EXPERIMENTAL PHARMACOKINETIC STUDY OF ZINC WHEN ZINC HYDROXIDE NANOFORM IS ADMINISTERED ENTERALY AND INTRAVASCULARY

Full Text

Среди большинства эссенциальных микроэлементов, наиболее важную роль в регуляции гомеостаза организма человека играет цинк [1]. Значительное влияние объясняется структурной и каталитической ролью более чем 3000 цинкзависимых энзимов. Мировой уровень смертности, сопряженной с микроэлементозами составляет 6% [2], а количество людей, страдающих от гипоцинкозов составляет более 1,1 млрд [3]. Клинические проявления недостатка Zn отражаются в комплексном нарушении работы иммунной, нервной и пищеварительной систем.

Важным шагом является коррекция недостаточного уровня цинка в организме, которая проводится, в основном, с использованием сульфата и оксида цинка, включенных в поливитаминные и минеральные комплексы [4]. Биологическая доступность таких препаратов невысока, поэтому актуальной задачей является поиск новых источников цинка, обладающих повышенными параметрами биодоступности.

С развитием технологий диспергирования растет интерес к изучению биологического отклика измельченных до наноразмеров (10-9 м) соединений. Результаты фармакокинетических и биофармацевтических исследований, проведенных для наноразмерных препаратов оксида цинка, свидетельствуют о более высоких параметрах биодоступности наночастиц по сравнению с сульфатом цинка [5-7].

Нами был получен наноразмерный препарат – гидроксид цинка, который обладает повышенными параметрами биологической активности в предварительных экспериментах на тест-культуре хлебопекарных дрожжей [8], а также при энтеральном введении крысам [9]. Исследование взаимодействия между организмом и новым лекарственным средством, фармакокинетики, а также установление связей между дозами и эффектом, является важной задачей современной фармакологии.

Цель исследования

Изучение фармакокинетических свойств наночастиц гидроксида цинка у кроликов после их однократного энтерального и внутривенного введения и определение абсолютной биодоступности.

Материалы и методы

Наночастицы гидроксида цинка получали золь-гель методом, путем реакции между ацетатом цинка (ХЧ) и гидроксидом лития при пониженной температуре в среде абсолютного этанола (масс. доля 99,95%) [10]. Полученный после центрифугирования гелеобразный гидроксид цинка исследовали методом малоуглового рентгеновского рассеяния для анализа распределения по размерам на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном спектрометре EDX-800HS (Shimadzu, Япония) с использованием позиционно чувствительного детектора. Было определено, что частицы обладают размером 2-3 нм [10].

Эксперименты выполнены на 96 кроликах-самцах Шиншилла массой 4200 - 4430 г, на базе НИИ Экспериментальной медицины при ФБГОУ ВО Курский государственный медицинский университет. Животные содержались в пластиковых клетках, при контролируемых условиях микроклимата (t=22-24oC, влажность 50- 70%), был организован искусственный 12- часовой световой день. Перед началом манипуляций кролики были подвергнуты акклиматизации в течение 10 суток. За 12 часов до начала эксперимента животных лишали пищи, предоставляя доступ к питьевой, профильтрованной воде в количестве ad libitum.

Фармакокинетику наночастиц гидроксида цинка изучали после введения соединения энтерально и внутривенно в дозах 10, 50 и 100 мг/кг в пересчете на цинк. В качестве соединения-сравнения был избран сульфат цинка, фармакокинетические свойства которого, были исследованы в тех же условиях. Внутривенное введение исследуемых препаратов производилось в форме суспензии в изотоническом растворе хлорида натрия. Внутрижелудочное введение наночастиц гидроксида цинка производилось в форме суспензии в деионизированной воде через зонд. Исследование было проведено в соответствии с требованиями главы 57 Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств [11].

Забор крови проводили в дискретные промежутки времени: для энтерального введения – 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 16; 24 ч, для внутрисосудистого введения – 0; 0,016; 0,15; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6; 12 ч. Образцы помещались в пробирки, обработанные литий-гепарином и центрифугировались при 3000 об/мин в течение 15 минут для отделения плазмы.

