CHANGES IN RAT THYMUS MORPHOLOGY AND FUNCTION AFTER CHRONIC EXPOSURE TO LOW DOSES OF DDT

Full Text

В последние десятилетия в мире отмечается рост заболеваемости, связанный с нарушениями функционирования иммунной системы. Многие исследователи из разных стран сходятся во мнении, что основной причиной повышения числа заболеваний в мире за последние десятилетия можно по праву считать загрязнение окружающей среды [3, 4]. Оно, в свою очередь, приводит к перенапряжению и срыву защитных функций и адаптационных резервов организма человека, за которыми следует развитие острых и хронических патологических процессов [2]. Стойкие органические загрязняющие вещества или загрязнители (СОЗ), поступающие в окружающую среду в результате деятельности человека, в силу высокой токсичности, стабильности, способности к дальнему переносу и биоаккумуляции считаются одними из наиболее опасных загрязнителей. Наиболее распространенным стойким органическим загрязнителем, представляющим наибольшую опасность с точки зрения биогенеза, считается пестицид 1,1,1-трихлор-2,2-бис (4-хлорфенил) этан (ДДТ). Благодаря высокой устойчивости к разло жению фоновые дозы ДДТ регистрируются на всех материках и во всех океанах [7]. В настоящее время ДДТ активно используется в качестве инсектицида для уничтожения переносчиков малярии и висцерального лейшманиоза [1]. В связи с этим, изучение влияния фоновых доз ДДТ, регистрируемых повсеместно, на организм человека и животных, и в частности на иммунную систему, очень актуально в настоящее время. Однако состояние этой проблемы на данный момент мало изучено. Имеются данные о воздействии более высоких (токсичных и субтоксичных) доз ДДТ на функционирование иммунной системы млекопитающих и человека. При изучении влияния субхрони-ческого действия субтоксичных доз ДДТ на функционирование иммунной системы белых крыс было выявлено подавление гуморального и клеточного иммунного ответа, приводящее к повышению восприимчивости организма к возбудителям бактериальных инфекций [6]. Кроме того, ДДТ вызывал увеличение образования макрофагами фактора некроза опухоли-альфа и оксида азота, тем самым приводя к воспалительным реакциям и цитокиновому дисбалансу 36 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. [8]. Имеются данные, что ДДТ способен снижать активность естественных киллеров, тем самым увеличивая риск развития у человека злокачественных опухолей и заболеваемость вирусными инфекциями [9]. Целью данной работы было изучение морфофункциональных изменений тимуса под действием низких, фоновых доз ДДТ. Материалы и методы Эксперимент выполнен на 42 самцах крыс Вистар массой тела 80-100 гг. Животные опытной группы (n=22) вместо воды получали водные растворы о,р-ДДТ («Sigma», США) с концентрацией 20 мкг/л. Среднесуточная доза ДДТ, потребленная животными составила 1,89±0,086 мкг/кг, что соответствует потреблению организмом ДДТ с пищевыми продуктами с учетом его максимально допустимых уровней в продуктах питания (в мясной продукции - 0,1мг/кг; в молочной продукции - 0,05 мг/кг; в зерновых культурах - 0,02 мг/кг). Животные контрольной группы (n=20) получали водопроводную воду. Доступ к воде и пище у крыс был свободным. Учет потребляемой жидкости производили ежедневно. Животных опытной и контрольной групп выводили из эксперимента через 6 и 10 нед передозировкой золетила. Эксперимент проведен в соответствии с правилами, которые представлены в «Международных рекомендациях по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Образцы водопроводной воды и сухого корма для лабораторных животных проверяли на наличие ДДТ и его метаболитов методом газожидкостной хроматографии, показавшей отсутствие в корме и водопроводной воде хлорорганических пестицидов, в том числе ДДТ и его метаболитов. Тимус крыс фиксировали в растворе Буэна, после традиционной проводки материал заливали в