TO THE MECHANISM OF ACTION OF NEW ANTIHYPOXIC COMPLEX COMPOUND OF ASCORBIC ACID

Abstract

In the experiment on rats a new derivative of ascorbic acid with antihypoxic activity was learned. It is shown that a dose of 100 mg / kg in normoxia and after exposure to acute hypoxia, it reduces the activity of free radical oxidation, has no effect on the hemogram, but leads to a significant reduction of ALT, AST, alkaline phosphatase, LDG, the level of uric acid and total protein after acute hypoxia, which is of some importance in its hypoxic effect.

Full Text

Комплексное соединение ванадила с аскорбатом и рибофлавином - L-аскорбаторибофлавинатованадил(ІІ) трисе-мигидрата(І) - под лабораторным шифром nQ 1968, синтезированное д.х.н. Э.А. Парфеновым в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, является антигипоксантным средством [5]. Механизм антигипоксического действия данного соединения, возможно, обусловлен снижением интенсивности метаболических процессов в клетке, его оптимизирующим влиянием на функциональное состояние ЦНС [4]. Важным и информативным объектом исследования является кровь, т.к. кровь, как жидкая соединительная ткань организма, не только обеспечивает взаимосвязь всех органов и систем, являясь индикатором состояния организма, но и сама непосредственно реагирует на дефицит кислорода [7, 8]. В условиях недостаточного для удовлетворения потребностей метаболизма снабжения тканей кислородом начинается цепь физиологических и биохимических изменений, цель которых обеспечить оптимальную функцию и по возможности интактное восстановление организма после окончания периода гипоксии. Перспективным при ги поксии является применение лекарственных средств, способных тормозить активацию процессов свободнорадикального окисления в клетке, уменьшать образование токсических метаболитов и снижать их повреждающее действие. Как известно, аскорбиновая кислота относится к числу наиболее активных прооксидантов, а также заметно усиливает действие истинных биоантиокислителей. Исходя из этого, представляло интерес изучить действие комплексного производного аскорбиновой кислоты nQ 1968 на процессы свободнорадикального окисления (СРО), гемограмму и биохимические показатели крови крыс в условиях нормоксии и после воздействия острой гипоксии, что позволит расширить представления о механизме антигипоксиче-ского действия соединения. Материалы и методы Исследование проведено на 240 кры-сах-самцах линии Wistar массой 180-200 г в соответствии с «Руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ» [6]. Анализируемое соединение nQ 1968 вводили однократно внутрибрюшинно за 1 час до эксперимента 59 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. в дозе 100 мг/кг (эффективная доза при гипоксии). Контрольным животным вводили равный объем дистиллированной воды. В качестве препаратов сравнения выступали антигипоксант мексидол (ООО «ФАРМА-СОФТ», Россия) и природный антиоксидант аскорбиновая кислота (ООО «ОЗОН», Россия) в дозах 100 мг/кг. Кровь для исследования брали из сосудов шеи декапитиро-ванного животного через час после введения исследуемого соединения в группе животных, содержащихся в условиях нормок-сии, и при появлении признаков острой гипоксии (беспокойное поведение, подергивание лап, попытка выбраться) в группе животных, подвергшихся воздействию острой гипоксии с гиперкапнией (ОГсГк). ОГсГк моделировали помещением крыс в герметичные индивидуальные камеры объемом 1 л до появления признаков острой гипоксии. Сыворотку крови получали путем центрифугирования цельной крови в течение 15 минут при 3000 об/мин. Оценку показателей СРО окисления в сыворотке крови проводили методом хеми-люминесценции на биохемиолюминометре 3606 М (разработка конструкторско-технологического бюро «Наука», Россия) с помощью программного обеспечения к прибору. Для инициации перекисного окисления липидов в исследуемый материал (0,1 мл плазмы, 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,1 мл 12,5 мМ двухвалентного железа в виде соли FeSO4x7H2O), помещенный в темную камеру биохемиолюминометра, на 10 цикле вводили 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода с последующей регистрацией хемилю-минесценции