Предварительную пробоподготовку к количественному определению цинка проводили методом минерализации в хлорной кислоте (72,4%) при 190-210оС с доокислением перекисью водорода (36%). Прозрачный минерализат упаривался до влажных солей, после чего растворялся в деионизированной воде и анализировался методом атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрометре СПЕКТР-5-4 (АО «СОЮЗЦВЕТМЕТАВТОМАТИКА», номер в государственном реестре средств измерения 13743-04). Перед началом работы производилась калибровка методом абсолютной градуировки с использованием ГСО ионов цинка (ООО ЦСОВВ, Россия, номер в реестре 8053-94) в диапазоне концентраций 0,0005 – 1,0 мг/дм3.

Для характеристики статистических показателей рассчитывали среднюю арифметическую, стандартное квадратичное отклонение средней арифметической (Sd), стандартную ошибку средней арифметической (m), коэффициент вариации (CV%). Математические расчеты и построение графиков реализовывалось при помощи программного обеспечения Origin Pro 9.2 (OriginLab, США) и Excel 14 (Microsoft, США).

Результаты и их обсуждение

Фармакокинетические кривые наночастиц гидроксида цинка после энтерального введения представлены на рисунке 1, а соответствующие им фармакокинетические параметры в таблице 1.

Рис. 1. Фармакокинетические кривые гидроксида (А) и сульфата цинка (B) при их энтеральном введении в дозах 10 (1), 50 (2) и 100 (3) мг/кг

Таблица 1. Параметры фармакокинетики гидроксида и сульфата цинка

после однократного энтерального введения

Примечание: , n=6 (в группе)

Основные фармакокинетические показатели рассчитывали модельно-независимым методом: AUC0-t (ч×мкг/мл) – площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время», AUMC (ч2×мкг/мл) – площадь под кривой «произведение времени на концентрацию фармакологического средства» (t×C), ClT (мл/ч) – общий клиренс, MRT (ч) – среднее время пребывания соединения в организме, Сmax (мкг/мл) – максимальная концентрация цинка в плазме животных, Tmax (ч) – время достижения__ максимальной концентрации в плазме, Т1/2 (ч) – период времени, за который концентрация соединения в плазме снижается вдвое, Сmax/AUC (1/ч) – параметр, характеризующий скорость всасывания в системный кровоток.

Время достижения максимальной концентрации Zn2+ в плазме после введения наноформы гидроксида цинка было определено, как 4 часа, что по сравнению с соединением-сравнения сульфатом цинка быстрее – 6 часов. Максимальная концентрация цинк-ионов в плазме после введения испытуемых соединений достоверно (p<0,05) выше для сульфата цинка, чем для наноформы при дозировке 10 мг/кг (169,67±12,01 мкг/мл и 120,82±9,08 мкг/мл соответственно), при дозировке 50 мг/кг не имеет статистических различий (386,22±10,38 и 391,49±12,69 мкг/мл) и при 100 мг/кг выше (р<0,05) для наночастиц гидроксида цинка (674,29±19,86 мкг/мл и 553,05±26,77 мкг/мл).

Процесс всасывания цинка при введении растворимой формы начинается в проксимальном отделе тонкого кишечника, где на границе щеточной каймы происходит его связывание с глобулином и альбумином, с последующим переносом в системный кровоток [12]. Механизм абсорбции цинка при введении малорастворимой формы может проходить различно – либо с полным растворением введенной формы в желудочном соке с последующим всасыванием характерным для растворимых форм, либо с частичным растворением, когда часть введенной формы попадает в тонкий кишечник в неизменном виде и способна проникать в системный кровоток в виде частиц в силу своего малого размера [5, 13]. При введении малых доз (10 и 50 мг/кг) наночастиц гидроксида цинка происходит практически полное растворение в желудочном соке, о чем свидетельствуют меньшие значения максимальной концентрации наноформы по сравнению с растворенной формой сульфата цинка. При введении более высоких доз (100 мг/кг) могут наблюдаться трудности при растворении наноформы в желудочном соке, которые обусловлены ее пространственным строением (наночастицы гидроксида цинка представляют собой коллоидную частицу, окруженную оболочкой из стабилизирующих противоионов), вследствие чего наночастицы могут проникать в тонкий кишечник в неизменном виде. Такой характер всасывания объясняет более быстрое время достижения максимальной концентрации наноформы в плазме крови – проникновение в системный кровоток в виде частиц, исключает время, затраченное на связывание ионов цинка с белками. Кроме того, часть цинка, перешедшего в растворенную форму, обуславливает более медленный спад после достижения максимальной концентрации.

