АНАЛИЗ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПРЕПАРАТА НООПЕПТ К СУБСТРАТАМ И МОДУЛЯТОРАМ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ABCB1-БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VIVO

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

В статье проанализировано влияние ноотропного препарата Ноопепт (N-фенил-ацетил-Ь-пролилглицина этиловый эфир) на функциональную активность ABCB1-белка и изучена его принадлежность к субстратам белка-транспортера на кроликах-самцах породы Шиншилла. Функционирование белка-транспортера оценивали по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина. Фексофенадин вводили однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг до и после 14-дневного введения животным Ноопепта в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день. Количественное определение вещества проводили методом ВЭЖХ по разработанной ранее методике.

Для оценки принадлежности Ноопепта к субстратам ABCB1 -белка сравнивали его фармакокинетические параметры до и после курсового введения кроликам-самцам ве-рапамила - известного ингибитора данного белка-транспортера в дозе 20 мг/кг 3 раза в день. Фармакокинетику Ноопепта изучали по оригинальной методике ВЭЖХ.

Выявлено, что курсовое введение Ноопепта не приводило к достоверному изменению фармакокинетических параметров маркерного субстрата ABCB1 -белка - фексо-фенадина, что может свидетельствовать о сохранении функциональной активности данного белка-транспортера на исходном уровне. Установлено, что фармакокинетика Ноопепта не изменяется при курсовом введении кроликам ингибитора ABCBl-белка -верапамила, т.е. ноопепт не является субстратом данного белка-транспортера.

Полный текст

ABCB1-белок (гликопротеин-Р) - это мембранный АТФ-зависимый эффлюксный белок-транспортер, удаляющий из клетки широкий спектр эндогенных и экзогенных субстратов, включая лекарственные средства различных фармакологических и химических групп [1].

ABCB1-белок локализуется на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки тонкого кишечника и проксимальных канальцев нефронов почек, гепатоцитов, эн-дотелиоцитов гистогематических барьеров. Транспортер препятствует всасыванию лекарственных веществ, являющихся его субстратами в кишечнике, участвует в процессах распределения, способствует их выведению в желчь и мочу. Таким образом, от функциональной активности данного белка-транспортера зависит фармакокинетика лекарственных веществ-субстратов АВСВ1-белка, а значит эффективность и безопасность фармакотерапии [2]. Высокая активность АВСВ1-белка приводит к неэффективности лечения веществом-субстратом, а низкая активность - к передозировке.

Ноопепт (№фенил-ацетил^-пролил-глицина этиловый эфир) - дипептидный аналог пирацетама, являющийся современным оригинальным ноотропным и нейро-протективным препаратом, разработанным в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова. Ноопепт применяется для терапии хронических ишемических поражений мозга, ряда нейродегенеративных заболеваний, шизофрении, эпилепсии [3].

В научной литературе отсутствуют исследования по оценке принадлежности Ноопепта к числу субстратов, индукторов и ингибиторов ABCB1-белка. Однако, исходя из химической структуры и физических свойств Ноопепта, можно предположить участие ABCB1-белка в его фармакокинетике или наличие у препарата способности модулировать его функциональную активность. Ранее среди модуляторов транспортера были обнаружены вещества пептидной структуры [4]. Описан механизм изменения функциональной активности ABCB1-белка веществами пептидной природы за счет непосредственного взаимодействия с частями его молекулы с модификацией его пространственной структуры [5].

Целью работы явилась оценка влияния Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка и принадлежность препарата к субстратам белка-транспортера.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500-4300 г [6]. Работа с животными проводилась в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н).

Животные были разделены на 2 серии: в первой серии (n=6) исследовали влияние Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка, во второй (n=6) -оценивали принадлежность Ноопепта к субстратам транспортера.

