IMPORTANCE OF MARKERS OF THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS FOR OVARIAN BODERLINE TUMOURS

Full Text

Пограничные опухоли яичников (ПОЯ) или опухоли с низким злокачественным потенциалом представляют собой гетерогенную группу новообразований, для которых характерна пролиферация эпителия, клеточная и ядерная атипия, выраженная в большей степени, чем в их доброкачественных аналогах. Однако отсутствует деструктивная инвазия стромы или солидный рост, что в свою очередь связано с более благоприятным прогнозом пограничных опухолей по сравнению с раком яичников [10]. Диагноз пограничной опухоли яичников является одной из самых спорных проблем в гинекологической патологии. Это связано с отсутствием четких гистологических критериев пограничных опухолей, за исключением отсутствия явной инвазии. Кроме того, риск развития рецидива и метастазов в каждом конкретном случае не определен. Это увеличивает потребности в разработке дополнительных методов диагностики, в том числе панелей антител для иммуногистохимического (ИГХ) исследования с использованием маркеров, позволяющих определить индивидуальные факторы прогноза [6]. В этом отношении перспективным является изучение процессов апоптоза и пролиферативной активности этих опухолей, поскольку пролиферация эпителия – одна из характерных черт ПОЯ. Наиболее часто для изучения пролиферативной активности опухоли исследуют белок Ki-67 – ядерный протеин, маркер пролиферативной активности, определяющийся во всех фазах клеточного цикла кроме G0 [2]. Имеются сообщения об увеличении степени пролиферативной активности от пограничной опухоли яичников к low-grade карциноме и, затем к high-grade карциноме [11]. Для изучения процессов апоптоза используют иммуногистохимические реакции с антителами к онкосупрессору р53, а так же протеинам bcl-2 и Вах. Помимо этого, в последние годы изучаются свойства ингибитора апоптоза сурвивина, высокая активность которого в различных опухолях, по данным ряда авторов была связана с плохим прогнозом [1]. Ген-супрессор опухоли P53 расположен на коротком плече 17 хромосомы, его продукт – ядерный фосфопротеин, вовлеченный в регулирование транскрипции и роста клетки. Мутации гена P53 являются наиболее часто обнаруживаемой генетической аномалией в опухолях человека [5]. В литературе имеются данные о более выраженной экспрессии p53 в пограничных и злокачественных опухолях яичника по сравнению с доброкачественными [6, 9]. По мнению некоторых авторов, более интенсивная ИГХ-реакция в пограничных опухолях может быть интерпретирована как озлокачествление опухоли [9]. Несмотря на это, прогностическая роль р53 остается неоднозначной для опухолей яичников. Одним из основных маркеров апоптоза является белок bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2 gene) – митохондриальный мембранный протеин, который блокирует апоптоз. Для многих типов карцином показана его различная прогностическая ценность. Обнаружено, что экспрессия bcl-2 в пограничных опухолях интенсивнее, чем в доброкачественных и злокачественных опухолях, однако данные о прогностической значимости этого маркера для ПОЯ крайне скудны [6]. Белок Вах – проапоптотический протеин, локализующийся в цитоплазме и выступающий как ингибитор роста опухоли [6]. Данные об экспрессии этого маркера в опухолях яичника противоречивы. Имеются сообщения как об отсутствии статистически значимых различий экспрессии Вax в доброкачественных, пограничных, и злокачественных опухолях яичника, так и о корреляции слабой экспрессии с плохим прогнозом [3]. Сурвивин – член семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP), избирательно экспрессирующийся в большинстве опухолей, и локализирующийся в ядре и цитоплазме. Имеются данные о том, что экспрессия сурвивина более выражена в доброкачественных и пограничных серозных опухолях, и что наиболее часто в этих опухолях сурвивин локализуется в ядре [7]. Предположение о том, что рак яичника, как и большинство других опухолей, возникает в результате нарушений в регулировании клеточного цикла, было сделано давно [13]. Ответственной за смену фаз клеточного цикла является группа белков, называемых циклин-зависимыми киназами (CDKs), которые активируются при взаимодействии с различными циклинами. Так, для перевода клетки из G1 в S-фазу необходим активатор CDK – сyclin D1 – протоонкоген, положительный регулятор клеточного цикла [4]. По данным ряда авторов в 13-56 % случаев рака яичников выявляется амплификация или гиперэкспрессия циклина D1, либо их сочетание [12]. Данные об экспрессии этого маркера в ПОЯ крайне скудны. Антагонистом циклина Д1 является ингибитор CDK – P21 – p53-индуцируемый ген, белковый продукт которого являясь ингибитором CDK, способен остановить клеточный цикл в фазе G1. Некоторые авторы считают, что слабая экспрессия р21 в серозных опухолях связана с повышенной биологической агрессивностью [8]. Целью исследования являлось изучение про- и антиапоптотических маркеров (p53, bax, bcl-2, сурвивин), а так же маркеров пролиферативной активности (Ki67, циклин D1, p21) для определения потенциально агрессивного поведения ПОЯ. Материалы и методы Исследование проводилось на операционном материале пациенток проходивших лечение или консультированных в МНИОИ им. П.А. Герцена с диагнозом «пограничная опухоль яичника». Были исследованы образцы опухолей 40 женщин в возрасте от 18 до 63 лет (средний возраст 30,8 лет). Пациентки были разделены на две группы: 1 группа – больные с отсутствием рецидивов ПОЯ (23 человека); 2 группа – больные с наличием рецидива ПОЯ (17 человек). Для исследования были использованы коммерческие моноклональные антитела производства «Dako» (Denmark) к маркерам пролиферативной активности (Ki67 в разведении 1:40; циклин D1 в разведении 1:50), апоптоза (Bcl2 в разведении 1:40; Вах в разведении 1:70), супрессорам опухолевого роста (р53 и р21 в разведении 1:70). Антитела к сурвивину (в разведении 1:150) были предоставлены разработчиками (ИБХ РАН). Для иммуногистохимического исследования были изготовлены срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла. Восстановление антигенной активности проводили в модуле предобработки для автостейнера при температуре 970С в течение 25 мин. и последующим остывании до 65 0С в течение 20 мин в цитратном буфере рН 6,0 или в трис-ЭДТА буфере рН 9,0. В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision Flеx» («Dako»), в качестве хромогена – диаминобензидин. Для получения результатов пригодных для количественной обработки реакции проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Avtosteiner Dako Link 48». Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Оценку экспрессии маркеров производили путем подсчета количества окрашенных клеток на 100 клеток препарата в 3 полях зрения (увеличение х40) и выражали полученные результаты в процентах. Анализ результатов проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0, используя метод процентилей описательной статистики, U-тест Манна-Уитни. Уровень значимости (р) принимали равным 0,05. Результаты и их обсуждение Уровень экспрессии Ki-67 в обеих группах варьировал в пределах от 1% до 70%, при этом экспрессия маркера значимо различалась в опухолях 1 и 2 группы (р < 0,05). В 1 группе уровень экспрессии Ki 67 10% соответствовал 25-му процентилю, а 30% – 75-му. Во 2 группе 25-й процентиль был равен 10%, а 75-й – 20%. Таким образом, отмечается тенденция к увеличению уровня экспрессии Ki-67 более 20% в опухолях 1 группы, и снижению уровня менее 10% в опухолях 2 группы, однако статистически значимых различий достигнуто не было (р>0.05), что, возможно связано с малым количеством наблюдений. Уровень экспрессии Bcl2 варьировал в пределах от 0 до 90%, однако значимых различий в экспрессии маркера между группами не было обнаружено (p>0,05). Экспрессия Bax колебалась в пределах 0-95%, при этом степень выраженности маркера значимо различалась в опухолях 1 и 2 группы (р < 0,05). В 1 группе 25-м процентилем являлся уровень экспрессии 20%, а 75-м процентилем – 70%. Во 2 группе 25-му процентилю соответствовал уровень экспрессии 40%, а 75-му – 90%. Можно отметить, что в этой группе