МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У САМОК КРЫС ВИСТАР В РАЗНЫЕ ФАЗЫ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА

Полный текст

По данным экспериментальных исследований морфофункциональное состояние иммунной системы у самок циклически изменяется в зависимости от фазы эстраль-ного цикла [2, 5]. «Эстрогеновый статус» является одним из факторов, модулирующих выраженность иммунного ответа [2]. По сравнению с другими фазами эстраль-ного цикла фаза проэструса, при которой наблюдается максимальный уровень эстра-диола в сыворотке крови (100-200 пг/мл у крыс), характеризуется наиболее выраженной реакцией иммунной системы на антигенные воздействия [2, 11]. Немногочисленными исследованиями показано, что половые гормоны играют важную роль в регулировании процессов пролиферации, дифференцировки, миграции и активации иммунокомпетентных клеток [6, 10]. В литературе представлены данные о субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови у женщин в зависимости от фазы менструального цикла. По сравнению с лютеиновой фазой овариального цикла в фолликулярной фазе наблюдается увеличение числа Т-лимфоцитов и Т-хелперов в крови [8]. Данные о гистофизиологических особенностях органов иммунной системы и субпопуля-ционном составе лимфоцитов периферической крови у самок крыс и других грызунов в разные фазы эстрального цикла в литературе отсутствуют, что затрудняет анализ экспериментальных данных о влиянии женских половых гормонов на функционирование иммунной системы в физиологических условиях и при различных патологических процессах. Целью исследования было изучение морфофункционального состояния органов иммунной системы и субпопуляци-онного состава лимфоцитов периферической крови у самок крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла. 51 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Материалы и методы В работе использовали половозрелых самок крыс Вистар с устойчивым 4дневным эстральным циклом массой 250300 г (питомник «Столбовая»). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Крысы содержались в условиях вивария при температуре 20-22°С и относительной влажности 60-70% по 5 особей в клетке и имели свободный доступ к пище и воде. Во влагалищных мазках крыс оценивали соотношение различных клеточных элементов и по кольпоцитограмме определяли фазу эстрального цикла. Отбирали самок в фазе проэструса (высокий уровень эстрогенов в сыворотке крови) и в фазе диэструса (низкий уровень эстрогенов в сыворотке крови). Забор крови из хвостовой вены проводили под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 ЕД/мл). С помощью гематологического анализатора Celltac alpha MEK-6400 («Nihon Kohden») подсчитывали абсолютное количество лимфоцитов в крови. Методом проточной цитофлуориметрии на приборе Cytomics FC 500 («Beckman Coulter») определяли субпопуляционный состав лимфоцитов и фагоцитарную активность гранулоцитов периферической крови. Для иммунофенотипического анализа основных субпопуляций лимфоцитов использовали следующие антитела («eBioscience»): anti-Rat CD3 (маркер Т-лимфоцитов); anti-Rat CD4 (маркер Т-хелперов); апй-Ка! CD8a (маркер цитоток-сических Т-клеток); ап!і-Ка! CD45R (маркер В-лимфоцитов); ап!і-Ка! CD25 (маркер активированных Т-клеток); аnti-Mouse/Rat Foxp3 (маркер регуляторных Т-клеток). Проводили подсчет абсолютного и относительного количества лимфоцитов различных субпопуляций и иммунорегуляторного индекса (соотношения CD4/CD8). Для оценки фагоцитарной активности гранулоцитов использовали набор FagoFlowEx Kit («EXBIO Diagnostics»). Образцом отрицательного контроля слу жила цельная гепаринизированная кровь; в качестве стимулированного образца использовали кровь с добавлением стандартизованной суспензии Escherichia coli. В каждый из образцов добавляли дигидрородамин 123 (DHR123) и регистрировали флуоресценцию родамина 123, который образуется при окислении DHR123 в процессе респираторного взрыва в активированных гранулоцитах. Определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) в контрольном и стимулированном образцах. Вычисляли индекс стимуляции - отношение СИФ активированных гранулоцитов стимулированного образца к СИФ нестимулированных гранулоцитов образца отрицательного контроля. Животных выводили из эксперимента с помощью передозировки диэтилового эфира и проводили забор тимуса и селезенки для гистологического исследования. Материал фиксировали в растворе Буэна, заливали в парафин, изготавливали гистологические срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином. На гистологических препаратах под световым микроскопом оценивали объемную плотность структурно-функциональных зон тимуса и селезенки методом точечного счета с помощью окулярной сетки Г.