Животные первой серии получали фексофенадин (таблетки, покрытые оболочкой, Телфаст, 180 мг, Aventis Pharma, Италия) однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг массы [7] до и после 14дневного введения препарата Ноопепт (таблетки Ноопепт, 10 мг, ЗАО «ЛЕККО», Россия) в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день, а также на 5-й день его отмены [8]. Последнее введение Ноопепта выполняли утром за 20 мин до введения маркерного субстрата для возможности оценки прямого влияния препарата на ABCB1-белок (выбор времени обусловлен Tmax ноопепта -15 мин). После этого у кроликов забирали кровь из краевой вены уха в объеме 5 мл в гепаринизирован-ные пробирки, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин для получения плазмы. В плазме крови определяли концентрацию фексофенадина методом ВЭЖХ на хроматографе «Stayer» (Россия) по методике, описанной ранее [9].

Животным второй серии вводили тестируемый препарат Ноопепт в дозе 50 мг/кг массы внутрижелудочно в форме суспензии на воде очищенной однократно до и после введения ингибитора АВСВ1-белка. Образцы крови забирали через 5, 10, 20, 30, 45, 60 и 90 мин после введения тестируемого препарата [10] с последующим анализом его фармакокинетики методом ВЭЖХ. Использовали хроматограф «Stayer» c УФ-спектрофотометрическим детектором при длине волны 206 нм. Состав подвижной фазы: вода деионизированная - ацетонитрил -ледяная уксусная кислота (50-50-0,1). Хроматографическая колонка Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250х4,6) с зернением 4 мкм. В качестве ингибитора АВСВ1-белка животные получали верапа-мил (таблетки, покрытые оболочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг 3 раза в день [7] курсом 14-дней. Последнее введение верапамила выполняли утром - за 1 час до введения Ноопепта (время обусловлено lmax верапамила 1-2 ч).

Фармакокинетические параметры фексофенадина и ноопепта рассчитывали, используя модельно-независимый метод, с применением программы «Kinetica 5.0».

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «Stat Soft Statistica 7.0». Статистическую значимость различий между фармакокинетическими параметрами оценивали исходя из представления о логнормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фармакокинетических параметров проводили с применением дисперсионного анализа повторных измерений (ANOVA) после их логарифмирования. Статистически значимыми принимали различия при значении р<0,05. Дополнительно рассчитывали двухсторонний 90% доверительный интервал отношения геометрических средних значений фармакокинетических параметров на фоне введения исследуемых веществ (верапамила и Ноопепта) к параметрам интактных животных. Согласно рекомендациям U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research [11] значимыми считаются различия между фармакокинетическими параметрами, если двухсторонний 90% доверительный интервал их отношения находится вне диапазона 0,8-1,25 (80-125%). Полученные результаты представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала.

Результаты и их обсуждение

14-дневное введение кроликам-самцам Ноопепта не вызвало статистически значимых изменений ни одного из исследованных фармакокинетических параметров фексофенадина (табл. 1).

14-дневное введение кроликам-сам-цам ингибитора ABCB1-белка - верапами-ла не приводило к достоверному изменению фармакокинетики Ноопепта по сравнению с исходными параметрами (табл. 2).

В нашем исследовании в качестве маркерного субстрата АВСВ1 белка выбран рекомендуемый FDA гистаминолитик III поколения - фексофенадин, который не ме-таболизируется в организме, а его всасывание в кишечнике, распределение и элиминация зависят от функционирования данного транспортера. Поэтому динамика концентрации фексофенадина в крови характеризует функциональную активность АВСВ1 белка [7, 11, 12].

 

Таблица 1. Фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) до и после введения Ноопепта (10 мг/кг 3раза в день 14 дней)

Фармакокинетический параметр фексофенадина

Интактные животные (n=6)

Животные после введения Ноопепта (n=6)

Животные на 5-й день отмены Ноопепта (n=6)

Omax, нг/мл

241,3 (138,2; 421,2)

360,7 (171,8; 757,5)

331,2 (209,0; 524,9)

AUC0-t нг*ч/мл

2520,4 (1012,9; 6271,1)

3023,9 (1682,7; 5433,9)

2799,5 (2318,1; 3380,8)

AUC/t1/2

203,9 (85,6; 486,3)

247,2 (106,2; 575,4)

