ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПОРАЖЕНИЙ МЯГКИХ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ

Полный текст

В настоящее время фармакология располагает достаточно большим арсеналом иммуномодулирующих средств, применяемых при различных видах патологии, включая воспалительный процесс. Новый отечественный препарат трекрезан - триэтаноламмониевая соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты - представляет собой высокоэффективное фармакологическое средство с адаптогенным и иммуностимулирующим действием. Трекрезан относится к малотоксичным 21 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. соединениям (IV класс токсичности) с ЛД50 > 2,5 г/кг у мышей и > 6,5 г/кг у крыс. Он оказывает стресспротекторное действие в моделях иммобилизационного и болевого гиподинамического стресса, ускоряет репарацию поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора, обладает антиок-сидантной активностью [16, 17]. Экспериментальными и клиническими исследованиями доказано, что фармакодина-мические эффекты трекрезана сводятся, в основном, к следующим видам активности: 1) адаптогенная, 2) иммуностимулирующая, 3) энергостабилизирующая (ан-тиастеническая), 4) противовоспалительная, 5) антиоксидантная, 6) антитоксическая [16]. Учитывая, что большинство экспериментов с трекрезаном выполнено при его введении внутрибрюшинно, а по инструкции препарат вводится внутрь, а также то, что трекрезан представляет собой триэтаноламмониевую соль 2-метилфеноксиуксусной кислоты (в молекуле значимы ионные и водородные связи), возникает вопрос, действует ли сама молекула трекрезана или ее компоненты, поскольку в водных средах трекрезан должен диссоциировать. С другой стороны, иммуномодуляторы применяются во всех областях медицины, включая стоматологию, хотя в последней весьма осторожно, что связано с недостаточностью экспериментальных данных, подтверждающих эффективность иммуномодуляторов в стоматологической практике. В этом случае особенно важна оценка как местных изменений тканей пародонта, так и системных отклонений в функциях организма, на которые, как правило, обращают меньшее внимание [7, 8]. Целью исследования была оценка противовоспалительного и иммуностимулирующего действия трекрезана, вводимого различными путями в организм (внутрь и внутрибрюшинно), в экспериментальной модели воспалительнодегенеративных нарушений тканей паро-донта у грызунов (крыс). Материалы и методы Животные и модель. Опыты выполнены на 79 крысах самцах Вистар массой 220-250 г. С целью воспроизведения воспалительно-дегенеративных повреждений мягких тканей пародонта крысам, наркотизированным эфиром, в наружную часть десны на уровне нижних коренных зубов вводили по 0,15 мл с каждой стороны 2%-ного водного раствора формальдегида (всего объем вводимого раствора составил 0,3 мл). Инъекции производили однократно. Контрольные животные получали инъекции 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологического раствора) в тех же объемах. Уже через сутки на месте введения формалина развивались стойкие обширные воспалительно-дегенеративные изменения мягких тканей пародонта, которые сохранялись до 2 недель. Помимо измененных тканей пародонта воспаление развивалось и на внутренней части щек, поскольку у крысы щеки небольшие, тонкие, в норме их внутренняя поверхность гладкая, в ней находятся протоки слюнных желез. Внешне облик крысы менялся. Из-за отека мягких тканей щек обычная вытянутая форма морды животного изменялась, щеки раздувались, и животное становилось похожим на хомяка. Такой вид животных сохранялся обычно 3-4 дня, постепенно отек мягких тканей уменьшался. В отдельных случаях (приблизительно у 10% животных) наблюдали абсцедирование процесса, тогда отечность мягких тканей сохранялась более длительно [8, 18]. Дизайн исследования. Для лечения воспалительно-дегенеративных поражений мягких тканей пародонта использовали субстанцию трекрезана (ОАО «Усолье-Сибирский ХФЗ», Иркутская область), вводимую в дозе 50 мг/кг в течение 3 дней подряд внутрибрюшинно (в/бр) или внутрь (внутрижелудочно с помощью зонда). В отдельной