ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ЦИНКА В УСЛОВИЯХ ЭНТЕРАЛЬНОГО И ВНУТРИСОСУДИСТОГО ВВЕДЕНИЯ НАНОФОРМЫ ГИДРОКСИДА ЦИНКА
- Выпуск: Том 25, № 2 (2017)
- Страницы: 193-201
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 24.09.2017
- Статья одобрена: 24.09.2017
- Статья опубликована: 25.09.2017
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/6994
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ20172193-201
- ID: 6994
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В экспериментах in vivo на кроликах изучены фармакокинетические свойства Zn2+ при введении наночастиц гидроксида цинка (2-3 нм), полученных золь-гель методом. В качестве соединения-сравнения был избран растворимый сульфат цинка. Количественное определение цинка в плазме крови было выполнено методом атомно-абсорбционной спектрометрии с предварительной пробоподготовкой методом «мокрого» озоления. Рассчитаны фармакокинетические параметры после однократного энтерального введения (10, 50 и 100 мг/кг) и однократного внутривенного введения (10, 50 и 100 мг/кг). Установлено, что наночастицы гидроксида цинка обладают высокой абсолютной биодоступностью – 33,01±3,55%, 45,15±3,68% и 43,18±2,71% соответственно для доз 10, 50 и 100 мг/кг при энтеральном введении.
Ключевые слова
Полный текст
Среди большинства эссенциальных микроэлементов, наиболее важную роль в регуляции гомеостаза организма человека играет цинк [1]. Значительное влияние объясняется структурной и каталитической ролью более чем 3000 цинкзависимых энзимов. Мировой уровень смертности, сопряженной с микроэлементозами составляет 6% [2], а количество людей, страдающих от гипоцинкозов составляет более 1,1 млрд [3]. Клинические проявления недостатка Zn отражаются в комплексном нарушении работы иммунной, нервной и пищеварительной систем.
Важным шагом является коррекция недостаточного уровня цинка в организме, которая проводится, в основном, с использованием сульфата и оксида цинка, включенных в поливитаминные и минеральные комплексы [4]. Биологическая доступность таких препаратов невысока, поэтому актуальной задачей является поиск новых источников цинка, обладающих повышенными параметрами биодоступности.
С развитием технологий диспергирования растет интерес к изучению биологического отклика измельченных до наноразмеров (10-9 м) соединений. Результаты фармакокинетических и биофармацевтических исследований, проведенных для наноразмерных препаратов оксида цинка, свидетельствуют о более высоких параметрах биодоступности наночастиц по сравнению с сульфатом цинка [5-7].
Нами был получен наноразмерный препарат – гидроксид цинка, который обладает повышенными параметрами биологической активности в предварительных экспериментах на тест-культуре хлебопекарных дрожжей [8], а также при энтеральном введении крысам [9]. Исследование взаимодействия между организмом и новым лекарственным средством, фармакокинетики, а также установление связей между дозами и эффектом, является важной задачей современной фармакологии.
Цель исследования
Изучение фармакокинетических свойств наночастиц гидроксида цинка у кроликов после их однократного энтерального и внутривенного введения и определение абсолютной биодоступности.
Материалы и методы
Наночастицы гидроксида цинка получали золь-гель методом, путем реакции между ацетатом цинка (ХЧ) и гидроксидом лития при пониженной температуре в среде абсолютного этанола (масс. доля 99,95%) [10]. Полученный после центрифугирования гелеобразный гидроксид цинка исследовали методом малоуглового рентгеновского рассеяния для анализа распределения по размерам на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном спектрометре EDX-800HS (Shimadzu, Япония) с использованием позиционно чувствительного детектора. Было определено, что частицы обладают размером 2-3 нм [10].
Эксперименты выполнены на 96 кроликах-самцах Шиншилла массой 4200 - 4430 г, на базе НИИ Экспериментальной медицины при ФБГОУ ВО Курский государственный медицинский университет. Животные содержались в пластиковых клетках, при контролируемых условиях микроклимата (t=22-24oC, влажность 50- 70%), был организован искусственный 12- часовой световой день. Перед началом манипуляций кролики были подвергнуты акклиматизации в течение 10 суток. За 12 часов до начала эксперимента животных лишали пищи, предоставляя доступ к питьевой, профильтрованной воде в количестве ad libitum.