219,6 (99,3; 485,6)

Cl, л*ч-1 *кг-1

15,8 (4,8; 52,3)

13,9 (6,4; 30,3)

15,8 (11,2; 22,3)

Примечание: данные представлены в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала

 

Таблица 2. Фармакокинетические параметры Ноопепта (50 мг/кг) до и после введения верапамила (20 мг/кг 3раза в день 14 дней)

Фармакокинетический параметр Ноопепта

Интактные животные (n=6)

Животные после введения верапамила (n=6)

С max, нг/мл

44,43 (25,20; 78,33)

26,16 (11,47; 59,70)

AUCo^ok, нг*мин/мл

1133,36 (599,19; 2143,74)

932,89 (501,66; 1734,81)

AUC0-t, нг*ч/мл

1111,39 (596,81; 2069,63)

854,067 (417,11; 1748,77)

Cl, л*мин-1кг-1

44,12 (23,32; 83,45)

53,60 (28,82; 99,67)

AUC/t1/2,

80,75 (38,38; 169,90)

62,97 (21,36; 185,68)

Примечание: данные представлены в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала

 

Отсутствие статистически значимых изменений фармакокинетики фексофена-дина после курсового введения кроликам Ноопепта свидетельствует о том, что скорость абсорбции маркерного субстрата в кишечнике и интенсивность его экскреции не изменялись, что показывает сохранение функциональной активности ABCB1-белка на исходном уровне.

Ранее было установлено, что Ноопепт (10 мкМ) увеличивает ДНК-связывающую активность HTF-1 [13] - транкрипционного фактора, повышающего экспрессию ABCB1-белка [14]. Полученные нами результаты не согласуются с этими данными, видимо, потому, что мы использовали Но-опепт в условиях нормы у интактных животных и изучали функционирование транспортера на уровне целостного организма, а не в культуре клеток.

Возможной причиной отсутствия влияния Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка на уровне целостного организма, установленное в нашем исследовании, может являться короткий период его полувыведения, который по данным литературы составляет у кроликов 0,3±0,03 ч [10], что минимизирует возможность его прямого взаимодействия с белком-транспортером и изменения его активности. Кроме того, на уровне целостного организма ABCB1-белок испытывает влияние множества факторов (клеточное окружение, гормональный фон и пр.), в то время как in vitro они отсутствуют.

Оценка принадлежности лекарственных веществ к субстратам ABCB1-белка  in vivo  проводится следующим образом. Фармакокинетика тестируемого препарата оценивается до и после введения классических ингибитора и индуктора ABCB1-белка. Если курсовое введение кроликам-самцам ингибитора транспортера - верапамила приводит к увеличению плазменной концентрации тестируемого вещества и снижению его экскреции, а курсовое введение индуктора ABCBf-белка - рифампицина - к обратной динамике - делается вывод о принадлежности препарата к субстратам белка-транспортера [15]. В данной работе при пероральном введении Ноопепта интактным животным в дозе 50 мг/кг массы его максимальная концентрация в плазме крови составила 44,43 (25,20; 78,33) нг/мл. При этом, в случае принадлежности Ноопепта к субстратам ABCB1-белка, введение рифам-пицина дополнительно снизит его плазменную концентрацию, что не позволит детектировать ее применяемым нами способом. В связи с указанным ограничением, в нашей работе вводился только ингибитор белка-транспортера - верапамил, который повышает концентрацию в крови тестируемых субстратов.

Отсутствие достоверных различий между фармакокинетическими параметрами Ноопепта до и после курсового введения кроликам верапамила свидетельствует о том, что тестируемый препарат не является субстратом ABCB1-белка или вовлечение данного транспортера в процессы всасывания, распределения и экскреции тести руемого вещества не имеет существенного значения для его фармакокинетики.

Независимость фармакокинетики Но-опепта от функционирования ABCB1-белка, а также отсутствие влияния препарата на функциональную активность транспортера позволяет безопасно и без корректировки дозы назначать его совместно с препаратами, являющимися маркерными субстратами белка-транспортера (дигоксин, дабигатрана этаксилат, талинолол и др.) с минимальной вероятностью нежелательных межлекарственных взаимодействий.

