДГ - на 44,5% и снижение концентрации общего билирубина в сыворотке крови на 33,1% по отношению к животным без лечения. Активность ЩФ и содержание общего белка достоверно не изменялись. Сопоставление результатов действия двух веществ позволяет отметить, что ИБХФ по эффективности влияния на биохимические показатели крови в условиях СС14-интоксикации примерно соответствует токоферолу, а по влиянию на активность АлАТ даже превосходит его. Применение ИБХФ и токоферола на фоне экспериментального токсического гепатита приводило к достоверному снижению активности процессов СРО в гомогенате печени и сыворотке крови по сравнению с группой животных без лечения (табл. 2, 3). Эти данные свидетельствуют о том, что исследуемые вещества обладают антиоксидантной активностью. В гомогенате печени при интоксикации животных CCl4 активность ПОЛ снижали токоферол - на 108% (p1<0,01), ИБХФ -на 114% (p1<0,01). Применение ИБХФ приводило к снижению показателя величины светосуммы в гомогенате печени практически до уровня показателей ин-тактных животных (табл. 2). Сопоставимые данные были получены и при исследовании активности СРО в сыворотке крови животных в условиях фармакологической коррекции токсического гепатита (табл. 3). Так, например, применение ИБХФ приводило к достоверному снижению величины светосуммы на 72% (p1<0,01) относительно опытных животных без лечения. Активность ПОЛ у животных этой экспериментальной группы достоверно превышала аналогичный показатель интактной группы животных на 23% (p<0,05). Более значимо снижал активность ПОЛ в сыворотке крови опыт 56 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. ных животных препарат сравнения токоферола ацетат. На фоне его введения средний показатель величины светосуммы в сыворотке крови превышал аналогичный показатель интактных животных всего лишь на 9,5% (p>0,05). Таблица 2 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на активность СРО в гомогенате печени при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных Показатель светосуммы % к контролю Интактная (контроль) n=12 12847,16±1028,67 100% СС14 (без лечения) n=11 28558,60±1620,06 P<0,01 222,3% ССІ4 + ИБХФ 13908,89±2850,19 108,3% n=10 p>0,05; p1<0,01 СС14 + токоферол n=10 14690,71±1871,86 p>0,05; p1<0,01 114,3% Таблица 3 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на активность СРО в сыворотке крови при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных Показатель светосуммы % к контролю Интактная (контроль) n=12 79086,11±2113,85 100% СС14 (без лечения) n=11 138573,30±6492,37 p<0,01 195,2% СС14 + ИБХФ 95735,29±7865,86 122,9% n=10 p<0,05; p1<0,01 СС14 + токоферол n=10 86603,64±5384,43 p>0,05; p1<0,01 109,5% Проанализировав приведенные выше результаты по СРО, можно отметить, что наиболее эффективно корригирует процессы ПОЛ в печени крыс на фоне интоксикации животных тетрахлоридом углерода соединение 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат, эффективность которого по показателю величины светосуммы оказалась выше, чем у токоферола ацетата. Сопоставляя результаты исследования активности процессов СРО в условиях интоксикации животных CCl4, можно обнаружить некоторые различия между показателями величины светосуммы в гомогенате печени и сыворотке крови. Это объясняется тем, что повышение активности процессов пероксидации липидов в сыворотке крови может быть следствием не только выхода продуктов ПОЛ из поврежденного органа в кровь, но и результатом выраженной стрессорной реакции животных на проведение манипуляций. На наш взгляд, исследование активности процессов СРО в гомогенате печени наиболее объективно отражает изменения ПОЛ у животных с интоксикацией CCl4 на фоне применения фармакологических средств, так как количество гидроперекисей в клетках этого органа зависит только от его функционального состояния, в то время как уровень гидроперекисей в плазме крови отражает суммарную реакцию организма, в том числе и на стресс. Положительный эффект от введения соединения ИБХФ, по-видимому, связан с тем, что, являясь производным 3-оксипиридина, он относится к структурным аналогам витамина В6, выполняющего в организме роль физиологического антиоксиданта. Выявленная способность соединения угнетать активность процес 57 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. сов СРО, может лежать в основе его гепа-топротекторного действия в условиях интоксикации животных CCl4. В литературе показано, что производные 3 -оксипиридина регулируют процессы гидратации тканей [2, 12], оказывают противовоспалительное действие [14], что тоже может иметь отношение к гепатопротек-ции при токсическом поражении печени. Токоферола ацетат обладает многосторонним гепатотропным действием. Он стабилизирует мембраны гепатоцитов, ибо в виде токоферола входит в их состав в качестве обязательного структурного элемента, где находится в связи с липидными и белковыми компонентами. Кроме того, токоферол обладает антиоксидант-ными свойствами, являясь важным элементом антиоксидантной системы клеток. При изучении гистологических микропрепаратов печени было установлено, что соединение ИБХФ значительно уменьшает выраженность жировой дистрофии печени в условиях токсического гепатоза (рис. 3). Таким образом, оригинальное химическое соединение из группы производных 3-оксипиридина 2,6-диметил-3-оксипири-дина адамантанкарбоксилат снижает активность печеночных ферментов-маркеров цитолиза и концентрацию общего билирубина в сыворотке крови животных, активность процессов СРО, инициированных интоксикацией CCl4, что свидетельствует о его гепатопротекторном действии. Протекторное действие соединения на печень подтверждается морфогистологическим исследованием биоптатов печени. Выводы 1. 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат оказывает эффективное гепатопротекторное действие при токсическом поражении печени CCl4 у крыс, что подтверждается динамикой биохимических показателей и гистологической картиной печени. По гепатопро-текторной активности изученное соединение не уступает токоферолу ацетату. 2. Производное 3-оксипиридина 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкар-боксилат представляет научнопрактический интерес для дальнейшего экспериментального изучения в качестве потенциального лекарственного вещества, обладающего антиоксидантным и гепатопротекторным эффектами.