Г. Автандилова [1]. Ширину субкапсулярной зоны тимуса измеряли в микрометрах при ув. 400. Полученные данные подвергали статистической обработке. Достоверность различий между показателями определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни в программе Statistica 7.0. Различия считали достоверными при p < 0,05. Результаты и их обсуждение При морфологическом и морфометрическом исследовании органов иммунной системы самок крыс Вистар было обнаружено, что в фазе диэструса увеличена объемная плотность коркового вещества и снижена ширина субкапсуляр-ной зоны тимуса, а также увеличена объемная плотность белой пульпы и маргинальной зоны лимфоидных узелков селезенки по сравнению с фазой проэструса (табл. 1). 52 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Таблица 1 Морфометрические показатели тимуса и селезенки самок крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла Показатель Фаза эстрального цикла Проэструс Диэструс Тимус Корковое вещество, % 49,64±0,97 64,96±1,57* Субкапсулярная зона, мкм 34,55±0,59 24,02±0,55* ПАЛМ-зона, % 28,24±0,69 40,05±2,31* Лимфоидные узелки, % 15,45±0,43 29,20±2,53* Селезенка Белая пульпа, % 43,69±0,81 69,25±3,38* Светлые центры, % 22,40±0,84 20,74±1,42 Маргинальная зона, % 44,86±1,02 31,40±1,71* *-различия статистически значимы между группами Различия морфофункционального состояния иммунной системы у самок обусловлены, вероятно, различным уровнем продукции эстрадиола и прогестерона в разных фазах эстрального цикла. Расширение субкапсулярной зоны тимуса у самок в фазе проэструса может быть связано с повышенным уровнем прогестерона в сыворотке крови по сравнению с фазой диэструса. Известно, что прогестерон обладает выраженным иммуномодулирующим действием [10]. По данным литературы прогестерон может с высокой аффинностью связываться с глюкокортикоидны-ми рецепторами, которые экспрессируются лимфоцитами субкапсулярной зоны тимуса [7]. McMurray и соавт. [13] изучали влияние половых гормонов на процесс апоптотической гибели тимоцитов, индуцируемой глюкокортикоидами. Авторами было показано, что прогестерон подавляет спонтанную гибель Т-лимфоцитов и предотвращает апоптоз тимоцитов, индуцируемый глюкокортикоидами. Таким образом, антиапоптотические эффекты прогестерона, содержание которого в сыворотке крови повышается у самок в фазе проэст-руса, могут оказывать влияние на развитие Т-лимфоцитов тимуса, в связи с чем в этой фазе эстрального цикла, по-видимому, и наблюдается увеличение ширины субкап-сулярной зоны. Снижение объемной плотности коркового вещества тимуса, а также объемной плотности лимфоидных узелков и ПАЛМзоны селезенки у самок в фазе проэструса может быть связано с повышенным содержанием эстрадиола в сыворотке крови по сравнению с фазой диэструса. Известно, что эстрогены подавляют пролиферацию тимоцитов, но ускоряют их диффе-ренцировку и миграцию, а также повышают проницаемость сосудов тимуса [3, 6]. Этим обусловлено, вероятно, сужение коркового вещества тимуса у самок в фазе проэструса. Широко известно, что эстрогены активируют иммунную систему и способствуют интенсивной миграции лимфоцитов в барьерные органы [10, 12], что может приводить к снижению объемной плотности белой пульпы и расширению маргинальной зоны лимфоидных узелков селезенки у самок в фазе проэст-руса по сравнению с фазой диэструса. Таким образом, циклические изменения морфофункционального состояния иммунной системы у самок крыс Вистар определяется уровнем эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови и фазой эст-рального цикла. При иммунофенотипическом анализе основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови у самок в разных фазах эстрального цикла не было выявлено статистически значимых различий по показателям абсолютного и относительного количества Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических, активированных и регуляторных Т-клеток, а также иммунорегуляторного индекса (табл. 2). 53 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Таблица 2 Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови самок крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла Показатель Фаза эстрального цикла Проэструс Диэструс Лимфоциты, млн/мл 9,33±1,04 11,61±1,04 Т-лимфоциты Отн. число, % 55,66±3,20 63,63±2,43 Абс. число, млн/мл 5,13±0,59 6,96±0,85 Т-хелперы Отн. число, % 29,47±1,38 29,07±2,36 Абс. число, млн/мл 1,46±0,10 2,10±0,57 Цитотоксические Т-клетки Отн. число, % 27,14±3,46 33,91±4,42 Абс. число, млн/мл 1,47±0,31 2,34±0,54 В-лимфоциты Отн. число, % 30,36±2,39 24,84±2,09 Абс. число, млн/мл 2,79±0,35 3,07±0,34 Активированные Т-клетки Отн. число, % 8,24±0,55 7,31±0,76 Абс. число, млн/мл 0,12±0,01 0,15±0,04 Регуляторные Т-клетки Отн. число, % 3,50±0,30 4,17±0,39 Абс. число, млн/мл 0,05±0,01 0,08±0,02 Иммунорегуляторный индекс, усл. ед. 1,27±0,22 1,09±0,20 Индекс стимуляции, усл.