The study of anthihypoxic and antiischemic activity of phytoecdysterone

Full Text

Гипоксия, или кислородное голодание, – типовой патологический процесс, возникающий в результате снижения содержания или использования О2 в тканях, а также чрезмерной нагрузки (когда возросшего количества О2 не хватает для обеспечения ещё более возросших потребностей тканей организма) [9]. Кислородная недостаточность служит патогенетической основой разнообразных заболеваний человека (разные формы дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности, кровопотери, ишемии миокарда, нарушений мозгового и периферического кровообращения и др.), часто обнаруживается в различных клиниках и является одной из центральных проблем медицины [8]. Поэтому детальное изучение патогенеза гипоксических состояний и разработка новых лекарственных препаратов, обладающих антигипоксической активностью, остаются актуальными проблемами современной науки и медицины [5]. Экдистероиды – это липофильные полигидроксилированные стероиды, являющиеся гормонами линьки в организме насекомых [16]. В организме млекопитающих они оказывают разнообразные позитивные эффекты: повышают физическую работоспособность, обладают анаболическим, гиполипидемическим, антигипергликемическим, иммунотропным и другими видами действия [4, 11]. Цель исследования – изучить антигипоксическую и антиишемическую активность фитоэкдистерона (ФЭ). Материалы и методы В эксперименте использовали водную вытяжку из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), содержащую 0,1% ФЭ. Концентрацию вещества определяли спектрофотометрически при длине волны 242 нм [4]. Работа проведена на 74 нелинейных белых крысах – самцах, массой 230-270 г. Содержание животных в виварии соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993. Исследования осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977). Всего проведено 5 серий опытов. 1 серия – контроль (n=19), представлена крысами, которым ежедневно в течение 14 дней внутрижелудочно вводили дистиллированную воду. 2, 3, 4 серии включали опытных животных, которым профилактически в желудок вводили ФЭ в дозе 5 мг/кг массы в течение 3 дней (два раза в день) (n=12), 7 (n=19) и 14 (n=12) дней (один раз в день). 5 серия представлена крысами (n=12), которым в течение 7 дней внутрижелудочно один раз в день вводили милдронат (МД) («Grindex») в дозе 250 мг/кг массы. 1 и 3 серии включали три подсерии животных, 2, 4 и 5 серии – две подсерии. Крысы первой подсерии 1, 2, 3, 4, 5 серий (по 7 животных в каждой подсерии) подвергались воздействию тяжелой острой гипобарической гипоксической гипоксии (ОГГГ), которую моделировали подъемом животных на высоту 11000 м со скоростью подъема и спуска 50 м/с. Устойчивость к гипоксии определяли по времени наступления клонико-тонических судорог. У животных второй подсерии 1, 2, 3, 4, 5 серий (по 5 животных в каждой подсерии) в конце эксперимента (после введения исследуемых веществ) под легким эфирным наркозом вскрывали грудную клетку, отмывали сокращающееся сердце в теплом (t 37,0 0C) физиологическом растворе, извлекали его и затем моделировали тотальную ишемию по методике К.А. Remier et al. (1981) в модификации Н.А. Сысолятиной (1991). Для этого, после отсечения предсердий, миокард желудочков рассекали ножницами на 3 части. Одну часть сразу опускали в фиксирующую жидкость (10% нейтральный формалин), остальные 2 части помещали в нагретые до 370С бюксы, на дне которых находилась фильтровальная бумага, смоченная физиологическим раствором. Бюксы плотно закрывали и помещали в термостат при температуре 370С. Через каждые 15 минут кусочек миокарда извлекали из бюкса и помещали в фиксирующую жидкость. После фиксации кусочки миокарда заливали в парафин и готовили срезы толщиной 8-10 мкм. Для выявления наиболее ранних изменений, обусловленных острым нарушением кровоснабжения миокарда, была использована специальная методика Г. Селье (1958), основанная на выявлении фуксинофильного субстрата. Принято считать, что его появление характерно лишь для самых начальных стадий поражения сердечной мышцы и предшествует развитию как некроза, так