МОРФОЛОГИЯ ВНУТРЕННЕГО РЕЛЬЕФА ЖЕЛУДОЧКОВОГО МИОКАРДА У КУРИНЫХ ЗАРОДЫШЕЙ НА 6-8 СУТКИ ИНКУБАЦИИ

Аннотация

Цель работы – создание трехмерных компьютерных моделей сердца куриных эмбрионов на 6 и 8 сут инкубации с последующей сопоставительной оценкой внутреннего рельефа желудочков. В работе проведены реконструкция и морфометрический анализ сердца эмбрионов кур при помощи компьютерного моделирования, выделены структуры для дальнейшего изучения. Показано, что развитие внутреннего рельефа осуществляется по разным путям в левом и правом желудочках.

Полный текст

Поскольку морфогенетические изменения в сердце имеют пространственный характер, чрезвычайно важно проводить трехмерную визуализацию и анализ развития сердца при сочетании с другими методами. Пространственное моделирование является мощным инструментом эмбриологических исследований и существенно помогает понять динамику структурных преобразований эмбриона [6]. В процессе кардиогенеза размеры и форма полостей существенно изменяются, но количественной характеристике этих изменений посвящено незначительное количество исследований. Принципиально новый взгляд на кардиогенез возникает при сочетании трехмерной реконструкции гистологических срезов и методов выявления белковых и других соединений [3, 12]; также это позволяет получить точное представление о локализации тех или иных процессов в развивающемся сердце. Несмотря на то, что тщательная обработка гистологических срезов и использование значительного количества срезов для реконструкции требуют много времени, такая работа позволяет с высокой точностью интегрировать полученную информацию в пространственную компьютерную модель. В области изучения кардиогенеза компьютерное моделирование и компьютерная графика применялись для визуализации развивающегося сердца мыши [2, 13], курицы [8] и человека [4, 14]. Изучение реконструкций показало, что сердца на одном и том же сроке эмбрионального развития у одного вида идентичны. Двух или трех реконструкций на один срок, по-видимому, достаточно для создания репрезентативной модели данной стадии развития. Объемные количественные характеристики сердец на аналогичной стадии отличаются в пределах 10%. Эти предварительные результаты указывают на то, что биологическое варьирование не создает проблем для оценки популяции в целом [9]. Волюметрические данные структур развивающегося сердца могут быть использованы в математических и функциональных моделях развития сердца. В то же время информация о структурах полостей, их волюметрических и морфологических изменениях во время развития сердца до сих пор не является полной. Цель данной работы – создание трехмерных компьютерных моделей сердца куриных эмбрионов на 6 и 8 сут инкубации с последующей сопоставительной оценкой внутреннего рельефа желудочков. Материалы и методы В работе исследовали зародыши кур кросса Cobb500 в начале 6 сут и к концу 8 сут инкубации. Яйца инкубировали при температуре 39,4˚С и относительной влажности воздуха 80%. Стадию развития определяли по Hamburger, Hamilton (НН) [7] в соответствии с рекомендациями [11]. Материал фиксировали в растворе Буэна, обезвоживали этанолом, пропитывали хлороформом, заливали парапластом. Последовательные срезы толщиной 10 мкм ориентировали в горизонтальной плоскости и окрашивали гематоксилином-эозином, а также железным гематоксилином Гейденгайна по стандартной методике. Состояние максимальной диастолы моделировали с помощью хлорида калия по методике, описанной в [10]. Для создания пространственных моделей использовали 30-35 срезов с предварительным расчетом равномерного шага в зависимости от величины органа. После изготовления и обработки цифровых фотографий срезов в Photoshop CS2 изображения импортировались в программу AMIRA 5.0, подвергались трансляции и интерполированию кубическими сплайнами между каждой парой срезов. Пространственную реконструкцию проводили в соответствии с рекомендациями [1] с помощью Autodesk 3ds Max 8.0. В моделях анализировали внутренний рельеф правого и левого желудочков. Результаты и их обсуждение В исследовании проведена пространственная реконструкция полостей сердца куриных зародышей на 29-й и 35-й стадиях развития по (НН) (рис. 1, 2). Результаты волюметрического компьютерного анализа желудочков и предсердий, а также желудочкового миокарда были представлены в одной из наших предыдущих публикаций [5]. В настоящей работе проводили гистологическую и морфометрическую оценку внутреннего рельефа сердечных камер. Установлено, в частности, что у куриных эмбрионов к началу 6 суток инкубации (стадия 29 по НН) структура трабекул правого и левого желудочков сердца была неодинаковой. Величина межтрабекулярных пространств свободной стенки правого желудочка (ПЖ) в области верхушки достигала 34 мкм, тогда как со стороны левого желудочка (ЛЖ) – не превышала 23 мкм. При этом трабекулы в ПЖ были длиннее (до 390 мкм), чем в ЛЖ (до 160 мкм), однако более тонкие (до 26 мкм – в ПЖ, до 35 мкм – в ЛЖ). Толщина желудочкового миокарда сильно варьировала в обоих желудочках. Наибольшая толщина свободной стенки ПЖ отмечалась в верхушечной области, достигая 35 мкм, причем компактный миокард был представлен всего 3-4 рядами кардиомиоцитов. В стенке ЛЖ максимальная толщина (до 42 