парафин. Изготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование проводили методом световой микроскопии и компьютерной мор-фометрии с использованием программы «ImageScope» («Leica Mycrosystems Gmbh», Австрия). В гистологических препаратах тимуса определяли соотношение коркового и мозгового веществ, ширину субкапсуляр-ного слоя, количество телец Гассаля на мм2 площади среза мозгового вещества, оценивали стадии развития телец и количество ретикулоэпителиоцитов, входящих в их состав. Определяли спонтанную пролиферативную активность тимоцитов и пролиферативную активность в реакции бласт-трансформации радиоизотопным методом с использованием 3Н-тимидина. В качестве митогена использовали конканавалин А («Sigma», США). Конечная концентрация конканавалина А после внесения в культуру клеток составляла 5мкг/мл. Индекс стимуляции пролиферации в реакции бласттранс-формации (ИБ) определяли по формуле: ИБ= А/Б, где А - Конканавалин А - стимулированная пролиферация клеток, Б - пролиферация клеток в среде. Результаты и их обсуждение Гистологическое исследование тимуса крыс контрольной группы через 6 нед после начала эксперимента показало, что орган имел типичное для данного возраста строение. Тимус представлял собой паренхиматозный дольчатый орган, снаружи покрытый тонкой соединительнотканной капсулой. Паренхима каждой дольки была образована лимфоидной тканью, строма сформирована ретикулоэпителиоцитами. В дольке четко различались две зоны: корковое вещество, занимающее периферическую часть дольки, и мозговое вещество, находящееся в центре дольки. В корковом веществе лимфоциты плотно прилежали друг к другу. Доля коркового вещества составляла 73,37±1,4 %, мозгового - 26,63±1,4 % паренхимы (табл. 1). В корковом веществе хорошо визуализировался субкапсулярный слой, образованный плотно лежащими лимфобластами. Толщина субкапсулярного слоя варьировала в пределах 43,56±1,67 мкм. В мозговом веществе лимфоциты располагались рыхло, между ними были видны ретикулоэпи-телиоциты. В мозговом веществе встречались единичные тимусные тельца. Количество их в 1 мм2 среза мозгового вещества составляла в среднем 0,80±0,15 телец. Ти 37 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. мусные тельца состояли в среднем из 3,07±0,12 клеток и в подавляющем большинстве случаев (90,01±5,09 %) представляли собой концентрическое наслоение светлых и темных ретикулоэпителиоцитов œ значительным накоплением кератина (табл.1). Просветы сосудов как артериального, так и венозного русла были свободны, либо в просвете имелось небольшое количество плазмы. В корковом и мозговом веществе встречались митотически делящиеся клетки. Спонтанная пролиферативная активность тимоцитов составила имп/мин. Индекс индуцированной пролиферации был равен 2,9 (рис. 1, 2). В тимусе крыс контрольной группы через десять недель после начала эксперимента отмечались возрастные инволю-тивные изменения. В корковом слое были выявлены участки гибели лимфоцитов с появлением характерной картины «звездного неба». Плотность лимфоцитов была снижена по сравнению с предыдущим сроком исследования, в результате чего стали заметны ретикулоэпителиоциты. Заметных изменений доли коркового (76,4±1%) и мозгового (23,6±1%) веществ отмечено не было (табл.1). Также не было статистически значимых отличий в сравнении ширины супкапсулярного слоя, составлявшей 44,22±1,19 мкм (табл. 1). Также статистически значимо увеличились количество тимусных телец в единице площади среза мозгового вещества до 1,84±0,29 на мм2 и среднее количество ретикулоэпителиальных клеток в тимусных тельцах до 3,61±0,10. Выраженные отличия наблюдались и в стадиях развития тимусных телец. По сравнению с предыдущим сроком исследования выявлено значительное увеличение новообразования телец. Доля тимусных телец, представляющих собой скопления ретикуло-эпителиоцитов в начальной стадии