ед. 5,35±0,73 3,14±0,40* *-различия статистически значимы между группами Влияние женских половых гормонов на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови изучено у человека и приматов, тогда как данные исследований на крысах и других грызунах в литературе отсутствуют. Показано, что количество Т-лимфоцитов и Т-хелперов увеличено у женщин в фолликулярной фазе овариального цикла по сравнению с лютеиновой фазой, а количество В -лимфоцитов практически не изменяется в разные фазы цикла [8]. По сравнению с женщинами репродуктивного возраста у женщин в постменопаузе наблюдается снижение уровня половых гормонов; при этом уменьшается количество Т-хелперов и В-лимфоцитов в периферической крови, но возрастает количество цитотоксиче-ских Т-клеток [8]. Половые гормоны играют важную роль в регуляции активности лимфоцитов. По данным Karpuzoglu и соавт. [9], Т-лимфоциты мышей, которым вводили наиболее активный эстроген 17β-эстрадиол, характеризуются повышенной экспрессией транскрипционного фактора T-bet по сравнению с контрольной группой. Увеличение экспрессии T-bet приводит к усилению продукции ИНФ-y Тлимфоцитами и поляризации иммунного ответа по Тх1-типу [9]. Нами, однако, не было выявлено различий субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в разные фазы эстрального цикла, хотя известно, что фаза диэструса характеризуется низким уровнем эстрогенов в сыворотке крови, а в фазе проэструса содержание эстрогенов достигает максимального уровня. Отсутствие значимых различий по показателям абсолютного и относительного количества лимфоцитов основных субпопуляций может быть связано с различным уровнем прогестерона у самок в разных фазах эстрального цикла. Данные о влиянии этого гормона на суб-популяционный состав лимфоцитов периферической крови немногочисленны. Известно, что прогестерон оказывает выраженное иммуномодулирующее влияние, поляризуя иммунный ответ по Тх2-типу [10]. Pavia и соавт. [14] показали, что прогестерон in vitro подавляет функциональную активность Т-лимфоцитов. Кроме того, выявлено, что при повышении уровня прогестерона в сыворотке крови у женщин наблюдается снижение количества развивающихся В-лимфоци- 54 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. тов в костном мозге [10]. Известно, что фаза проэструса характеризуется высоким уровнем прогестерона в сыворотке крови. Этот гормон может оказывать влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов и снижать абсолютное и относительное количество Т- и В-клеток в периферической крови. Индекс стимуляции гранулоцитов периферической крови, отражающий их фагоцитарную активность, был статистически значимо выше у самок в фазе про-эструса по сравнению с фазой диэструса (табл. 2). Известно, что эстрогены оказывают влияние на функционирование ней-трофилов периферической крови. Bekesi и соавт. [15] выявили, что эстрадиол снижает продукцию супероксидного радикала нейтрофилами и уменьшает интенсивность респираторного взрыва. Однако другие исследователи показали, что эстрогены не снижают активность респираторного взрыва в нейтрофилах [4]. Кроме того, известно, что фаза проэструса, при которой наблюдается максимальный уровень эстрогенов в сыворотке крови, характеризуется наиболее интенсивной реакцией иммунной системы на антигенные воздействия по сравнению с другими фазами эстрального цикла [10], что может обусловливать усиление фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови и, соответственно, индекса их стимуляции у самок в фазе проэструса. Выводы 1. Выявлены различия морфофункционального состояния органов иммунной системы у самок крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла. По сравнению с фазой проэструса у самок в фазе диэструса в тимусе увеличена объемная плотность коркового вещества и снижен показатель ширины субкапсулярной зоны, в селезенке увеличена объемная плотность белой пульпы и маргинальной зоны лимфоидных узелков. 2. Статистически значимых различий по показателям абсолютного и относительного числа Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических, активированных и регуляторных Т-клеток в перифе рической крови у самок в фазах проэстру-са и диэструса не обнаружено. 3. Выявлены различия фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови у самок в разные фазы эстрального цикла. По сравнению с фазой диэструса у самок в фазе проэструса выше индекс стимуляции гранулоцитов, отражающий их фагоцитарную активность.

Список литературы

Дополнительные файлы