Изучение влияния L-карнитина на изменение активности катепсинов B, L, H и окислительной модификации белков в мышечных органах крыс

Полный текст

Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. L-карнитин впервые был выделен в 1905 г. В.С. Гулевичем и Р. Кримбергом из экстракта мышечной ткани. С момента открытия L-карнитина прошло более 100 лет, накоплен большой материал о его свойствах и возможностях применения. Окислительное карбонилирование белков представляет собой процесс их ковалентной модификации, вызванной как непосредственным воздействием активных форм кислорода, так и косвенным взаимодействием с вторичными продуктами окси-дативного стресса [1, 2]. Одним из наиболее значимых последствий данного феномена считается агрегация белков, способная привести не только к структурным, но и к функциональным нарушениям [1]. Участие карнитина в окислительном карбонилиро-вание является доказанным фактом, однако работ в этой области мало. Деградация дефектных, в том числе окислительно-модифицированных, белков происходит за счет лизомальных протеи-наз. Выявление ключевых моментов взаимодействия позволит лучше понять биохимическую связь между окислительным модифицированием и лизосомаль-ным протеолизом. Целью данного исследования является изучение влияния L-карнитина на изменение лизосомальной активности и окислительной модификации мышечных тканей и выявление взаимосвязи между этими процессами. Задача - проведение исследований, описание и выявление корреляционных связей окислительной модификацией белков и лизосомального протеолиза в изучаемых экспериментальных моделях. Материалы и методы Работа выполнена на 48 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 граммов. Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли в соответствии с: «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993; «Международными рекомендациями по проведению медико- биологических исследований с использованием животных» (1985 г.) и приказу МЗРФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Экспериментальная группа № 1: осуществляли введение карнитина хлорида в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно, 1 раз в день, в течение 21 дня; группа № 2: осуществляли введение карнитина хлорида в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 21 дня, одновременно внутрибрюшинно вводили L-NAME 25 мг/кг с 14-х по 21-е сутки; группа № 3: осуществляли внутри-брюшинное введение карнитина хлорида в дозе 300 мг/кг в течение 21 дня; одновременно внутрижелудочно вводили раствор L-аргинина на 0,9 % растворе NaCl в дозе 500 мг/кг [3] через стеклянный градуированный шприц с внутрижелудочным зондом с 11-е по 21-е сутки. Животным контрольной группы осуществляли введение физиологического раствора, вариант введения, объемы раствора и продолжительность воздействия совпадали с таковыми для экспериментальной группы. Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим методом [4]: в седиментируемой (СА) и неседиментируемой (НСА) фракциях. Общую активность (ОА) расчитывали как сумму СА и НСА. Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по методу R.L. Le- 14 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. vine в модификации [5]. По полученным значениям экстинкций строили спектр окислительной модификации белков и подсчитывали площадь под кривой: раздельно алифатических альдегид-динитро-фенилгидразонов нейтрального характера (S АДНФГ^) и основного (S АДНФГ^); и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального (S КДНФГ^) и основного характера (S КДНФГте); а также их общую сумму (S ОМБ) [6]; выражали в условных единицах на грамм белка (у.е./г белка). Статистический анализ проведен с использованием «Statistica 10.0». При отсутствии согласия большинства данных с нормальным распределением, вычисляли: медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное (max) значение, для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали кри терий Манна-Уитни (U-тест). Для оценки корреляции использовали коэффициент Спирмена. Результаты и их обсуждение Статистически значимый рост показателей группы животных с применением карнитина относительно контрольной группы, свидетельствует о выраженном нарастании окислительной модификации (табл.1). Являясь антагонистами в действии на апоптоз - L-аргинин и карнитин [7], характеризуются в группе сочетанного воздействия резким статистически значимым снижением показателей S ОМБ по сравнению с изолированным введением карнитина. В модели сочетанного воздействия препаратами карнитина и L-NAME отмечается незначительное снижение показателей сочетанной группы относительно карнитина. Таблица 1 Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов спонтанной ОМБ и их компонентов в участке грудной аорты (у.