в течение 50 циклов (1 цикл - 0,1 секунды), при 370С с учетом фоновой хемилюминесценции. В качестве оценочного показателя использовалась величина свето-суммы, рассчитываемой как площадь под кривой свечения в относительных единицах. Данный показатель отражает интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе свободно-радикального окисления антиоксидантных систем. Показатели гемограммы крови крыс (уровень гемоглобина, число эритроцитов и гематокрит) определяли на минифотометрах DP 300, DP 310 (DI-ALAB G.m.b.H., Австрия), используя реактивы DIALAB GPT (ALT), mod. IFCC фирмы DIALAB (Австрия). Подсчет числа лейкоцитов проводили в камере Горяева. При биохимическом исследовании определяли активность ферментов: ала-нинаминотрансферазы (АлАТ), аспарта-таминотрансферазы (AcAT), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уровень креатинина, мочевой кислоты, мочевины, общего белка. Исследования проведены на биохимическом анализаторе «Ultra» фирмы «Kone» (Финляндия) с использованием наборов реактивов фирмы Olvex (Россия). Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica Version 6.0. Результаты и их обсуждение Результаты исследования показали, что в условиях нормоксии величина светосуммы у контрольных животных составляла 67138,11 ± 9906 условных единиц. Соединение nQ 1968 в условиях нормоксии достоверно снижало показатель свечения до 51109 ± 7277. Препараты сравнения в условиях нормоксии не вызывали достоверных изменений величины светосуммы (табл. 1). После воздействия ОГсГк в сыворотке крови контрольных животных наблюдалось угнетение хемилюминесцентного свечения по сравнению с интактными животными (нормоксия), что выразилось в снижении величины светосуммы в 1,3 раза, что может быть обусловлено адаптационным напряжением антиоксидантной системы сыворотки крови, проявляющимся в повышении содержания и активности биоантиоксидантов (су-пероксиддисмутазы, каталазы, церулоплазмина, а-токоферола и др.), способствующих компенсаторному повышению антиради-кальной устойчивости липидов в условиях гиперпродукции прооксидантов. Выраженное снижение активности свободнорадикального окисления в сыворотке крови наблюдалось после воздействия острой гипоксии при введении соединения nQ 1968 (уменьшение величины светосуммы в 1,25 раза). Действие соединения nQ 1968 соответствует по эффективности мексидолу и несколько уступает аскорбиновой кислоте (снижение - в 1,28 раза). 60 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. Таблица 1 Влияние nQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на интенсивность процессов _свободнорадикального окисления_ Г руппа животных (П = 10) Величина светосуммы, усл. ед. Нормоксия Г ипоксия с гиперкапнией Контроль 67138,11 ± 9906 51480±6658* nQ 1968 51109±7277* 41191± 4089а Аскорбиновая кислота 59114±3151 40087 ± 9308а Мексидол 62483 ± 12217 41160±6118а Примечание: * — p<0,05 по отношению к контрольной группе. А — p < 0,05 по сравнению с контролем при гипоксии В ходе изучения гемограммы, было выявлено, что у контрольных животных значения показателей в условиях нормок-сии соответствовали физиологическим величинам [1]. Введение соединения под лабораторным шифром nQ 1968 в условиях нормоксии не оказывало влияния на общее содержание лейкоцитов и гематокрита, но наблюдалось некоторое увеличение показателей содержания эритроцитов (на 5,36%) и гемоглобина (на 5,26%) (табл. 2). Однако эти изменения находились в пределах физиологической нормы для крыс. Препараты сравнения в условиях нормоксии достоверных изменений в гемограмме не вызывали. Таблица 2 Влияние nQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на показатели гемограммы _крыс в условиях нормоксии_ Группа животных (n = 10) Контроль nQ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол Значение показателей, абс.