СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОНИАЗИДА И ЕГО ДЕРИВАТОВ ПО РЕАКЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛИМЕТИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ С 4-ОКСОУРАЦИЛОМ
- Выпуск: Том 25, № 2 (2017)
- Страницы: 289-295
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 25.09.2017
- Статья одобрена: 25.09.2017
- Статья опубликована: 25.09.2017
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/7004
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2017252289-295
- ID: 7004
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Процесс лечения туберкулеза требует мониторинга концентрации противотуберкулезных препаратов в крови, а также их распределения и выведения из организма для предотвращения передозировки противотуберкулезных препаратов. Индивидуализировать дозы лекарственных средств возможно с учетом индивидуальной активности фермента N-ацетилтрансферазы, активность которой можно определить косвенным методом по продуктам биотрансформации противотуберкулезных препаратов.
Существующие на сегодняшний день способы детектирования содержания тест-препарата ацетилирования - изониазида - масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография - имеют ряд существенных недостатков, таких как высокая стоимость и методическая сложность в проведении исследования.
В настоящей статье представлены результаты разработки унифицированной методики количественного определения противотуберкулезного препарата изониазида и его конъюгата - ацетилизониазида. В основу спектрофотометрического метода положена реакция расщепления пиридинового цикла изониазида с образованием глутаконового альдегида и его последующее сочетание с 4-оксоурацилом с образованием полиметинового красителя.
Разработанный метод позволяет провести количественное определение изониазида в лекарственных формах, а также изониазида и его дериватов в биологических жидкостях организма человека (моче), что косвенно дает возможность оценить активность N-ацетилтрансферазы при проведении фармакокинетических исследований.
Полный текст
По данным ВОЗ ежедневно около 1000 человек в европейском регионе заражаются туберкулезом, в том числе мультирезистентным, и только 50% из них удается успешно вылечить. Ситуация требует расширения доступа к безопасным и эффективным препаратам, а также инновационного подхода к экспрессдиагностике и лечению туберкулеза, исходя из каждого индивидуального случая.
Современная фармакотерапия туберкулеза предусматривает комплексное использование специфических антибактериальных препаратов и лекарственных средств разных фармакологических групп (иммуномодуляторов, гормональных препаратов, муколитических средств и др.). К препаратам 1 ряда, являющимися основными химиотерапевтическими средствами для лечения различных форм туберкулеза, относятся изониазид и его производные антибиотики (стрептомицин, канамицин, рифампицин) и этамбутол. Препараты 1 ряда в виде комбинаций применяют преимущественно при впервые выявленном туберкулезе [1]. Курс лечения составляет от 6-ти и более месяцев. Вместе с тем необходимо учитывать, что действие противотуберкулезных препаратов сопровождается обычно побочными эффектами, выраженность которых может возрастать при их одновременном применении [2].
Изучение фармакокинетики химиотерапевтических препаратов особенно важно в процессе химиотерапии туберкулеза, так как для достижения эффекта необходимо длительное лечение, нарушение которого может привести к резистентности туберкулезной палочки к применяемым лекарственным средствам. Процесс лечения требует постоянного контроля за содержанием противотуберкулезных препаратов в крови и их выведением для оптимизации терапии. Это особенно актуально при нарушении функции почек, так как в этих случаях может наблюдаться задержка выведения противотуберкулезных средств и их кумуляция. Во многих случаях необходимо индивидуализировать дозы лекарственных препаратов с учетом их растворимости, всасываемости, интенсивности инактивации, скорости выведения, что зависит от активности фермента N-ацетилтрансферазы (NAT). Под действием фермента происходит биотрансформация (в частности, процесс ацетилирования) противотуберкулезных лекарственных средств.
В результате реакции ацетилирования изониазида образуется ацетилизониа- зид, который не обладает антитуберкулезной активностью и в дальнейшем гидролизуется до изоникотиновой кислоты и ацетилгидразина. Оба метаболита частично экскретируются с мочой. Кроме того, изоникотиновая кислота конъюгируется с глицином, а ацетилгидразин биорансфор- мируется до диацетилгидразина и может далее гидролизоваться под действием микросомальных ферментов до гидразина, обладающего гепатотоксичностью [3].
Следует отметить, что активность NAT у разных людей генетически отличается, поэтому метаболизм может быть или быстрым, или медленным. Знание относительной индивидуальной активности NAT может позволить оптимизировать режимы дозирования противотуберкулезных лекарственных средств и оценить пользу и риск их воздействия на организм. Активность фермента NAT можно определить косвенным методом по исследованию фармакокинетики тест-препарата ацетилирования - изониазида.
Таким образом, актуальной является разработка экспрессной высокочувствительной методики количественного определения изониазида в субстанции. Данная методика позволит провести количественное определение изониазида не только в лекарственных формах, но и в биологических жидкостях организма человека (моче), что необходимо при фармакокинетических исследованиях с целью определения активности фермента NAT.
Целью нашего исследования является разработка простой в использовании, экспрессной и валидизированной методики количественного определения изониазида не только в фармацевтических субстанциях и лекарственных формах, но и в биологических жидкостях.
В основе спектрофотометрического метода количественного определения изониазида в видимой области спектра, была использована реакция образования полиметинового красителя с 4-оксоурацилом.
Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:
- Осуществить выбор рабочей длины волны.
- Определить линейную зависимость между концентрацией фармацевтической субстанции к оптической плотности продукта реакции с 4-оксоурацилом.
- Установить время устойчивости окраски.
- Определить чувствительность реакции с целью возможности использования её при химико-токсикологических исследованиях.
- Определить диапазон подчинения продукта реакции основному закону светопоглощения.
- Провести количественное определение изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости (моче).