Фармакокинетику наночастиц гидроксида цинка изучали после введения соединения энтерально и внутривенно в дозах 10, 50 и 100 мг/кг в пересчете на цинк. В качестве соединения-сравнения был избран сульфат цинка, фармакокинетические свойства которого, были исследованы в тех же условиях. Внутривенное введение исследуемых препаратов производилось в форме суспензии в изотоническом растворе хлорида натрия. Внутрижелудочное введение наночастиц гидроксида цинка производилось в форме суспензии в деионизированной воде через зонд. Исследование было проведено в соответствии с требованиями главы 57 Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11].
Забор крови проводили в дискретные промежутки времени: для энтерального введения – 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 16; 24 ч, для внутрисосудистого введения – 0; 0,016; 0,15; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6; 12 ч. Образцы помещались в пробирки, обработанные литий-гепарином и центрифугировались при 3000 об/мин в течение 15 минут для отделения плазмы.
Предварительную пробоподготовку к количественному определению цинка проводили методом минерализации в хлорной кислоте (72,4%) при 190-210оС с доокислением перекисью водорода (36%). Прозрачный минерализат упаривался до влажных солей, после чего растворялся в деионизированной воде и анализировался методом атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрометре СПЕКТР-5-4 (АО «СОЮЗЦВЕТМЕТАВТОМАТИКА», номер в государственном реестре средств измерения 13743-04). Перед началом работы производилась калибровка методом абсолютной градуировки с использованием ГСО ионов цинка (ООО ЦСОВВ, Россия, номер в реестре 8053-94) в диапазоне концентраций 0,0005 – 1,0 мг/дм3.
Для характеристики статистических показателей рассчитывали среднюю арифметическую, стандартное квадратичное отклонение средней арифметической (Sd), стандартную ошибку средней арифметической (m), коэффициент вариации (CV%). Математические расчеты и построение графиков реализовывалось при помощи программного обеспечения Origin Pro 9.2 (OriginLab, США) и Excel 14 (Microsoft, США).
Результаты и их обсуждение
Фармакокинетические кривые наночастиц гидроксида цинка после энтерального введения представлены на рисунке 1, а соответствующие им фармакокинетические параметры в таблице 1.
Рис. 1. Фармакокинетические кривые гидроксида (А) и сульфата цинка (B) при их энтеральном введении в дозах 10 (1), 50 (2) и 100 (3) мг/кг
Таблица 1. Параметры фармакокинетики гидроксида и сульфата цинка
после однократного энтерального введения
| Однократное энтеральное введение | Однократное энтеральное введение |
| ||||
Параметры | наноформы гидроксида цинка | растворимого сульфата цинка |
| ||||
|
|
|
|
|
|
| |
| доза, мг/кг |
|
| доза, мг/кг |
|
| |
|
|
|
|
|
| ||
| 10 | 50 | 100 | 10 | 50 | 100 |
|
AUC0-t, | 1041,95±41,89 | 3581,48±59,42 | 6431,29±58,79 | 1269,68±56,58 | 3550,33±45,30 | 6061,00±55,73 |
|
ч×мкг/мл |
| ||||||
|
|
|
|
|
|
| |
AUMC, | 1246,41±34,07 | 3814,43±101,07 | 6768,75±145,35 | 1482,27±68,24 | 3766,19±41,70 | 6349,63±103,54 |
|
ч2×мкг/мл |
| ||||||
ClT,мл/ч | 9,61 ±0,38 | 13,96 ± 0,23 | 15,55 ± 0,14 | 7,89 ±0,35 | 14,09 ± 0,18 | 16,50 ± 0,15 |
|
MRT, ч | 1,19 ± 0,05 | 1,07 ± 0,03 | 1,05 ±0,02 | 1,17 ± 0,08 | 1,06 ±0,01 | 1,03 ± 0,02 |
|
Cmax, мкг/мл | 120,82±9,08 | 391,49±12,69 | 674,29±19,86 | 169,67±12,01 | 386,22±21,51 | 553,05±26,77 |
|
Tmax, ч | 4 | 4 | 4 | 6 | 6 | 6 |
|
Т1/2, ч | 5,02 ±0,12 | 5,21 ± 0,15 | 5,11 ± 0,09 | 5,59 ±0,17 | 5,51 ± 0,33 | 5,59 ±0,27 |
|
Cmax/AUC, 1/ч | 0,12 ±0,01 | 0,11 ± 0,01 | 0,10 ±0,01 | 0,13 ±0,01 | 0,11 ± 0,01 | 0,09 ±0,01 |
|
Fa, % | 33,01±3,55 | 45,15 ± 3,68 | 43,18 ± 2,71 | 32,92 ± 2,30 | 44,43 ± 4,60 | 38,96 ± 1,87 |
|
Примечание: , n=6 (в группе)
Основные фармакокинетические показатели рассчитывали модельно-независимым методом: AUC0-t (ч×мкг/мл) – площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время», AUMC (ч2×мкг/мл) – площадь под кривой «произведение времени на концентрацию фармакологического средства» (t×C), ClT (мл/ч) – общий клиренс, MRT (ч) – среднее время пребывания соединения в организме, Сmax (мкг/мл) – максимальная концентрация цинка в плазме животных, Tmax (ч) – время достижения__ максимальной концентрации в плазме, Т1/2 (ч) – период времени, за который концентрация соединения в плазме снижается вдвое, Сmax/AUC (1/ч) – параметр, характеризующий скорость всасывания в системный кровоток.