накопления кератина, увеличилась более чем в пять раз и составила 56,48±4,03% от общего их количества. Тимические тельца более поздней стадии развития, представляющие собой концентрическое наслоение ретикулоэпителиоцитов с накопле ниями кератина, соответственно встречались реже. Их доля составляла 43,52±4,03% (табл. 1). Значения спонтанной и индуцированной пролиферации тимоцитов статистически значимо не отличались от предыдущего срока исследования (рис. 1, 2). После употребления ДДТ в дозе 1,89мкг/кг в течение 6 нед при гистологическом исследовании соотношение коркового и мозгового веществ по сравнению с показателями 6-недельной контрольной группы не изменилось и составило 75,49±0,89% и 24,51±0,89% (табл. 1). Увеличение ширины субкапсулярного слоя также не достигло статистической значимости и было равно 45,94±1,59мкм (табл. 1). У большинства животных в корковом слое наблюдались гибель лимфоцитов, опустошение коркового слоя тимуса, появление картины «звездного неба». В мозговом веществе наблюдалось увеличение количества тимусных телец, составившее 1,61±0,3 телец/мм2. Также увеличилось количество ретикулоэпителиоцитов в тимических тельцах до 4,6±0,14 клеток. В отличие от крыс контрольной группы, у крыс, получавших низкие дозы ДДТ в течение 6нед, чаще встречались тимусные тельца, более ранних стадий развития (54,14±4,38%), тельца, представляющие собой концентрические скопления ороговевших клеток с большими накоплениями кератина в цитоплазме обнаруживались реже. Их доля составляла 45,86±4,38% (табл. 1). Изучение митотической активности тимоцитов выявило повышение спонтанной пролиферации клеток (рис.1). Индекс индуцированной пролиферации тимоци-тов не изменялся (рис. 2). характер изменений в тимусе сохранился и после употребления крысами ДДТ в дозе 1,89мкг/кг в течение 10 нед. Также, как и в опытной группе с меньшим сроком исследования, показатели соотношения коркового и мозгового веществ в сравнении с контрольными показателями практически не изменился. Доля коркового вещества составляла 74,98±1,37% площади гистологического среза тимуса. Не изменилась также и ширина субкапсуляр- 38 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. Таблица 1 Изменения морфометрических показателей тимуса крыс контрольной группы _и после употребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг (M±m)_ Контрольная группа 6нед Контрольная группа 10нед Группа 1,89мкг/кг 6нед Группа 1,89мкг/кг 10нед Соотношение слоев, % корковый слой 73,37±1,40 76,40±1,00 75,49±0,89 74,98±1,37 мозговой слой 26,63±1,40 23,60±1,00 24,51±0,89 25,02±1,37 Субкапсулярный слой, мкм 43,56±1,67 44,22±1,19 45,94±1,59 41,61±1,79# Количество тимических телец в мозговом слое, телец/мм2 0,8±0,15 1,84±0,29# 1,61±0,30* 2,42±0,47*# Количество клеток в тимических тельцах 3,07±0,12 3,61±0,10# 4,60±0,14* 5,34±0,21*# Соотношение стадий тимических телец, % ранняя стадия развития 9,99±5,09 56,48±4,03# 54,14±4,38* 74,91±4,10*# поздняя стадия развития 90,01±5,09 43,52±4,03# 45,86±4,38* 25,09±4,10*# Примечание. * — статистически значимые отличия от значений контрольной группы, # — статистически значимые отличия от значений группы крыс, с меньшим сроком эксперимента 1 14000 12000 )000 8000 5 6000 I 4000 2000 0 4-х часовая пролиферация *# 1,89мкг/кг ДДТ 6нед 10нед Рис. 1. Изменения спонтанной пролиферативной активности клеток тимуса крыс контрольной группы и после употребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг (M±m) * Рис. 2. Изменения индекса митоген-индуцированной пролиферации клеток тимуса крыс контрольной группы и после употребления ДДТ в дозе 1,89±0,086мкг/кг (M±m) 39 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. ного слоя в сравнении с контрольной группой. Этот показатель был равен 41,61±1,79мкм. Однако было отмечено более заметное, статистически значимое сужение субкапсулярного слоя по