(%) Эритроциты X 1012/л 7,74±0,16 (100%) 8,16±0,27* (105,36%) 7,47±0,37 (96,53%) 7,58±0,43 (97,86%) Г емоглобин г/л 141,49±2,15 (100%) 148,94±0,91* (105,26%) 139,28±1,77 (98,43%) 139,05±2,17 (98,27%) Лейкоциты X 109/л 9,77±0,42 (100%) 9,69±0,45 (99,18%) 9,34±0,40 (95,58%) 9,23±1,00 (94,44%) Г ематокрит % 43,02±0,56 (100%) 44,18±1,23 (102,68%) 43,30±0,80 (100,65%) 42,23±1,00 (98,16%) Примечание: * — p<0,05 по отношению к контрольной группе. После воздействия острой гипоксии у животных наблюдалось достоверное увеличение содержания эритроцитов и гемоглобина на 8,80% и 7,82% (табл. 3). Возможно, изменения количества эритроцитов и гемоглобина обусловлены колебаниями гематокритного числа, что может свидетельствовать о перераспределении крови в организме животного. Так, показатель гематокрита у животных в группе гипоксия увеличивался на 7,98% относительно контроля, свидетельствуя о сгущении крови и нарушении гемодинамики. Выявленные изменения показателей гемограммы после воздействия ОГсГк согласуются с данными литературы, из которых следует, что одним из срочных компенсаторных механизмов адаптации к гипоксии является увеличение кислородной емкости крови за счет усиления гемопоэза и выброса депонированной крови [2]. На фоне введения лекарственных веществ не происходило достоверных изменений гемограммы крыс в условиях гипоксии. Но после введения nQ 1968 наблюдалась тенденция к увеличению содержания эритроцитов и гемоглобина, что, вероятно, способствует лучшей доставке кислорода к тканям и увеличивает время жизни мышей при ОГсГк. 61 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. Таблица 3 Влияние nQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на показатели гемограммы крыс после воздействия ОГсГк Г руппа животных (n = 10) Контроль Г ипоксия nQ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол Значение показателей, абс.(%) 1 % к контролю 1 % к гипоксии Эритроциты X 1012/л 7,74±0,16 (100%) 8,42±0,25* (108,80%) 9,18± 1,10 (108,94%) 8,02±0,51 (107,36%) 8,12±0,48 (96,44%) Г емоглобин г/л 141,49±2,15 (100%) 152,55±1,61* (107,82%) 155,69±2,71 (102,06%) 154,33±2,37 (101,16%) 152,64±2,82 (100,06%) Лейкоциты X 109/л 9,77±0,42 (100%) 9,13±0,86 (93,45%) 9,50±0,58 (104,02%) 9,18±0,75 (100,48%) 9,27±1,10 (101,54%) Г ематокрит % 43,02±0,56 (100%) 46,46±0,48* (107,98%) 46,27±1,65 (99,60%) 47,20±0,86 (101,59%) 46,31±0,80 (99,67%) Примечание: * — p<0,05 по отношению к контрольной группе. Изучение биохимических показателей показало их соответствие у контрольных животных в условиях нормоксии значениям физиологической нормы для крыс [1]. Предварительное введение соединения nQ 1968 и препаратов сравнения в условиях нормоксии не приводило к достоверному изменению рассматриваемых показателей (табл. 4). Данные, полученные при исследовании биохимических показателей сыворотки крови экспериментальных животных после воздействия ОГсГк, представлены в таблице 5, из которой следует, что ОГсГк вызывала повышение активности АлАТ и АсАТ животных на 52,23% и 70,05% соответственно, щелочной фосфатазы в 2 раза, что вероятно связано с нарушением функции печени и активизацией цитолиза. Показатель ЛДГ был увеличен на 56,75% по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о значительной активации процесса гликолиза в условиях недостатка кислорода, вследствие чего в крови не разрушается до нейтральных продуктов лактат, что и приводит к накоплению ЛДГ. Уровень мочевой кислоты повышался в 4 раза, что вероятно, обусловлено тем, что гипоксическое повреждение тканей индуцирует разрушение нуклеиновых кислот, сопровождающееся образованием пуриновых оснований, с последующей их модификацией. Кроме того, увеличился и уровень общего белка на 22,43%. Таблица 4 Влияние nQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на биохимические показатели Группа животных (n = 10) Контроль nQ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол Значение показателя, абс.(%) АлАТ, ед/л 112,20±16,20 135,00±22,60 123,00±13,06 106,70±19,27 (100%) (120,32%) (109,63%) (95,10%) АсАТ, ед/л 159,60±22,80 173,80±41,84 162,10±12,00 178,90±45,35 (100%) (108,90%) (101,57%) (112,09%) ЩФ, ед/л 158,30±7,30 133,60±34,24 161,50±2,12 136,30±25,63 (100%) (84,40%) (102,02%) (86,10%) ЛДГ, ед/л 735,80±78,56 796,30±60,50 793,30±56,45 732,10±54,33 (100%) (108,22%) (107,81%) (99,50%) Мочевина, 8,50±1,00 8,17±1,37 8,40±1,06 8,30±0,69 ммоль/л (100%) (96,12%) (98,82%) (97,65%) Мочевая кислота, 67,40±3,40 64,70±11,10 67,40±3,27 67,50±6,82 мкмоль/л (100%) (95,99%) (100%) (100,15) Креатинин, 79,00±0,80 84,80±5,44 81,00±2,00 79,90±2,61 мкмоль/л (100%) (107,34%) (102,53%) (101,14%) Общий белок, г/л 60,20±0,64 61,90±2,54 59,70±3,31 62,50±2,94 (100%) (102,82%) (99,17%) (103,82%) Примечание: * - p<0,05 по отношению к контрольной группе. 