Время достижения максимальной концентрации Zn2+ в плазме после введения наноформы гидроксида цинка было определено, как 4 часа, что по сравнению с соединением-сравнения сульфатом цинка быстрее – 6 часов. Максимальная концентрация цинк-ионов в плазме после введения испытуемых соединений достоверно (p<0,05) выше для сульфата цинка, чем для наноформы при дозировке 10 мг/кг (169,67±12,01 мкг/мл и 120,82±9,08 мкг/мл соответственно), при дозировке 50 мг/кг не имеет статистических различий (386,22±10,38 и 391,49±12,69 мкг/мл) и при 100 мг/кг выше (р<0,05) для наночастиц гидроксида цинка (674,29±19,86 мкг/мл и 553,05±26,77 мкг/мл).
Процесс всасывания цинка при введении растворимой формы начинается в проксимальном отделе тонкого кишечника, где на границе щеточной каймы происходит его связывание с глобулином и альбумином, с последующим переносом в системный кровоток [12]. Механизм абсорбции цинка при введении малорастворимой формы может проходить различно – либо с полным растворением введенной формы в желудочном соке с последующим всасыванием характерным для растворимых форм, либо с частичным растворением, когда часть введенной формы попадает в тонкий кишечник в неизменном виде и способна проникать в системный кровоток в виде частиц в силу своего малого размера [5, 13]. При введении малых доз (10 и 50 мг/кг) наночастиц гидроксида цинка происходит практически полное растворение в желудочном соке, о чем свидетельствуют меньшие значения максимальной концентрации наноформы по сравнению с растворенной формой сульфата цинка. При введении более высоких доз (100 мг/кг) могут наблюдаться трудности при растворении наноформы в желудочном соке, которые обусловлены ее пространственным строением (наночастицы гидроксида цинка представляют собой коллоидную частицу, окруженную оболочкой из стабилизирующих противоионов), вследствие чего наночастицы могут проникать в тонкий кишечник в неизменном виде. Такой характер всасывания объясняет более быстрое время достижения максимальной концентрации наноформы в плазме крови – проникновение в системный кровоток в виде частиц, исключает время, затраченное на связывание ионов цинка с белками. Кроме того, часть цинка, перешедшего в растворенную форму, обуславливает более медленный спад после достижения максимальной концентрации.
Для определения параметров абсолютной биодоступности были изучены фармакокинетические параметры в условиях внутрисосудистого введения. На основании фармакокинетических кривых были рассчитаны фармакокинетические параметры, которые представлены в таблице 2.