и апоптоза. Фуксинофильный субстрат полностью исчезает, когда мышечные волокна дезинтегрируются и находятся в процессе рассасывания. Морфометрию миокарда выполняли с использованием светооптического микроскопа Микмед-2, при увеличении в 280 раз. Микропрепараты фотографировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot G5 с переходником Carl Zeiss. Ввод и анализ изображений осуществляли с использованием компьютера Intel Pentium III и программы Photoshop CS2. Для определения удельной площади (SA мм2/мм2) фуксинофильного субстрата применяли метод точечного счета [3]. Животных третьей подсерии 1 и 3 серий (по 7 животных в каждой подсерии) после введения в течение 7 дней соответственно ФЭ или дистиллированной воды забивали под легким эфирным наркозом, после чего забирали для исследования головной мозг, сердце и печень. В гомогенатах этих органов определяли содержание глюкозы, молочной кислоты, гликогена – по общепринятым биохимическим методам, малонового диальдегида (МДА) по методу Гавриловой В.Б. и соавт. (1987) [2], свободных и связанных сульфгидрильных (SH) групп по методу Ellman G.L. (1959) [14], активность супероксиддисмутазы (СОД) по методу Костюк В.А. и соавт. (1990) [6], каталазы по методу М.А. Королюк с соавт. (1988) [1], глутатионпероксидазы по методу Paglia D.E., Valentine W.N. в модификации Ланкина В.З. (1976) [7], глутатион-SH-трансферазы по методу J.N. Keen, W.B. Iakoby (1978) [15], глутатионредуктазы по методу J. Carbery, B. Maunervik (1975) [13]. Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.1». Результаты представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое значение, m – ошибка среднего арифметического значения. Различия между группами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), тест Ньюмена-Кейсла. Результаты и их обсуждение Исследование влияния ФЭ на устойчивость крыс к ОГГГ выявило, что его профилактическое применение в течение 7 и 14 дней повышает резистентность животных на 52,5% (р=0,013) и 67,5% (р=0,0018) соответственно (рис. 1). Введение ФЭ в течение 3-х дней достоверно не изменяло устойчивость животных к ОГГГ. Превентивное введение МД в течение 7 дней повышало устойчивость животных к гипоксии на 47,5% (р=0,017). При изучении антиишемического эффекта ФЭ и МД, оцениваемого по площади фуксинофильного субстрата, были получены следующие результаты (табл. 1). Описание: C:\Users\Алексей\Desktop\Гипоксия.jpg n=7 Рис. 1. Влияние ФЭ и МД на устойчивость крыс к острой гипоксической гипобарической гипоксии (М±m) Сразу после забоя фуксинофильный субстрат в кардиомиоцитах интактных крыс наблюдался крайне редко, его удельная площадь составляла 0,25 мм2/мм2. Через 15 минут удельная площадь поражения достигала 0,49 мм2/мм2. 30-минутная экспозиция острой тотальной ишемии сердечной мышцы обусловила ещё более выраженную фуксинофилию – удельная площадь поражения достигала 0,61 мм2/мм2. Таблица 1 Влияние ФЭ и МД на площадь фуксинофильного субстрата (мм2/мм2) при экспериментальной тотальной ишемии миокарда (М±m) Серия опытов Площадь фуксинофильного субстрата в миокарде в динамике ишемии 0 минут 15 минут 30 минут Интактные крысы 0,25±0,019 0,49±0,027 0,61±0,031 Фитоэкдистерон, 3 дня 0,25±0,029 0,28±0,021* 0,37±0,039* Фитоэкдистерон, 7 дней 0,27±0,025 0,31±0,038* 0,35±0,045* Фитоэкдистерон, 14 дней 0,24±0,024 0,32±0,033* 0,38±0,041* Милдронат, 7 дней 0,23±0,021 0,42±0,044 0,47±0,037* Примечание: каждая серия включала по 5 крыс, * – достоверные различия (p<0,05) с показателями интактных крыс. Сразу после забоя крыс, получавших ФЭ, так и, получавших МД, гистологическая картина миокарда не отличалась от контрольной группы. 