Влияние нового производного оксипиридина на развитие токсического гепатита

Аннотация

В условиях экспериментального токсического поражения печени изучено гепатопротекторное действие оригинального химического соединения - 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат. Показано, что соединение эффективно снижает активность печеночных ферментов (аспарагиновой и аланиновой аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы), содержание общего билирубина и активность свободнорадикального окисления, инициированных интоксикацией CCl 4. Протекторное действие вещества на функцию печени подтверждено морфологически.

Полный текст

В последние годы возросло количество токсических поражений печени, обусловленных загрязнением окружающей среды, профессиональными и бытовыми вредностями. При заболеваниях печени применяются препараты разных фармакологических групп. Особое место среди них принадлежит гепатопротекторам -лекарственным средствам, улучшающим метаболические процессы в печени и способствующим восстановлению ее функций при различных повреждениях [4, 6]. Однако, эффективность этих средств при поражениях печени различной этиологии недостаточно высока. Свободнорадикальная концепция поражения печени открыла новые возможности для применения в практической гепа-тологии лекарственных средств с антиок-сидантной направленностью действия [1, 10]. Сегодня предложено достаточно много веществ с антиоксидантной и антигипо-ксантной активностью, и их поиск продолжается [3, 5, 9, 16]. В экспериментальных и клинических исследованиях были выявлены гепатопротекторные и гастро-протекторные свойства производного 3оксипиридина - мексидола [8, 13]. Тем не менее, проблема применения синтетических антиоксидантов в качестве гепато-протекторов остается малоизученной. Целью настоящего исследования явилось изучение гепатопротекторных свойств нового производного 3-оксипи-ридина - 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилата. Материалы и методы Опыты проведены на белых лабораторных крысах массой 150-200 г. Токсическое поражение печени вызывали четыреххлористым углеродом (CCl4). Опытным крысам подкожно вводили CCl4 в виде 50% раствора в подсолнечном масле в дозе 0,4 мл на 100 г массы животного 1 раз в день на протяжении 4-х первых дней опыта [7]. Наблюдение за животными вели в течение 7 дней, по истечении которых крысы подвергались одномоментной декапитации. Оригинальное химическое соединение 2,6-диметил-3-оксипиридина адаман-танкарбоксилат под лабораторным шифром ИБХФ (синтезировано в НИИ биохимической физики РАН г. Москва про 54 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. фессором Л.Д. Смирновым) вводили в дозе 10 мг/кг/сут внутрибрюшинно. Препарат сравнения альфа-токоферола ацетат - в дозе 50 мг/кг/сут внутримышечно. Вещества вводили 1 раз в сутки первые 4 дня параллельно с CCl4 за один час до его введения, затем еще три дня. Биохимическому исследованию подвергалась сыворотка крови животных. В ней определяли активность ферментов: аспарагиновой (АсАТ) и аланиновой ами-нотрансфераз (АлАТ), щелочной фосфата-зы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а также общий белок и концентрацию общего билирубина. Эти исследования выполнены на биохимическом анализаторе «Ultra» фирмы «Kone» (Финляндия) с использованием реактивов фирм Vital и Olvex (Россия) и фирмы Human (ФРГ). Оценку активности свободнорадикального окисления (СРО) проводили методом хемилюминесценции в сыворотке крови и супернатанте гомогената ткани печени на отечественном люминометре фирмы «Диалог» с помощью программы <CL3603>. Для инициации ПОЛ в исследуемый материал добавляли 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода и двухвалентное железо (12,5 мМ). Измеряли величину светосуммы, отражающую интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе СРО антиок-сидантных систем [11]. Биоптаты ткани печени подвергали гистологическому исследованию. Для этого образцы ткани печени стандартного размера 3^3x2 см извлекали из левой доли в течение 10 минут после декапитации и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем готовили парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином и по Ван-Г изону. Результаты экспериментальных исследований подвергали статистической обработке на компьютере с помощью пакетов StatGraphics v 5.0 и Maple. Гипотезы о средних значениях проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение В сыворотке крови опытных животных, подвергшихся CCl4-интоксикации, значительно повышалась активность АлАТ и АсАТ, а также фермента ЛДГ. Наряду с возрастанием активности ферментов-маркеров цитолиза в сыворотке крови опытных животных заметно увеличивалась концентрация общего билирубина, свидетельствующая о нарушении резорбции этого соединения из крови клетками печени, дальнейшего связывания его с глюкуроновой