Выводы

  1. Курсовое введение Ноопепта в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день в течение 14 дней кроликам-самцам не приводит к изменению функциональной активности ABCB1-белка, оцениваемой по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофе-надина.
  2. Ноопепт не является субстратом ABCB1-белка по результатам тестирования  in vivo, что подтверждается отсутствием значимых изменений его концентрации на фоне ингибитора ABCB1-белка - верапамила.

Конфликт интересов отсутствует.

×

Об авторах

И. В. Черных

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.б.н., ассистент кафедры общей и фармацевтической химии Россия

А. В. Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.м.н., ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации Россия

Е. Н. Якушева

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации Россия

М. В. Гацанога

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации  Россия

Н. М. Попова

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.м.н., ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации  Россия

Список литературы

  1. Montanari F., Ecker G.F. Prediction of drug-ABC-transporter interaction - Recent advances and future challenges // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2015. Vol. 86. P. 17-26.
  2. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щуль-кин А.В., Попова Н.М. Гликопротеин-Р: структура, физиологическая роль и молекулярные механизмы модуляции функциональной активности // Успехи физиологических наук. 2014. Т. 45, №4. С. 89-98.
  3. Островская Р.У., Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Ямиданов Р.С., Садовников С.В., Капица И.Г., Середенин С.Б. К механизму действия ноопепта: снижение активности стресс-индуцируемых протеин-киназ и активация экспрессии нейротрофи-нов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73, №12. С. 2-5.
  4. Новиков С.А. Гидрофильные гексапептиды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2008. 24 с.
  5. Carrigos M., Mir L.M., Orlowski S. Competitive and Non-Competitive Inhibition of the Multidrug-Resistance-Associated P-glycoprotein ATPase // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 244, №2. P. 664-673.
  6. Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-Р на самках кроликов породы шиншилла // Наука молодых (Eruditio Juve-nium). 2016. №3. С. 5-10.
  7. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2007. 21 с.
  8. Коваленко Л.П., Смольникова Н.М., Алексеева С.В., Немова Е.П., Сорокина А.В., Мирамедова М.Г. и др. Доклиническое изучение токсичности ноопепта // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002. Т. 65, №1. С. 62-64.
  9. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Черных И.В., Титов Д.С. Функциональная активность и экспрессия гликопротеина-P при экспериментальных манипуляциях // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. №2. С. 74-77.
  10. Бойко С.С., Жердев В.П., Гуда-шева Т.А., Островская Р.У., Коротков С.А., Кравцова О.Ю. Биодоступность ноопепта -нового ноотропного препарата дипептид-ной структуры // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №12. С. 3-5.
  11. Guidance for Industry Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations / U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). 2012. 75 p. Available at: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidance complianceregulatoryinforma-tion/guidances/ucm292362.pdf.
  12. 12. Ohura K., Nakada Y., Kotani S., Imai T. Design of Fexofenadine Prodrugs Based on Tissue-Specific Esterase Activity and Their Dissimilar Recognition by P-Glycoprotein // J. Pharm. Sci. 2015. Vol. 104, №9. P. 3076-3083.
  13. Vakhitova Y.V., Sadovnikov S.V., Borisevich S.S., Ostrovskaya R.U., Gudasheva T.A., Seredenin S.B. Molecular Mechanism Underlying the Action of Substituted Pro-Gly Dipeptide Noopept // Acta Naturae. 2016. Vol. 8, №1. P. 82-89.
  14. 14. Ding Z., Yang L., Xie X., Xie F., Pan F., Li J. et al. Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells // Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. Vol. 136, №11. P. 1697-1707.
  15. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Черных И.В. Оценка принадлежности мек-сидола к субстратам, ингибиторам или индукторам гликопротеина-P // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т. 78, №5. С. 19-23.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Гацанога М.В., Попова Н.М., 2017

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-76803 от 24 сентября 2019 года.