15-минутная экспозиция миокарда на фоне 3-дневного назначения ФЭ приводила к снижению удельной площади поражения на 42,5% (р<0,05), на фоне 7-дневного введения – на 37,2% (р<0,05), на фоне 14 дневного применения – на 34,3% (p<0,05), а на фоне введения МД – лишь на 13,3% (p>0,05). Через 30 минут ишемии на фоне 3-дневного введения ФЭ удельная площадь фуксинофильного субстрата уменьшилась на 40,1% (р<0,05), на фоне 7-дневного введения ФЭ – на 42,4% (р<0,05), на фоне 14 дневного назначения ФЭ – на 37,2% (p<0,05), а на фоне введения МД – только на 23% (р<0,05) по сравнению с показателями интактных крыс. Полученные данные свидетельствуют о том, что ФЭ обладал отчетливым антигипоксическим действием, которое было даже более значительным, чем у известного лекарственного препарата МД, обладающего выраженным метаболическим и цитопротекторным действием. Данный эффект ФЭ проявлялся как на системном уровне (повышение резистентности организма крыс к ОГГГ), так и на тканевом (снижение площади фуксинофильного субстрата при тотальной ишемии миокарда). При изучении механизмов развития данного эффекта установлено (табл. 2), что введение ФЭ в течение 7 дней интактным крысам повышает содержание в миокарде гликогена на 24,9% (р<0,05), глюкозы на 25,6% (р<0,05), в печени – гликогена на 8,9% (р<0,05) и активности каталазы на 28,6% (р<0,05), а также снижает содержание МДА на 28,6% (р<0,05), а в мозге повышает уровень гликогена на 10,7% (р<0,05), глюкозы на 20,3% (р<0,05), активность глутатионпероксидазы на 8,3% (р<0,05) и снижает содержание лактата на 23,5% (р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что ФЭ положительно влияет на метаболизм исследуемых жизненно важных органов, в частности стимулирует аэробное окисление и снижает анаэробные процессы (судя по уменьшению уровня лактата, повышению содержания глюкозы и гликогена), что может лежать в основе его антигипоксического эффекта [5]. В тоже время, повышение активности каталазы и снижение уровня МДА в печени под влиянием ФЭ может оказывать дополнительное протекторное действие на Подпись: Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2011 Таблица 2 Влияние 7 дневного введения ФЭ на биохимические показатели миокарда, печени и мозга (М±m) Изучаемые показатели, единицы измерения Миокард Печень Мозг Норма фитоэкдистерон Норма фитоэкдистерон норма фитоэкдистерон Гликоген, мг/г 3,4±0,23 4,25±0,12* 42,3±1,7 46,1±3,3* 1,4±0,11 1,55±0,14* Лактат, мкмоль/г 5,9±0,45 5,1±0,39 1,9±0,17 1,6±0,12 1,7±0,13 1,3±0,1* Глюкоза, мкмоль/г 4,3±0,33 5,4±0,43* 6,7±0,55 7,3±0,67 0,7±0,05 0,84±0,06* Общие SH-группы, мкмоль/мг белка 0,68±0,048 0,65±0,053 0,79±0,045 0,83±0,056 0,39±0,025 0,44±0,039 Свободные SH-группы, мкмоль/мг белка 0,19±0,013 0,18±0,0094 0,17±0,011 0,15±0,0092 0,11±0,0078 0,1±0,0063 Подпись: 34МДА, нмоль/мг белка 2,5±0,15 2,8±0,18 2,83±0,18 2,02±0,12* 13,32±1,05 12,64±0,87 СОД, Ед/мг белка 3,36±0,15 3,07±0,24 2,97±0,17 2,79±0,14 4,01±0,27 3,76±0,31 Глутатионпероксидаза, нмоль НАДФН/ мин´ мг белка 21,3±0,86 20,5±1,07 22,5±1,35 21,92±1,15 8,5±0,32 9,2±0,21* Глутатион-SH-трансфераза, нмоль ХДНБ/ мин´ мг белка 53,3±1,9 55,18±2,7 140,69±2,6 138,4±2,7 112,18±3,5 115,83±3,8 Глутатионредуктаза, нмоль НАДФН/ мин´ мг белка 22,86±0,8 21,03±0,9 52,26±1,96 48,95±1,77 24,86±1,11 23,56±0,78 Каталаза, МЕ/мг белка 5,58±0,32 5,0±0,38 5,6±0,4 7,2±0,5* 1,24±0,07 1,26±0,06 * – достоверные различия (p<0,05) по сравнению с показателями интактных крыс. гепатоциты. Однако, в наших экспериментах уровень общих и свободных SH-групп, а также активность глутатионредуктазы, глутатион-SH-трансферазы и СОД в исследуемых органах на фоне 7-дневного применения ФЭ у подопытных крыс достоверно не изменялись. Выводы 1. Курсовое ежедневное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипобарической гипоксической гипоксии. 2. Профилактическое ежедневное применение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 3, 7 и 14 дней повышает устойчивость кардиомиоцитов сердца крыс к тотальной ишемии. 3. Ежедневное применение фитоэкдистерона в течение 7 дней приводит к существенным метаболическим перестройкам в жизненно важных органах крыс: а) в миокарде – к повышению уровня гликогена и глюкозы; б) в печени – к увеличению содержания гликогена, активности каталазы и уменьшению содержания МДА; в) в мозге – к повышению уровня гликогена, глюкозы, активности глутатионпероксидазы и снижению количества лактата. 4. Фитоэкдистерон оказывает более выраженное антигипоксическое и антиишемическое действие на организм крыс по сравнению с милдронатом.

References

Supplementary files