е./г белка) Показатель S АДНФГи„ S АДНФГ vs S КДНФГи„ S КДНФГ vs S ОМБ Контроль 3,65 [2, 67;5, 31] 0,98 [0, 58; 2, 99] 1,17 [0, 63; 3, 08] 0,17 [0, 05; 0, 35] 6,68 [4, 12; 11, 61] Карнитин 8,91 [6, 83; 11, 58] * 3,60 [2, 44; 4, 72] * 3,01 [1, 63; 5, 57] * 0,61 [0, 40; 0, 83] * 16,45 [11, 83; 21, 98] * Карнитин + аргинин 0,82 [0, 63; 1, 05] * ' 0,97 [0, 74; 1, 85] ■ 0,90 [0, 63; 1, 42] ' 0,16 [0, 11; 0, 28] ' 2,88 [2, 18; 4, 34] * ■ Карнитин + L-NAME, 25 4,78 [4, 45; 9, 82] 3,59 [2, 07; 4, 61] * 3,00 [1, 76; 4, 43] * 0,67 [0, 30; 0, 85] * 11,76 [8, 96; 19, 71] * Примечание: * - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05) ■ - статистически значимые отличия от группы карнитина (р<0,05) Карнитин изолированно и в сочетаниях с регуляторами синтеза оксида азота в участке ткани миокарда демонстрирует тенденцию статистически значимого устойчивого снижения S ОМБ по отношению к контролю. Аминокислотные остатки нейтрального характера карнитин-зависимых животных и S ОМБ имеют статистически значимые отличия от контроля. Общеизвестно, что карнитин обладает значительными антиоксидантными эффектами в ус ловиях стресса, выступая в качестве протектора от окислительных повреждений тканей. Сочетанное введение препаратов - активаторов синтеза оксида азота ведет к статистически значимому снижению относительно контроля показателей S ОМБ и S АДНФГ^ (табл. 2). Возможно, одной из причин может быть переизбыток синтезированного посредством аргинина и карнитина оксида азота. Все показатели группы животных, принимающих на фоне карнитина L-NAME, 15 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. отмечали незначительное снижение резуль- карнитина, что может являться признаком татов относительно не только контроля, но и частичной разблокировки NO-синтаз. Таблица 2 Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов спонтанной ОМБ и их компонентов в миокарде (у.е./г белка) Показатель SАДНФГда S АДНФГvs S КДНФГUv S КДНФГ„ S ОМБ Контроль 28,09 [19, 58; 38, 44] 1,98 [0, 81; 5, 21] 1,59 [0, 41; 4, 77] 0,31 [0, 13; 0, 71] 31,97 [23, 79; 40, 19] Карнитин 6,77 [3, 57; 9, 61] * 3,40 [2, 02; 6, 05] 3,17 [1, 65; 5, 25] * 0,54 [0, 16; 1, 16] 13,73 [7, 85; 21, 89] * Карнитин + аргинин 3,81 [3, 16; 4, 69] * 2,03 [1, 43; 3, 65] 1,45 [1, 03; 2, 30] 0,30 [0, 21; 0, 64] 8,55 [5, 87; 10, 45] * Карнитин + L-NAME, 25 3,65 [2, 13; 4, 08] * 2,56 [1, 31; 4, 38] 2,15 [0, 69; 3, 94] 0,44 [0, 19; 0, 91] 7,98 [5, 16; 13, 31] * Примечание: * - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05) ■ - статистически значимые отличия от группы карнитина (р<0,05) Участок скелетной мускулатуры экспериментального животного с введением изолированного карнитина (табл. 3) характеризуется статистически значимым снижением относительно контроля общей площади и S АДНФГ^. Экспериментальная группа с сочетанным введением кар-нитина и аргинина поддерживает тенденцию к снижению относительно контроля. Возможно, в данном случае нужно рас сматривать NO как цитотоксический фактор, индуцирующий апоптоз. Сочетанная группа препаратов карнитина и L-NAME, 25 мг/кг демонстрирует снижение относительно контроля у показателей общей ОМБ и S АДНФГ^; причиной повышения относительно группы с введением карни-тина, является, вероятно, истощение субстрата у группы с применением изолированного препарата. Таблица 3 Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов спонтанной ОМБ и их компонентов в скелетной мускулатуре (у.е./г белка) Показатель S АДНФГ uv S АДНФГ vs S КДНФГ uv S КДНФГ vs S ОМБ Контроль 28,61 [22, 34; 35, 12] 3,04 [0, 64; 6, 81] 2,75 [0, 75; 6, 31] 0,54 [0, 11; 1, 28] 34,94 [28, 82; 38, 96] Карнитин 6,81 [5, 45; 10, 37] * 2,55 [1, 35; 4, 24] 2,17 [1, 32; 5, 10] 0,50 [0, 29; 0, 60] 11,73 [9, 50; 20, 22] * Карнитин + аргинин 6,85 [4, 04; 8, 27] * 1,36 [1, 13; 3, 30] 1,57 [1, 30; 3, 33] 0,21 [0, 15; 0, 59] 9,45 [6, 97; 15, 22] * Карнитин + L-NAME, 25 9,16 [6, 05; 11, 69] * 2,81 [1, 82; 4, 83] 3,07 [1, 88; 5, 28] 0,48 [0, 15; 0, 82] 15,52 [10, 06; 22, 40] * ■ Примечание: * - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05) ■ - статистически значимые отличия от группы карнитина (р<0,05) 16 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. Показатели активностей катепсинов В, L, Н группы карнитина изолированно и в сочетании с модуляторами синтеза азота в сосуде характеризуются динамикой снижения показателей относительно контроля; статистически значимых изменений группа № 1 в участке аорты не демонстрирует. Преобладание результатов активностей протеиназ сочетанной группы стимуляции