кислотой и выведения (табл. 1). Активность щелочной фосфатазы и концентрация общего белка существенно не изменялись (р>0,05). Приведенные результаты экспериментов свидетельствуют о том, что токсическое поражение печени CCl4 сопровождается выраженным синдромом цитолиза гепатоцитотов. Учитывая направленность изменений биохимических показателей в сыворотке крови, свидетельствующих об активации цитолитических процессов в печени, мы провели морфогистологическое изучение биоптатов печени. Морфологическая картина ткани печени крыс на 7 сутки после начала интоксикации CCl4 свидетельствовала о развитии токсического гепатоза, проявлявшегося жировой дистрофией печени, признаками снижения белковосинтетической функции, а также начальными признаками воспаления в виде незначительной лейкоцитарной инфильтрации (рис. 1, 2). Наши результаты по изменению активности ферментов и морфогистологических показателей печени в условиях экзогенной интоксикации организма животных полностью согласуются с данными других авторов, установленных в аналогичных исследованиях [16]. Интоксикация опытных животных тетрахлоридом углерода инициировала значительное усиление процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ). Причем отмечалась достоверная активация СРО как в гомогенате печени, так и в сыворотке крови (табл. 2, 3). Наибольшие нарушения изучаемых показателей происходили в ткани печени, что можно объяснить непосредственным действием ге-патотропного яда на орган-мишень. Как видно из таблицы 1, введение опытным животным соединения ИБХФ и токоферола с целью коррекции токсического гепатита показало положительную 55 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. Таблица 1 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на биохимические показатели сыворотки крови при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных АлАТ (ед/л) АсАТ (ед/л) ЛДГ (ед/л) ЩФ (ед/л) Общий белок (ед/л) Общий билирубин (мкмоль/л) Интактная (контроль) n=10 67,11+ 7,95 195,44+ 13,63 1601,33+ 206,54 555,89+ 72,82 64,0+ 2,43 7,83+ 0,12 СС14 -интоксикация n=12 599,91+ 153,14 p<0,01 623,36+ 40,25 p<0,01 2781,18+ 194,47 P<0,01 583,36+ 37,93 p>0,05 70,4+ 2,43 p>0,05 12,67+ 2,10 P<0,05 ССІ4 + ИБХФ n=10 135,80+ 17,85 p<0,01 p1<0,01 289,70+ 26,49 p<0,01 p1<0,01 1985,40+ 313,70 p>0,05 p1<0,05 583,20+ 62,60 p>0,05 p1>0,05 67,1+ 1,86 p>0,05 p1>0,05 10,30+ 0,76 p>0,05 p1>0,05 ССІ4 + Токоферол n=10 203,27+ 14,74 p<0,01 p1<0,05 255,63+ 30,83 p>0,05 p1<0,01 1514,80+ 175,76 p>0,05 p1<0,01 503,64+ 61,90 p>0,05 p1>0,05 63,0+ 2,33 p>0,05 p1>0,05 8,40+ 0,22 p>0,05 p1<0,05 Примечание. Во всех таблицах достоверность различий: p - по отношению к показателям интактных животных, p1 - по отношению к группе животных с СС14-интоксикацией без лечения динамику изменений биохимических показателей в сыворотке крови. Так, под влиянием 2,6-диметил-3 -оксипиридина адамантанкарбоксилата (ИБХФ) наблюдалось снижение активности АлАТ на 77,4%, АсАТ - на 53,5%, ЛДГ - на 28,6% и снижение содержания общего билирубина на 18,7%. При этом показатели активности щелочной фосфатазы и содержания общего белка в сыворотке крови достоверно не изменялись по сравнению с опытными животными без лечения. При применении препарата сравнения токоферола ацетата для коррекции СС14-интоксикации было отмечено снижение активности АлАТ на 66,1%, АсАТ - на 59%, ЛДГ - на 44,5% и снижение концентрации общего билирубина в сыворотке крови на 33,1% по отношению к животным без лечения. Активность ЩФ и содержание общего белка достоверно не изменялись. Сопоставление результатов действия двух веществ позволяет отметить, что ИБХФ по эффективности влияния на биохимические показатели крови в условиях СС14-интоксикации примерно соответствует токоферолу, а по влиянию на активность АлАТ даже превосходит его. Применение ИБХФ и токоферола на фоне экспериментального токсического гепатита приводило к достоверному снижению активности процессов СРО в гомогенате печени и сыворотке крови по сравнению с группой животных без лечения (табл. 2, 3). Эти данные свидетельствуют о том, что исследуемые вещества обладают антиоксидантной активностью. В гомогенате печени при интоксикации животных CCl4 активность ПОЛ снижали токоферол - на 108% (p1<0,01), ИБХФ -на 114% (p1<0,01). Применение ИБХФ приводило к снижению показателя величины светосуммы в гомогенате печени практически до уровня показателей ин-тактных животных (табл. 2). Сопоставимые данные были получены и при исследовании активности СРО в сыворотке крови животных в условиях фармакологической коррекции токсического гепатита (табл. 3). Так, например, применение ИБХФ приводило к достоверному снижению величины светосуммы на 72% (p1<0,01) относительно опытных животных без лечения. Активность ПОЛ у животных этой экспериментальной группы достоверно превышала аналогичный показатель интактной