Для определения параметров абсолютной биодоступности были изучены фармакокинетические параметры в условиях внутрисосудистого введения. На основании фармакокинетических кривых были рассчитаны фармакокинетические параметры, которые представлены в таблице 2.

Таблица 2. Параметры фармакокинетики гидроксида и сульфата цинка

после однократного внутривенного введения

Примечание: , n=6 (в группе)

Время достижения максимальной концентрации в плазме при внутривенном введении составляет 0,016 ч (1 мин.) вне зависимости от введенной дозы и типа соединения. Значения максимальной концентрации ионов цинка в плазме при энтеральном введении достоверно (p<0,05) выше для дозировок 50 и 100 мг/кг, чем при внутривенном (рис. 2).

Рис. 2. Максимальная концентрация ионов цинка в плазме для наноформы гидроксида цинка и растворимого сульфата цинка после введения энтерально (1) и внутривенно (2) при трех уровнях дозы 10, 50 и 100 мг/кг. ( , p=0,05, * – различия статистически значимы)

Более низкий уровень концентрации Zn2+ в плазме крови может быть объяснен способностью наночастиц к адсорбции на поверхности форменных элементов крови (в частности, эритроцитов), что согласуется с известными литературными данными [14]. Поскольку определение концентрации цинка проводилось в плазме, то данный уровень (рис. 3) может демонстрировать долю распределения наноформы цинка гидроксида между эритроцитами и плазмой. В группе, где вводился растворимый сульфат цинка статистически значимых различий между концентрацией цинка в плазме при различных путях введения не наблюдается. Способность к накоплению наночастиц гидроксида цинка в эритроцитарной массе также была отмечена нами в экспериментах на крысах [5], где была обнаружена более высокая концентрация цинка, чем в плазме крови.

Рис. 3. Абсолютная биодоступность для наноформы гидроксида цинка (1) и для растворимого соединения-сравнения сульфата цинка (2) после введения энтерально в дозировке 10 (А), 50 (В) и 100 (С) мг/кг. ( , p=0,05, * – различия статистически значимы)

На основании данных площади под фармакокинетической кривой была определена относительная биодоступность (fa) (рис. 3). Для полученной нами наноформы гидроксида цинка значения составили 33,01±3,55, 45,15±3,68 и 43,18±2,71% соответственно для трех дозировок. Эти же параметры для соединения сравнения – сульфата цинка рассчитаны как 32,92±2,30, 44,43±4,60 и 38,96±1,87%. Отсутствие статистически значимых различий между значениями абсолютной биодоступности при дозировках 10 и 50 мг/кг объясняется механизмом всасывания по типу растворимого соединения (полное растворение в желудочном соке), а увеличение параметра fa для наноформы при увеличении дозировки до 100 мг/кг отражает изменение механизма – происходит всасывание не растворившихся в желудочном соке наночастиц в неизменном виде.

Выводы

1. Определены основные параметры фармакокинетики цинка при введении его в наноформе гидроксида цинка, а также в форме растворимого сульфата цинка (соединение-сравнения).
2. Максимальная концентрация ионов цинка в плазме крови при внутривенном введении наноформы гидроксида достоверно (p<0,05) ниже, чем при энтеральном введении и составляет 264,74±6,09 и 391,49±12,69 мкг/мл для дозировки 50 мг/кг, 400,64±17,36 и 674,29±19,86 мкг/мл для дозы 100 мг/кг, что свидетельствует об отличиях в механизме распределения наночастиц между эритроцитарной массой и плазмой по сравнению с растворимым соединением.
3. Определены параметры абсолютной биодоступности для наноформы гидроксида цинка при энтеральном введении, которые составили 33,01±3,55, 45,15±3,68 и 43,18±2,71% соответственно для доз 10, 50 и 100 мг/кг.
4. При энтеральном введении наноформы наблюдается более быстрое время наступления максимальной концентрации ионов цинка в крови (4 ч), чем при введении соединения - сравнения (6 ч).

Конфликт интересов отсутствует.

References

Supplementary files