серии исследований использовали предварительное введение лидокаина 1% раствора 0,3 мл внутрижелудочно за 10 мин до введения трекрезана внутрь. Формировали следующие группы: 1) контроль 1 (интактные); 2) воспаление + физиологи 22 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. ческий раствор (контроль 2); 3) воспаление + трекрезан в/бр; 4) воспаление + трекре-зан внутрь; 5) воспаление + лидокаин + трекрезан внутрь. После окончания всех опытов животных умерщвляли декапитацией, в крови биохимически определяли содержание малонового диальдегида (МДА) и диеновых коньюгатов (перекисное окисление липидов) [6, 13, 15], а также оценивали активность антиоксидантных систем (содержание восстановленного глутатиона и активность супероксиддисмутазы - СОД) [1, 13]. Содержание молочной и пировиноградной кислот определяли в крови энзиматическим методом [19] в модификации [2]. Кроме того, в крови исследовали показатели иммунного статуса. Для изучения клеточного звена иммунитета использовали реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с митогенами [12]. В качестве последних применяли фитогемагглютинин (ФГА) и конканава-лин А (Кон-А). Состояние механизмов неспецифической защиты организма оценивали по показателям фагоцитоза [10], лизосомально-катионного теста (ЛКТ) [12], теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [3-5, 11]. Статистическая обработка результатов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10 крыс. Математическую обработку результатов исследования проводили на компьютере с использованием стандартного пакета про грамм STATISTICA for Windows по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по t-критерию Стьюдента при уровне значимости 95% (р<0,05). В тексте, таблицах результаты экспериментов представлены в виде M + m, где: М - среднее арифметическое, m - среднеквадратичная ошибка среднего арифметического, n - число животных в группах. Результаты и их обсуждение Наблюдение за крысами с воспалительно-дегенеративным поражением мягких тканей пародонта показало, что в первые сутки после введения формальдегида у них несколько снижается двигательная активность, они меньше потребляют пищи. Уже на 2-е сутки уровень потребления пищи восстанавливается и по поведению эти животные практически не отличаются от контрольных. В месте введения раствора формальдегида у животных развивается стойкое повреждение мягких тканей. Визуально и морфологически оно может быть описано как воспалительно-дегенеративное поражение наружной части десен и мягких тканей пародонта. В крови животных с воспалением на 3-и сутки в 5,8 раз увеличивалось содержание МДА, в 3,6 раз уровень диеновых конъюгатов, на 71% снижалось содержание восстановленного глутатиона и на 75% активность супероксиддисмутазы (табл. 1). Таблица 1 Содержание продуктов перекисного окисления липидов, активность антиоксидантных систем, концентрации лактата и пирувата в крови крыс на 3-и сутки воспалительно-дегенеративного поражения мягких тканей пародонта (М ± m) Г руппы МДА, нмоль/мл ДК, мкмоль/мл Восстановленный глутатион, мкмоль/мл СОД, А/мл Лактат, мкмоль/мл Пируват, мкмоль/мл Интактные (контроль 1) 2,82±0,24 8,83±0,50 2,52±0,28 1,65±0,35 2,68±0,15 0,44±0,03 Воспаление 16,39±0,80* 31,40±2,18* 0,74±0,05* 0,42±0,05* 8,86±0,43* 0,12±0,01* Примечание: *р<0,05 в сравнении с интактными животными У животных, перенесших воспа- уровня лактата в 3,3 раза на фоне ление, наблюдали признаки лактацидоза, снижения на 73% содержания пирувата. что проявлялось в увеличении в крови 23 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. Моделируемое воспалительно дегенеративное поражение мягких тканей пародонта у крыс сопровождалось угнетением лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканавалином А на 39% и с фитогемагглютинином на 37% (табл. 2). Активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов снижалась на 13%, что характерно для подострого и хронического течения воспалительного процесса. На фоне воспаления у крыс достоверно увеличивалось значение фагоцитарного числа на 26% и показателя завершенности фагоцитоза - на 22%, при снижении на 31% числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе. Наряду с этим, показатели спонтанного НСТ-теста повышались на 63%, а стимулированного - на 35%. Таблица 2 Изменение иммунологических показателей у крыс на 3-и сутки воспалительно-дегенеративного поражения мягких тканей пародонта (М ± m) Показатели Г руппы животных Интактные (контроль 1) Воспаление РТМЛ с КонА, % 84,00±2,00 51,21±6,65* РТМЛ с ФГА, % 54,60±3,40 34,50±9,98* ФП, % 95,00±0,82 65,49±4,09* ФЧ 12,57±0,34 15,78±1,16* ПЗФ, % 22,50±1,40 27,39±2,95* ЛКТ, усл.