границы значений оказались значительно выше, чем в группе без рецидивов. Таким образом, значимым в опухолях без рецидивов является уровень экспрессии Вах менее 40% (рис. А), тогда как в группе с рецидивами – выше 70% (рис. Б) (р < 0,05). Уровень экспрессии р53 варьировал в пределах от 0 до 90%, однако значимых различий в экспрессии этого маркера между 1 и 2 группами не было обнаружено (p>0,05). Реакция с р21 находилась в пределах 0-80%, при этом экспрессия маркера значимо различалась в опухолях 1 и 2 группы (р < 0,05). В 1 группе 25-му процентилю соответствовал уровень экспрессии 20%, а 75-му – 40%. Во 2 группе уровень 25-й процентиль был равен 10%, 75-й – 30%. Таким образом, значимой в опухолях без рецидивов является экспрессия р21 более 30% (рис. В), тогда как во 2 группе – менее 20% (рис. Г) (р < 0,05). Выраженность экспрессии циклина D1 также сильно варьировала (0-90%), однако значимых различий в экспрессии этого маркера между группами не было обнаружено (p>0,05). Во всех исследованных случаях наблюдалась цитоплазматическая экспрессия сурвивина, уровень которой колебался в пределах 0-90%, однако значимых различий в его экспрессии между 1 и 2 группами не было выявлено (p>0,05). Значения всех описанных выше маркеров отражены в таблице 1. Таблица 1 Экспрессии исследованных маркеров в ПОЯ Ki-67 Bcl2 Bax P53 P21 Cyclin D1 Сурвивин ПОЯ Без рецидива Валидные 23 23 23 23 23 23 23 Медиана 20% 0 30% 10% 30% 30% 10% 25-й процентиль* 10% 0 20% 10% 20% 0 0 75-й процентиль** 30% 30% 70% 40% 40% 60% 50% Среднее 20% 20% 40% 30% 30% 30% 30% Стандартное отклонение 20% 30% 30% 30% 20% 30% 30% Стандартная ошибка среднего 0 0 0 0 0 0 0 Рецидивы Валидные 17 16 15 17 17 15 15 Медиана 10% 10% 80% 10% 20% 30% 0 25-й процентиль* 10% 0 40% 10% 10% 20% 0 75-й процентиль** 20% 40% 90% 40% 30% 60% 30% Среднее 10% 20% 70% 20% 20% 40% 20% Стандартное отклонение 10% 30% 30% 30% 10% 30% 30% Стандартная ошибка среднего 0 0 0 0 0 0 0 * 25-й процентиль – значение, ниже которого расположено 25% наблюдений. ** 75-й процентиль – значение, выше которого расположено 25% наблюдений. Используются для сравнения и определения пороговых значений данных. В результате нашего исследования установлено снижение уровня экспрессии р21 ниже 20% в рецидивных ПОЯ, что согласуется с данными литературы [8], демонстрирующими, корреляцию снижения экспрессии р21 с повышением биологической агрессивности опухоли и, обусловленной, вероятнее всего, отсутствием ингибирующей роли р21 на клеточный цикл. Исследование показало усиление экспрессии Вах в группе с рецидивами (выше 70%). По данным ряда авторов выраженная экспрессия Вах в карциномах яичника связана с благоприятным клиническим прогнозом [3], однако исследования, посвященные изучению связи экспрессии Вах с биологическим поведением именно ПОЯ в настоящее время отсутствуют. Хотя в литературе имеются сообщения о выраженной экспрессии циклина D1, bcl-2 и сурвивина в ПОЯ, исследования по изучению их прогностического значения для данной патологии практически отсутствуют [6, 7]. Наше исследование не выявило значимых различий экспрессии этих маркеров в исследуемых группах. При исследовании р53 так же не было обнаружено значимых различий экспрессии в безрецидивных и рецидивных опухолях, хотя, по мнению некоторых авторов, более интенсивная реакция в пограничных опухолях может быть признаком озлокачествления опухоли [9]. Однако исследования по этому вопросу так же скудны. Выводы 1. В пограничных опухолях яичника, склонных к рецидивам отмечается экспрессия р21 ниже 20% и экспрессия Вах выше 70%; 2. Для пограничных опухолей яичника, не склонных к рецидивам характерна экспрессия р21 выше 30% и экспрессия Вах ниже 40%; 3. Прогностическое значение уровня экспрессии Ki 67 требует дальнейшего изучения, так как согласно исследованиям ряда авторов отмечено увеличение степени пролиферативной активности в карциномах яичника, по сравнению с ПОЯ. [11]. 4. Циклин D1, bcl-2, р53 и сурвивин пока не имеют прогностической ценности для оценки биологического поведения ПОЯ.

References

Supplementary files