Таблица 2. Параметры фармакокинетики гидроксида и сульфата цинка
после однократного внутривенного введения
| Однократная инъекция |
| Однократная инъекция сульфата цинка |
| |||||
| наноформы гидроксида цинка |
|
| ||||||
Параметры |
|
|
|
|
|
| |||
| доза, мг/кг |
|
|
| доза, мг/кг |
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
| ||
| 10 | 50 | 100 |
| 10 | 50 |
| 100 |
|
AUC0-t, | 31,23 ± 3,85 | 80,43 ± 7,09 | 150,31 ± 8,75 | 38,67 ± 2,28 | 80,57 ± 7,79 |
| 155,90 ± 10,43 |
| |
ч×мкг/мл |
|
| |||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
AUMC, | 35,89±4,19 | 84,18±8,75 | 150,48±8,35 | 40,28 ± 2,88 | 82,16±7,27 |
| 156,74±10,43 |
| |
ч2×мкг/мл |
|
| |||||||
ClT,мл/ч | 324,11 ± 38,76 | 625,79 ± 55,96 | 667,17 ± 38,63 | 259,37 ± 15,62 | 625,27 ± 58,64 |
| 643,11 ± 35,94 |
| |
MRT, ч | 1,16 ± 0,19 | 1,05 ± 0,06 | 1,00 ± 0,05 | 1,04 ± 0,09 | 1,02 ± 0,06 |
| 1,01 ± 0,08 |
| |
Cmax, мкг/мл | 115,92 ± 4,51 | 264,74 ± 6,09 | 400,64±17,36 | 178,29±10,77 | 382,76 ± 7,27 |
| 593,27 ± 12,70 |
| |
Tmax, ч | 0,016 | 0,016 | 0,016 |
| 0,016 | 0,016 |
| 0,016 |
|
Т1/2, ч | 0,40 ± 0,08 | 0,43 ± 0,08 | 0,40 ± 0,03 | 0,13 ± 0,01 | 0,14 ± 0,02 |
| 0,14 ± 0,01 |
| |
Cmax/AUC, 1/ч | 3,76 ± 0,51 | 3,31 ± 0,33 | 2,83 ± 0,34 | 4,53 ± 0,44 | 4,79 ± 0,45 |
| 4,04 ± 0,52 |
|
Примечание: , n=6 (в группе)
Время достижения максимальной концентрации в плазме при внутривенном введении составляет 0,016 ч (1 мин.) вне зависимости от введенной дозы и типа соединения. Значения максимальной концентрации ионов цинка в плазме при энтеральном введении достоверно (p<0,05) выше для дозировок 50 и 100 мг/кг, чем при внутривенном (рис. 2).
Рис. 2. Максимальная концентрация ионов цинка в плазме для наноформы гидроксида цинка и растворимого сульфата цинка после введения энтерально (1) и внутривенно (2) при трех уровнях дозы 10, 50 и 100 мг/кг. ( , p=0,05, * – различия статистически значимы)
Более низкий уровень концентрации Zn2+ в плазме крови может быть объяснен способностью наночастиц к адсорбции на поверхности форменных элементов крови (в частности, эритроцитов), что согласуется с известными литературными данными [14]. Поскольку определение концентрации цинка проводилось в плазме, то данный уровень (рис. 3) может демонстрировать долю распределения наноформы цинка гидроксида между эритроцитами и плазмой. В группе, где вводился растворимый сульфат цинка статистически значимых различий между концентрацией цинка в плазме при различных путях введения не наблюдается. Способность к накоплению наночастиц гидроксида цинка в эритроцитарной массе также была отмечена нами в экспериментах на крысах [5], где была обнаружена более высокая концентрация цинка, чем в плазме крови.
Рис. 3. Абсолютная биодоступность для наноформы гидроксида цинка (1) и для растворимого соединения-сравнения сульфата цинка (2) после введения энтерально в дозировке 10 (А), 50 (В) и 100 (С) мг/кг. ( , p=0,05, * – различия статистически значимы)
На основании данных площади под фармакокинетической кривой была определена относительная биодоступность (fa) (рис. 3). Для полученной нами наноформы гидроксида цинка значения составили 33,01±3,55, 45,15±3,68 и 43,18±2,71% соответственно для трех дозировок. Эти же параметры для соединения сравнения – сульфата цинка рассчитаны как 32,92±2,30, 44,43±4,60 и 38,96±1,87%. Отсутствие статистически значимых различий между значениями абсолютной биодоступности при дозировках 10 и 50 мг/кг объясняется механизмом всасывания по типу растворимого соединения (полное растворение в желудочном соке), а увеличение параметра fa для наноформы при увеличении дозировки до 100 мг/кг отражает изменение механизма – происходит всасывание не растворившихся в желудочном соке наночастиц в неизменном виде.
Выводы
- Определены основные параметры фармакокинетики цинка при введении его в наноформе гидроксида цинка, а также в форме растворимого сульфата цинка (соединение-сравнения).