ед. 1,49±0,02 1,29±0,03* НСТ спонтанный, усл.ед. 0,24±0,02 0,39±0,04* НСТ стимулированный, усл.ед. 0,54±0,03 0,73±0,04* Примечание: РТМЛ - реакция торможения миграции лимфоцитов; Кон-А -конканавалин А; ФГА - фитогемагглютинин; ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза; ФП - фагоцитарный показатель; ФЧ - фагоцитарное число; ЛКТ -лизосомально-катионный тест; НСТ - тест восстановления нитросинего тетразолия, * р<0,05 в сравнении с контролем Таким образом, моделируемое воспалительно-дегенеративное поражение мягких тканей пародонта у крыс сопровождается выраженными метаболическими нарушениями, заключающимися в лакта-цидозе и активации процессов ПОЛ на фоне угнетения активности антиоксидант-ных систем в крови животных. Наряду с этим, воспаление протекает на фоне измененного фагоцитоза, дисфункция которого выражается в угнетении поглотительной и бактерицидной способностей нейтрофилов крови. Степень снижения показателей фагоцитоза находится в прямой корреляции со степенью тяжести воспалительной реакции. У крыс наблюдали признаки развития вторичного иммунодефицита, заключающиеся в повышенной фагоцитарной активности лимфоцитов, угнетении Т-лимфоцитарной функции и активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов. На фоне внутрибрюшинного введе -ния животным трекрезана содержание МДА в крови снижалось на 61%, диеновых конъюгатов - на 68%, возрастало содержание восстановленного глутатиона в 2,9 раз и увеличивалась активность СОД на 79% (табл. 3). При введении трекрезана внутрь содержание МДА в крови животных снижалось на 35%, диенов - на 40%, увеличивалось содержание глутатиона на 66% и активность СОД на 55%. Применение трекрезана внутрь через 10 мин после внутрижелудочного введения лидокаина с целью блокады афферентов сопровождалось снижением уровня МДА в крови на 45%, диенов - на 51%, увеличением содержания глутатиона на 93% и активности СОД на 76%. На уровень лактата и пирувата более выраженное действие оказывало введение трекрезана внутри-брюшинно: содержание лактата в крови 24 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. снижалось в 2,6 раза, пирувата в 2 раза. Введение трекрезана внутрь и на фоне действия лидокаина в равной степени снижало уровень лактата (на 32% и 35%) и пирувата (в 2 и 2,3 раза). На фоне действия трекрезана, вводимого крысам с воспалительно-дегенеративным поражением мягких тканей пародонта разными путями, наблюдается тенденция к восстановлению иммунологических показателей. Внутрибрюшинное введение трекреза-на крысам с воспалительно-дегенеративным поражением мягких тканей пародонта приводило к достоверному повышению лимфо-кинпродуцирующей функции лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с Кон-А на 67% и с ФГА - на 73%. Фагоцитарная активность нейтрофилов увеличивалась на 24%. Фагоцитарное число, равное среднему числу микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом, и показатель завершенности фагоцитоза снижались на 26% и 14% соответственно (табл. 4). Таблица 3 Влияние трекрезана при различных путях введения на показатели перекисного окисления липидов, активность антиоксидантных систем и уровень лактата и пирувата в крови на 3-и сутки воспалительно-дегенеративного поражения мягких тканей пародонта (М ± m) Г руппы МДА, нмоль/мл ДК, мкмоль/мл Восстановленный глутатион, мкмоль/мл СОД, А/мл Лактат, мкмоль/мл Пируват, мкмоль/мл Воспаление (контроль 2) 16,39±0,80* 31,40±2,18* 0,74±0,05* 0,42±0,05* 8,86±0,43 0,12±0,01 Воспаление + трекрезан в/бр 6,34±0,60 10,04±0,78 2,15±0,11 0,75±0,03 4,40±0,60 0,31±0,03 