группы животных на 23% (p<0,05). Более значимо снижал активность ПОЛ в сыворотке крови опыт 56 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. ных животных препарат сравнения токоферола ацетат. На фоне его введения средний показатель величины светосуммы в сыворотке крови превышал аналогичный показатель интактных животных всего лишь на 9,5% (p>0,05). Таблица 2 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на активность СРО в гомогенате печени при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных Показатель светосуммы % к контролю Интактная (контроль) n=12 12847,16±1028,67 100% СС14 (без лечения) n=11 28558,60±1620,06 P<0,01 222,3% ССІ4 + ИБХФ 13908,89±2850,19 108,3% n=10 p>0,05; p1<0,01 СС14 + токоферол n=10 14690,71±1871,86 p>0,05; p1<0,01 114,3% Таблица 3 Влияние производного 3-оксипиридина и токоферола на активность СРО в сыворотке крови при интоксикации крыс CCl4 (M + m) Г руппы животных Показатель светосуммы % к контролю Интактная (контроль) n=12 79086,11±2113,85 100% СС14 (без лечения) n=11 138573,30±6492,37 p<0,01 195,2% СС14 + ИБХФ 95735,29±7865,86 122,9% n=10 p<0,05; p1<0,01 СС14 + токоферол n=10 86603,64±5384,43 p>0,05; p1<0,01 109,5% Проанализировав приведенные выше результаты по СРО, можно отметить, что наиболее эффективно корригирует процессы ПОЛ в печени крыс на фоне интоксикации животных тетрахлоридом углерода соединение 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат, эффективность которого по показателю величины светосуммы оказалась выше, чем у токоферола ацетата. Сопоставляя результаты исследования активности процессов СРО в условиях интоксикации животных CCl4, можно обнаружить некоторые различия между показателями величины светосуммы в гомогенате печени и сыворотке крови. Это объясняется тем, что повышение активности процессов пероксидации липидов в сыворотке крови может быть следствием не только выхода продуктов ПОЛ из поврежденного органа в кровь, но и результатом выраженной стрессорной реакции животных на проведение манипуляций. На наш взгляд, исследование активности процессов СРО в гомогенате печени наиболее объективно отражает изменения ПОЛ у животных с интоксикацией CCl4 на фоне применения фармакологических средств, так как количество гидроперекисей в клетках этого органа зависит только от его функционального состояния, в то время как уровень гидроперекисей в плазме крови отражает суммарную реакцию организма, в том числе и на стресс. Положительный эффект от введения соединения ИБХФ, по-видимому, связан с тем, что, являясь производным 3-оксипиридина, он относится к структурным аналогам витамина В6, выполняющего в организме роль физиологического антиоксиданта. Выявленная способность соединения угнетать активность процес 57 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2014 г. сов СРО, может лежать в основе его гепа-топротекторного действия в условиях интоксикации животных CCl4. В литературе показано, что производные 3 -оксипиридина регулируют процессы гидратации тканей [2, 12], оказывают противовоспалительное действие [14], что тоже может иметь отношение к гепатопротек-ции при токсическом поражении печени. Токоферола ацетат обладает многосторонним гепатотропным действием. Он стабилизирует мембраны гепатоцитов, ибо в виде токоферола входит в их состав в качестве обязательного структурного элемента, где находится в связи с липидными и белковыми компонентами. Кроме того, токоферол обладает антиоксидант-ными свойствами, являясь важным элементом антиоксидантной системы клеток. При изучении гистологических микропрепаратов печени было установлено, что соединение ИБХФ значительно уменьшает выраженность жировой дистрофии печени в условиях токсического гепатоза (рис. 3). Таким образом, оригинальное химическое соединение из группы производных 3-оксипиридина 2,6-диметил-3-оксипири-дина адамантанкарбоксилат снижает активность печеночных ферментов-маркеров цитолиза и концентрацию общего билирубина в сыворотке крови животных, активность процессов СРО, инициированных интоксикацией CCl4, что свидетельствует о его гепатопротекторном действии. Протекторное действие соединения на печень подтверждается морфогистологическим исследованием биоптатов печени. Выводы 1. 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат оказывает эффективное гепатопротекторное действие при токсическом поражении печени CCl4 у крыс, что подтверждается динамикой биохимических показателей и гистологической картиной печени. По гепатопро-текторной активности изученное соединение не уступает токоферолу ацетату. 2. Производное 3-оксипиридина 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкар-боксилат представляет научнопрактический интерес для дальнейшего экспериментального изучения в качестве потенциального лекарственного вещества, обладающего антиоксидантным и гепатопротекторным эффектами.