- Максимальная концентрация ионов цинка в плазме крови при внутривенном введении наноформы гидроксида достоверно (p<0,05) ниже, чем при энтеральном введении и составляет 264,74±6,09 и 391,49±12,69 мкг/мл для дозировки 50 мг/кг, 400,64±17,36 и 674,29±19,86 мкг/мл для дозы 100 мг/кг, что свидетельствует об отличиях в механизме распределения наночастиц между эритроцитарной массой и плазмой по сравнению с растворимым соединением.
- Определены параметры абсолютной биодоступности для наноформы гидроксида цинка при энтеральном введении, которые составили 33,01±3,55, 45,15±3,68 и 43,18±2,71% соответственно для доз 10, 50 и 100 мг/кг.
- При энтеральном введении наноформы наблюдается более быстрое время наступления максимальной концентрации ионов цинка в крови (4 ч), чем при введении соединения - сравнения (6 ч).
Конфликт интересов отсутствует.
Список литературы
- Сальникова Е.В. Цинк – эссенциальный микроэлемент (обзор) // Вестник ОГУ. 2012. №10. С. 170-172.
- Kumssa D.B., Joy E.J.M., Ander E.L., Watts M.J., Young S.D., Walker S. et al.Dietary calcium and zinc deficiency risks are decreasing but remain prevalent // Scientific reports. 2015. Vol. 5. P. 1-11. doi: 10.1038/srep10974.
- Lim S.S., Vos T., Flaxman A.D., Danaei G., Shibuya K., Adair-Rohani H. et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analyses for the Global Burden of Disease Study // The Lancet. 2012. Vol. 380, №9859. P. 2224-2260. doi: 10.1016/S0140-6736(12)61766-8.
- Халиуллина С.В. Клиническое значение дефицита цинка в организме ребенка (обзор литературы) // Вестник современной клинической медицины. 2013. Т. 6, №3. С. 72-78.
- Kim M.K., Lee J-A., Jo M-R., Choi S-J. Bioavailability of silica, titanium dioxide, and zinc oxide nanoparticles in rats // Journal of nanoscience and nanotechnology. 2016. Vol. 16, №6. P. 6580-6586. doi: 10.1166/jnn.2016.12350.
- Baek M., Chung H.E., Yu J., Lee J.A., Kim T.H., Oh J.M. et al. Pharmacokinetics, tissue distribution, and excretion of zinc oxide nanoparticles // International Journal of Nanomedicine. 2012. Vol. 7. P. 3081-3097. doi: 10.2147/IJN.S32593.
- Котенко К.В., Беляев И.К., Бузулуков Ю.П., Бушманов А.Ю., Демин В.Ф., Жорова Е.С. и др. Экспериментальное исследование биокинетики наночастиц оксида цинка у крыс после однократного перорального введения с использованием технологии меченых атомов // Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2011. Т. 56, №2. С. 5-10.
- Ларин С.Л., Будко Е.В., Хабаров А.А. Влияние разноразмерных соединений цинка на подъемную силу тесткультуры Saccharomyces cerevisiae // Международный научно-исследовательский журнал. 2016. Т. 47, №5. С. 180-185. doi: 10.18454/IRJ.2016.47.129.
- Ларин С.Л., Будко Е.В., Хабаров А.А., Липатов В.А., Звягинцева А.Р. Экспериментальное исследование динамики накопления цинка при внутрижелудочном введении наночастиц Zn(OH)2 и микрочастиц ZnO // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2016. №3. С. 100- 106. doi: 10.21626/vestnik/2016-3/15.
- Будко Е.В., Хабаров А.А., Ларин С.Л. Синтез и характеристика малоразмерных соединений цинка для коррекции гипоцинкозов // Перспективные материалы. 2016. №3. С. 41-46.
- Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012. Ч. 1. 944 с.
- Krebs N.F. Overview of zinc absorption and excretion in the human gastrointestinal tract // The Journal of nutrition. 2000. Vol. 130, №5. P. 1374S-1377S.
- Song W., Zhang J., Guo J., Zhang J., Ding F., Li L., Sun Z. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles // Toxicology Letters. 2010. Vol. 199, №3. P. 389- 397. doi: 10.1016/j.toxlet.2010.10.003.
- Šimundić M., Drašler B., Šuštar V., Zupanc J., Štukelj R., Makovec D. et al. Effect of engineered TiO2 and ZnO nanoparticles on erythrocytes, platelet-rich plasma and giant unilamelar phospholipid vesicles // BMC Veterinary Research. 2013. Vol. 9, №7. P. 1-13. doi: 10.1186/1746-6148-9-7.