синтеза азота над группой с блока-тором NO-синтазы (рис.1), возможно объясняется активацией цитопротективных свойств cNOS по механизму обратной связи. Статистически значимые снижения показателей у карнитин-принимающих животных на фоне аргинина относительно группы изолированного применения препарата отмечались у общей активности протеиназы Н за счет СА. Экспериментальная группа карнитин + L-NAME повсеместно демонстрирует статистически значимое снижение относительно группы с применением только карнитина, вероятнее всего проявляется эффект ингибитора NO-синтазы. Рис. 1. Влияние применения карнитина с регуляторами синтеза азота на активность и распределение катепсинов В, L, Н в аорте, нмоль/с*г белка Значительный статистически значимый рост ОА ферментов в миокарде (рис. 2) происходит за счет обеих фракций у группы изолированного карнитина. Статистически значимое нарастание цитозольной фракции у катепсинов L и Н говорит о повышении проницаемости лизосомальной мембраны для фермента. Характеризуя тенденцию изменений в сочетанных группах карнитина (рис.2), отмечается снижение показателей относительно контроля, что статистически значимо отражено в показателях - группы № 2 и № 3. Статистически значимое снижение результатов относительно примене ния карнитина отмечено в группах с использованием аргинина и в группе с L-NAME (у всех ферментов). В скелетной мускулатуре под влиянием карнитина наблюдается статистически значимый рост ОА ферментов В и L, происходящий за счет обеих фракций, с преобладанием СА над НСА (рис. 3). Существуют исследования об активации карнитином iNO-синтазы [8], обладающей цитотоксическим эффектом, хотя не исключены и другие возможные механизмы, которые могут включать изменение апоптоза вследствие активации лизо-сомальных протеиназ. 17 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. Рис. 2. Влияние изолированного и сочетанного применения карнитина на активность и распределение катепсинов В, L, Н в миокарде, нмоль/с*г белка Рис. 3. Влияние изолированного и сочетанного применения карнитина с регуляторами синтеза азота на активность и распределение катепсинов В, L, Н в скелетной мускулатуре, нмоль/с*г белка 18 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2016 г. Статистически значимый рост показателей общей активности в группе сочетанного введения регуляторов синтеза азота у катепсина В совмещен со статистически значимым увеличением лизосо-мальной фракции. Статистически значимые отличия от изолированного введения карнитина наблюдаются повсеместно у протеиназы В, L и Н в группе № 2 (исключение НСА у протеиназы Н) и № 3. Анализируя процессы спонтанной ОМБ в аорте и их влияние на активность изучаемых ферментов, отмечается статистически значимая сильная корреляционная связь между изменением S ОМБ и: НСА катепсина Н в группе с использованием карнитина (обратная); НСА катеп-сина L в группе с применением карнитина и L-NAME (прямая). Помимо указанных показателей отмечается высокая обратная статистически не значимая корреляция в группе с использованием карнитина между S ОМБ и ОА ка-тепсина В, а также НСА протеиназы L. Миокард характеризуется высокой степенью статистически не значимой корреляции с S ОМБ и: группой изолированного введения карнитина - отмечается прямая связь у НСА катепсина Н, а карнитин в сочетании с ингибитором синтеза оксида азота характеризуется обратной связью цитозольной фракции катепсина Н. В скелетной мускулатуре присутствуют высокие корреляции не отмеченные статистической значимостью между общей площадью ОМБ и: карнитин-зависимая группа отмечает обратную корреляционную связь у лизосомальной фракции и общей активности катепсина L; применение карнитина и аргинина отмечено так же отрицательной обратной корреляцией у показателя ОА про-теиназы Н; карнитин в сочетании с ингибитором синтеза оксида азота демонстрирует изменения у катепсина В -отрицательная корреляционная связь в цитозольной фракции и общей активности фермента. Выводы 1. Обратная статистически значимая сильная корреляционная связь между общей площадью модифицированнных белков и неседиментируемой активностью катепсина Н выявлена в участке аорты под действием изолированного карнитина в дозе 300 мг/кг. 2. В результате воздействия L-NAME в дозе 25 мг/кг, на фоне использования карнитина 300 мг/кг отмечается прямая статистически значимая сильная корреляционная связь между изменением общей площади модифицированных белков и неседиментируемой активностью катепсина L в аорте. 3. В миокарде и скелетной мускулатуре высокая степень обнаруженных корреляций статистически не значима. Конфликт интересов отсутствует.

Список литературы

Дополнительные файлы