Воспаление + трекрезан внутрь 10,65±0,74 18,79±0,80 1,23±0,16 0,65±0,04 6,05±0,31 0,25±0,02 Воспаление + лидокаин + трекрезан внутрь 9,01±0,89 15,41±0,84 1,43±0,08 0,74±0,09 5,73±0,48 0,27±0,02 Примечание. *р<0,05 в сравнении с контролем Таблица 4 Изменение иммунологических показателей у крыс с воспалительно-дегенеративным поражением мягких тканей пародонта (М ± m; n = 8) Показатели Контроль 2 (воспаление) Введение трекрезана внутрибрюшинно внутрь на фоне лидокаина РТМЛ с КонА, % 51,21±13,3 85,63±7,63* 69,28±3,09 60,37±3,98 РТМЛ с ФГА, % 34,50±9,98 59,75±12,30* 45,46±1,64 42,80±2,37 ФП, % 65,49±4,09 81,17±1,81 * 75,91±3,92 75,56±3,40 ФЧ 15,78±1,16 11,62±0,51* 8,95±0,29* 8,94±1,03* ПЗФ, % 27,39±2,95 23,46±0,96 18,53±0,93* 15,28±0,68* ЛКТ, усл.ед. 1,29±0,03 1,59±0,02* 1,43±0,02* 1,38±0,03* НСТ спонтанный, усл.ед. 0,39±0,04 0,16±0,02* 0,28±0,04* 0,27±0,04* НСТ стимулированный, усл.ед. 0,73±0,04 0,47±0,07* 0,45±0,03* 0,47±0,02* Примечание. РТМЛ - реакция торможения миграции лимфоцитов; Кон-А -конканавалин А; ФГА - фитогемагглютинин; ПЗФ - показатель завершенности фагоцитоза; ФП - фагоцитарный показатель; ФЧ - фагоцитарное число; ЛКТ -лизосомально-катионный тест; НСТ - тест восстановления нитросинего тетразолия, *р<0,05 в сравнении с контролем 25 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. При введении крысам трекрезана внутрь функциональная активность лимфоцитов повышалась в реакции торможения миграции лейкоцитов с Кон-А на 35%, с ФГА - на 328%. Фагоцитарная активность нейтрофилов увеличивалась на 16%, фагоцитарное число снижалось на 43% и показатель завершенности фагоцитоза на 32%. Применение трекрезана на фоне предварительного введения лидокаина сопровождалось увеличением реакции торможения миграции лейкоцитов с Кон-А на 18%, с ФГА на 24%. Величина фагоцитарной активности возрастала на 15%, значение фагоцитарного числа снижалось на 43% и показателя завершенности фагоцитоза на 44%. Разные пути введения трекрезана приводили к изменению активности ки-слородзависимых антиинфекционных систем лимфоцитов, характеризующих степень активации гексозомонофосфатно-го шунта и связанное с этим образование свободных радикалов. В группе животных, получавших трекрезан внутрибрюшинно, показатели спонтанного НСТ-теста снижались по сравнению с контролем на 59%, а стимулированного НСТ-теста - на 26% (р<0,05). У животных, получавших трек-резан внутрь, значения спонтанного НСТ-теста снижались на 28%, а стимулированного - на 38%. Животные, получавшие трекрезан внутрь на фоне действия лидо-каина, демонстрировали увеличение значения в спонтанном НСТ тесте на 31%, в стимулированном - на 36% по сравнению с контролем. При этом активность кисло-роднезависимых микробицидных систем фагоцитов (ЛКТ тест) увеличивалась при внутрибрюшинном введении трекрезана на 15%, при применении внутрь - на 26% и на фоне лидокаина - на 7%. Полученные результаты показывают, что при моделировании воспалительно-дегенеративного поражения мягких тканей пародонта на первый план выходят не столько местные изменения, которые мы описывали ранее [7, 9, 20], сколько системные сдвиги в оксидативном и иммунном статусе. Система перекисного окисления липидов при данном виде воспаления весьма реактивна, и на 3 -и сутки воспаления мы регистрировали в крови увеличение содержания МДА и диеновых конъюгатов в 3-6 раз. Параллельно меняется иммунный статус крыс. В частности, угнетается лимфокин-продуцирующая функция лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканава-лином А (на 39%) и с фитогемагглютини-ном (на 37%). Функция фагоцитоза также меняется: активность кислороднезависи-мых микробицидных систем фагоцитов снижается, увеличивается значение фагоцитарного числа (на 26%) и показателя завершенности фагоцитоза (на 22%) при снижении числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе (на 31%). Показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста повышаются, соответственно, на 63% и 35%. Все это указывает на динамические изменения в организме, которые могут рассматриваться как соответствующая база для оценки противовоспалительного и