62 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. Таблица 5 Влияние nQ 1968, аскорбиновой кислоты и мексидола на биохимические показатели _крови крыс после воздействия ОГсГк_ Г руппа животных (П = 10) Контроль Г ипоксия nQ 1968 Аскорбиновая кислота Мексидол Значение показателя, абс.(%) абс. % к контролю % к гипоксии АлАТ, ед/л 112,20±16,20 170,80±17,20* (152,23%) 101,20±18,20а (59,25%) 140,10±20,41а (82,03%) 131,70±27,22а (77,11%) АсАТ, ед/л 159,60±22,80 271,40±48,28а (170,05%) 190,30±29,90а* (70,12%) 195,80±26,20а (72,14%) 200,00±26,60а (73,69%) ЩФ, ед/л 158,30±7,30 349,40±64,20* (220,72%) 219,00±49,20а (62,68%) 323,90±40,88 (92,70%) 273,60±65,40 (78,31%) ЛДГ, ед/л 735,80±78,56 1153,40±219,76* (156,75%) 776,90±104,92а (67,36%) 850,40±72,60а (73,73%) 772,30±141,36а (66,96%) Мочевина, ммоль/л 8,50±1,00 9,04±1,44 (106,35%) 8,15±0,42 (90,15%) 8,51±0,33 (94,14%) 8,07±0,40 (89,27%) Мочевая кислота, мкмоль/л 67,40±3,40 275,90±19,10* (409,35%) 234,40±23,24а (84,96%) 247,00±9,80а (89,53%) 244,70±5,56а (88,69%) Креатинин, мкмоль/л 79,00±0,80 80,50±4,40 (101,90%) 71,40±8,16а (88,70%) 66,20±1,68а (82,24%) 67,80±2,08а (84,22%) Общий белок, г/л 60,20±0,64 73,70±2,22* (122,43%) 64,40±5,00а (87,38%) 59,20±1,60а (80,33%) 64,00±2,40а (86,84%) группе Примечание: *- p<0,05 по отношению к контрольной А — p<0,05 по отношению к группе гипоксия При применении лекарственных веществ на фоне ОГсГк наблюдалось снижение указанных показателей. Наиболее значительно предупреждало повышение активности АлАТ (на 40,75%), АсАТ (на 29,88%), ЛДГ (на 32,64%), мочевой кислоты (на 15,04%) и общего белка (на 12,62%) комплексное соединение аскорбиновой кислоты под лабораторным шифром nQ 1968. Мексидол и аскорбиновая кислота в меньшей степени, но также достоверно уменьшали концентрацию указанных показателей в сыворотке крови опытных животных. Так, мексидол способствовал снижению АлАТ, АсАТ, ЛДГ, мочевой кислоты и общего белка на 22,89; 26,31; 33,04; 11,31 и 13,16% соответственно, а аскорбиновая кислота -на 17,97; 27,86; 26,27; 10,47 и 19,67% соответственно. Следует отметить, что только при применении соединения nQ 1968 достоверно снижался уровень ЩФ на 37,32%. Кроме того, применение nQ 1968 препятствовало повышению АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ и общего белка выше показателей физиологической нормы крыс. Выводы Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что комплексное соединение аскорбиновой кислоты под шифром nQ 1968, обладающее выраженным антигипоксантным действием, проявляет антиоксидантные свойства в условиях нормоксии, и особенно в условиях гипоксии, о чем свидетельствует снижение величины светосуммы хемилю-минисцентного свечения. Наблюдаемый антиоксидантный эффект данного соединения, возможно, является не только результатом его прямого влияния на процессы пероксидации липидов, но и опосредован стабилизацией энергетического обмена клетки, что было подтверждено нами ранее [3]. ОГсГк существенно изменяет показатели гемограммы (возрастает уровень эритроцитов, гемоглобина, гематокрита) и биохимические показатели крови экспериментальных животных (возрастает активность АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ,уровень мочевой кислоты и общего белка), что свидетельствует о том, что гипоксия является мощным стрессорным фактором и запускает каскад срочных механизмов адаптации к гипоксии, проявляющиеся усилением гемопоэза, выброса депонированной крови, увеличением гликолиза, активацией симпато-адреналовой системы. Исследуемое соединение nQ 63 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. 1968 не оказывает выраженного влияния на показатели гемограммы в условиях гипоксии, но приводит к достоверному снижению активности АлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ и уровня мочевой кислоты, общего белка. Положительная динамика показателей АлАТ, АсАТ, ЩФ может свидетельствовать о замедлении процессов цитолиза и возможном гепатопротекторном действии изучаемого соединения.