мкм) наблюдалась в промежуточной области камеры, где компактно расположенные кардиомиоциты формировали 5-6 рядов клеток. Трабекулы на поперечных срезах были представлены округлыми структурами, состоящими из центрально расположенных рядов кардиомиоцитов, окруженных неструктурированным внеклеточным матриксом и плотной эндотелиальной «оболочкой». В трабекулах ПЖ кардиомиоциты имели диаметр 4-6 мкм и формировали от 4 до 8 клеточных рядов, тогда как левожелудочковые трабекулы содержали сердечные миоциты диаметром до 9 мкм. Прослойка внеклеточного матрикса была более тонкой в трабекулах ПЖ по сравнению с ЛЖ. Эндотелиоциты в обеих сердечных камерах существенно не различались и содержали крупное активное ядро, широкую периферическую зону, развитую базальную мембрану (рис. 3). Межжелудочковая перегородка (МЖП) у эмбрионов на 29-й стадии развития по НН имела толщину от 85 мкм в наиболее тонкой базальной части до 240 мкм в верхушечной части перегородки. МЖП не содержала на своей поверхности морфологически обособленных трабекул и состояла из 3-5 листков кардиомиоцитов, окруженных широким пространством аморфного внеклеточного матрикса. Рис. 1. Пространственная компьютерная Рис. 2. Пространственная компьютерная модель сердца куриного эмбриона на 6-е модель сердца куриного эмбриона на 8-е сут инкубации (стадия 29 по НН). Фрон- сут инкубации (стадия 35 по НН). Протальная проекция. 1 – полость левого екция слева. 1 – полость левого желужелудочка; 2 – полость правого желудоч- дочка; 2 – полость правого желудочка; ка; 3 – полость предсердий 3 – полость предсердий Рис. 3. Структура трабекул левого желудочка сердца куриного эмбриона на 6-е сут инкубации (стадия 29 по НН). Окраска гематоксилином и эозином. ×1500 Рис. 4. Участок свободной стенки и трабекул правого желудочка сердца куриного эмбриона на 8-е сут инкубации (стадия 35 по НН). Окраска железным гематоксилином Гейденгайна. ×750 Межтрабекулярные пространства расширялись до 30 мкм. Ближе к основанию и у верхушки данные листки разветвлялись и были сгруппированы более плотно по сравнению с промежуточной частью МЖП. Эндотелиальная выстилка МЖП не отличалась существенно от таковой в области свободной стенки желудочков. У куриных эмбрионов к концу 8 суток инкубации (стадия 35 по НН) трабекулы ПЖ и ЛЖ сердца сохраняли камеро-специфичность, характерную для предыдущей стадии развития, однако существенно изменялись по сравнению с ней как по размерам, так и по составу. За счет уплотнения трабекулярного миокарда величина межтрабекулярных пространств свободной стенки ПЖ в области верхушки сокращалась до 28 мкм, в ЛЖ – до 16 мкм. Трабекулы в ПЖ существенно не изменялись по своей длине за прошедшие 2 суток инкубации, однако левожелудочковые трабекулы значительно удлинялись за этот период от 160 мкм до 350 мкм. Напротив, в ПЖ трабекулы заметно утолщались (от 26 мкм до 38 мкм), в ЛЖ – не изменялись. На данной стадии развития за счет активной пролиферации клеток компактного и трабекулярного миокарда происходило существенное усложнение внутреннего рельефа камер обоих желудочков. В частности, наибольшее утолщение свободной стенки ПЖ смещалось от верхушечной области к промежуточной, достигая 44 мкм, так как в данной локализации происходило наиболее активное формирование компактного миокарда. В стенке ЛЖ максимальная толщина составляла 73 мкм в промежуточной области, где компактно расположенные кардиомиоциты формировали 12-15 клеточных рядов. Трабекулы ПЖ содержали кардиомиоциты значительно большего диаметра, чем на стадии 29 по НН, хотя количество клеточных рядов нарастало умеренно – максимум до 8 (рис. 4). В трабекулах свободной стенки ЛЖ диаметр сократительных клеток и количество их рядов на поперечных срезах трабекул увеличивались незначительно по сравнению с предыдущей стадией развития. В трабекулах обеих камер наблюдалась выраженная редукция аморфного внеклеточного матрикса между кардиомиоцитами и эндотелием трабекул. Эндотелиоциты существенно не изменяли свою морфологию по сравнению с предыдущей изученной стадией развития, однако базальная мембрана заметно уплотнялась в обоих желудочках. В составе МЖП сердца куриных эмбрионов на стадии 35 по НН наблюдалось значительное уплотнение листков кардиомиоцитов и увеличение их количества во всех частях перегородки. Ширина межтрабекулярных пространств не превышала 15 мкм. За счет формирования более массивных клеточных пластов МЖП расширялась в верхушечной части до 410 мкм. В данной области субэндотелиальный внеклеточный матрикс выявлялся в виде тонкой прослойки, эндотелиальная выстилка истончалась и уплотнялась. Выводы По результатам проведенного исследования, в период с 29 по 35 стадию развития по НН в диастолическом сердце куриных эмбрионов внутренний рельеф правого желудочка изменялся в направлении сужения межтрабекулярных пространств и утолщения трабекул за счет увеличения диаметра кардиомиоцитов при стабильной длине трабекул. В левом желудочке на фоне стабильного диаметра трабекул происходило двукратное удлинение и увеличение их количества, приводящее к сужению межтрабекулярных пространств, а также утолщение компактного миокарда. Перспективы дальнейших исследований связаны с изучением внутреннего рельефа камер сердца в фазе систолы.