иммуностимулирующего действия иммуномодуляторов. В качестве такого средства мы выбрали отечественный препарат трекрезан, представляющий собой триэтаноламмониевую соль 2-метилфен-оксиуксусной кислоты. Препарат создан в Иркутском институте органической химии СО РАН в 1990-х гг. и проходил изучение в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ. Первоначально он был позиционирован как синтетический адаптоген и изучался именно с этих позиций [18], но позднее у трекрезана была выявлены иммуностимулирующие, энергостабилизирующие (антиастенические), противовоспалительные, антиоксидантные и антитоксические свойства [16], что заставило пересмотреть возможные направления его практического применения. В большей степени нас заинтересовала его иммуностимулирующая и интерфероногенная активность, позволяющая использовать препарат для профилактики и лечения ОРВИ и других видов бронхолегочных заболеваний [17]. Касательно выбранного нами направления исследований важным аспек 26 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. том их было оценить, в какой степени действие трекрезана зависит от способа его применения. В данной работе было подтверждено, что трекрезан в оптимальных дозах (50 мг/кг) оказывает свое положительное противовоспалительное и иммуностимулирующее действие независимо от способа применения - внутрь или внутрибрюшинно, хотя при внутрибрю-шинном введении эффекты трекрезана были выражены несколько сильнее, чем при приеме внутрь (сопоставительные данные не достоверны). Этим было доказано, что фармакодинамика трекрезана существенно не отличается при его введении в организм разными способами. Второй аспект был связан с возможным действием трекрезана на желудочные аффе-ренты, активация которых приводит к неспецифическим адаптогенным эффектам, например, при введении медиаторных субстанций внутрижелудочно [14]. Этот вопрос также был разрешен: предварительная инактивация желудочных афферентов введением внутрь местного анестетика лидокаина не блокировала действие трек-резана, также вводимого внутрь после анестетика. Из этого можно заключить, что эффекты трекрезана развиваются только после его всасывания в кровь, то есть тип действия трекрезана описывается как традиционный и ожидаемый и не включает активации рефлексогенных зон желудка. При этом по выраженности противовоспалительный и иммуностимулирующий эффект трекрезана следует оценить как выраженный, а его механизм действия как метаболический, связанный с прямым влиянием на процессы энергообразования, оксидации/антиоксидации и иммунитета. Выводы 1. Воспалительно-дегенеративное поражение тканей пародонта у крыс сопровождается изменением оксидативного статуса животных в форме резкого увеличения содержания малонового диальдегида и диеновых конъюгатов и угнетения систем ан-тиоксидантной защиты (восстановленный глутатион, активность СОД) в крови. 2. При моделировании данной формы воспаления угнетается лимфокинпродуцирующая функция лимфоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканавалином А (на 39%) и с фитоге-магглютинином (на 37%). Функция фагоцитоза также меняется: активность ки-слороднезависимых микробицидных систем фагоцитов снижается, увеличивается значение фагоцитарного числа (на 26%) и показателя завершенности фагоцитоза (на 22%) при снижении числа нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе (на 31%). Показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста повышаются. 3. Трекрезан при подостром введении (3 дня) оказывает противовоспалительное действие, оцениваемое по снижению в крови содержания малонового диальдегида и диеновых конъюгатов и восстановления систем антиоксидантной защиты (восстановленный глутатион, активность СОД) в крови. При этом наблюдается повышение лимфокинпродуцирующей функции лимфоцитов и восстановление фагоцитарной активности нейтрофилов. 4. Эффекты трекрезана мало зависят от способа введения препарата: при внут-рибрюшинном введении они несколько более выражены, чем при введении внутрь, однако действие трекрезана не связано с вовлечением желудочных афферентов.

Список литературы

Дополнительные файлы