сравнению с группой, получавшей ту же дозу ДДТ в течение меньшего срока. Количество телец Гассаля в мозговом веществе тимуса крыс увеличилось по сравнению с предыдущим сроком исследования и составило 2,42±0,47 клеток/мм2, но соответствовало значениям контрольной группы крыс того же возраста. Количество ретику-лоэпителиоцитов в тимических тельцах повысилось по сравнению с предыдущим сроком исследования до 5,34±0,21клеток и статистически значимо превысило значения контрольной группы. Доля тимических телец в ранних стадиях развития от общего количества телец увеличилась по сравнению с предыдущим сроком исследования до 74,91±4,1%, что значительно превысило показатели контрольной группы. Показатель спонтанной пролиферации был статистически значимо ниже значения как контрольной, так и опытной с меньшим сроком воздействия ДДТ групп, что может говорить о снижении количества ми-тотически делящихся клеток в данной группе. Данные индуцированной пролиферации свидетельствуют об увеличении этого показателя больше чем в 4 раза по сравнению с контрольной и опытными группами. Таким образом, в контрольной группе через 10 нед после начала эксперимента появились начальные признаки возрастных инволютивных изменений. Тимус достигает максимума развития к периоду полового созревания, затем начинается возрастные изменения, появляющиеся усилением гибели лимфоцитов, увеличением образования тимических телец, увеличением числа клеток в тимических тельцах, что в конечном итоге приводит к сморщиванию долек [5]. Сравнение изменений в опытных и контрольных группах показало, что их характер одинаков в контрольных и опытных группах, но темпы гибели клеток тимуса при потреблении ДДТ были ускорены. В опытной группе через 6 нед после начала эксперимента изменения были схожи с показателями контрольной группы через 10 нед. Поскольку в контрольной группе более длительного срока исследования наблюдались возрастные изменения тимуса, схожесть показателей может говорить о более быстром течении этих процессов у крыс, получавших низкие дозы ДДТ в течение 6нед. После употребления ДДТ в течение 10 нед выявленные изменения в тимусе усилились в сравнении с предыдущим сроком исследования и контрольной группой. Но характер изменений также был схож у сравниваемых групп, за исключением того факта, что тимоциты крыс, потреблявших ДДТ в течение 10 нед приобрели свойство реагировать на митоген резким усилением пролиферации на фоне пониженной спонтанной пролиферативной активности, что не типично для клеток тимуса [5]. Выраженная гибель ретикулоэпителиоцитов, наблюдаемая как через 6, так и через 10 нед в опытной группе, указывает на возможное нарушение секреции тимических гормонов и созревания Т-лимфоцитов, что требует дальнейшего исследования. Это усиление инволютивных изменений может говорить о негативном влиянии малых доз ДДТ на функционирование центрального органа иммунной системы тимуса, а, следовательно, и быть причиной нарушения реакций в первую очередь клеточного иммунитета также как и при действии субтоксических доз ДДТ [6, 9]. Выводы 1. Воздействие низкой дозы ДДТ (1,89±0,086мкг/кг) в течение как шести, так и десяти недель приводит к изменению морфофункциональных характеристик тимуса крыс Вистар, проявляющихся усилением гибели как лимфоцитов, так и ретикулоэпителиоцитов. 2. Воздействие низких доз ДДТ существенно увеличивало темпы инволютив-ных изменений ретикулоэпителиоци-тов, что проявлялось увеличением количества тимических телец, а также увеличением количества клеток в составе тимических телец. 40 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. 3. Усиление гибели тимоцитов под воздействием низких доз ДДТ приводило сначала к компенсаторному повышению, а затем снижению пролиферативной активности клеток, но повышало их способность отвечать на ми-тогенное воздействие.

References

Supplementary files