Материалы и методы
Все исследования проводили на фотометре КФК-3 в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм при комнатной температуре. В анализе использовали рабочий стандартный образец (РСО) изониазида (ФС 42-0236-07). Приготовление стандартного рабочего раствора: 0,12 г изониазида (точная навеска) помещали в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяли в воде, доводили водой до метки, тщательно перемешивали. 25 мл полученного раствора переносили в мерную колбу емкостью 100 мл, доводили водой до метки, тщательно перемешивали.
Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (р=95%) проводили с помощью программ Stat Soft, Statistica 6,0, Microsoft Excel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения [4].
Результаты и их обсуждение
Для количественного определения изониазида в субстанции Государственная Фармакопея рекомендует объемный метод кислотно-основного титрования в неводных средах, используя его основные свойства. Навеску лекарственного средства титруют хлорной кислотой в среде ледяной уксусной кислоты и уксусного ангидрида [5]. Метод связан с достаточно большими временными затратами, с необходимостью использования летучих агрессивных реактивов и ограничен для применения в токсико- кинетических исследованиях.
На сегодняшний день существуют другие способы детектирования содержа ния тест-препарата ацетилирования - изо- ниазида - методами масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, флуориметрии [6]. Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, таких как высокая стоимость, методическая сложность и длительность проведения исследования [7, 8].
Разработанная нами ранее методика спектрофотометрического определения фармацевтических субстанций [9], в том числе изониазида, в основе которой была использована реакция с метаванадатом аммония [10], может быть использована для количественного определения только нативного препарата. Данная реакция основана на способности соединений ванидия (V) образовывать окрашенные комплексы с органическими лигандами, имеющими в своей структуре незамещенную гидразид- ную группу. N-ацетильный конъюгатизо- ниазида в эту реакцию не вступает, так как является дериватом изониазида по гидразидной группе. В то же время, изо- ниазид и его ацетильный конъюгат в своей структуре содержат пиридиновый цикл со свободными а, а1 - положениями. Для подобных циклов характерно расщепление под действием различных реактивов, например, хлорциана или бромциана. Однако, наиболее доступным является тио- цианохлорид, который образуется при взаимодействии хлорамина и тиоционата аммония. При расщеплении пиридинового цикла образуется глутаконовый альдегид,
который при взаимодействии с сочетающими реагентами, например 4-оксоура- цилом, образует полиметиновый краситель. Следовательно, использование реакции образования полиметинового красителя позволяет определить суммарно изониа- зид и его дериват - ацетилизониазид.
Для выбора рабочей длины волны готовили раствор изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. По истечении 5 минут измеряли оптическую плотность окрашенного продукта реакции при разных длинах волн, относящихся к видимой области спектра (380нм -780нм).
Спектр поглощения раствора изо- ниазидав видимой области имеет максимум при длине волны 608 нм. При той же длине волны проводили измерения оптической плотности испытуемых растворов и растворов сравнения. Результаты определения устойчивости окраски во времени представлены в таблице 1. Из данных таблицы видно, что в течение 30 минут окраска оставалась устойчивой.
Для выявления линейной зависимости между концентрацией фармацевтической субстанции изониазида и оптической плотностью продукта его реакции с 4- оксоурацилом готовили ряд разведений в широком диапазоне концентраций - от 0,012 г/мл до 0,048 г/мл. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что в выбранном интервале концентраций изониазида наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера.
Таблица 1. Зависимость оптической плотности окрашенного комплекса от времени
Объем раствора изониазида и его концентрация, г/мл | Длина волны, нм | Оптическая плотность | |||||
5 мин | 10 мин | 15 мин | 20 мин | 25 мин | 30 мин | ||
1 мл; 0,0003 г/мл | 608 | 0,436 | 0,436 | 0,437 | 0,438 | 0,438 | 0,437 |
Относительная погрешность определения находилась в пределах точности спектрофотометрического анализа.
Минимальная концентрация изониа- зида, определяемая по этой методике, составляет 0,006 г/мл, что свидетельствует о возможности ее применения не только для
анализа фармацевтических препаратов, но и для определения изониазида в биологических объектах.
Следующим этапом исследования явилось определение содержания изониа- зида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме. Определение прово дили в сравнительном аспекте с раствором стандартного образца, поскольку данный метод определения является более точным,
надежным и отвечает требованиям Государственной Фармакопеи. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты определения изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме
№ опыта | Объект исследования | Найдено | Нормы допустимых отклонений | Метрологическая характеристика |
1. | Фармацевтическая субстанция | 99,98 | Не менее 99,9%, не бо- | Хср= 100,02 |
2. | изониазида | 99,98 | лее 101,0% | S= 0,1009 |
3. |
| 99,96 |
| So= 0,4512 |
4. |
| 99,98 |
| е= 0, 0125 |
5. |
| 100,2 |
| ea= 100,02 ± 1,25 |
1. | Таблетки изониазида по 0,3г | 0,285 | Хср= 0,286 | |
2. |
| 0,286 |
| S= 0,001527 |
3. |
| 0,285 |
| So= 0,0006819 |
4. |
| 0,286 |
| е= 0,0066 |
5. |
| 0,285 |
| sa= 0,286± 0,006 |
Как следует из приведенных в таблице данных, полученные результаты укладываются в нормы допустимых отклонений.
Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получить воспроизводимые результаты.
Разработанная методика была применена в химико-токсикологическом исследовании изониазидав моче в качестве биологической жидкости.
Для приготовления модельной смеси использовали образец мочи, полученный от здорового добровольца. При этом в течении месяца до отбора проб человек не принимал лекарств. Модельные смеси мочи готовили путем добавления к ней определенного объема стандартного раствора изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. Приготовленные смеси выдерживали в течении 24 часов при комнатной температуре.
Для осаждения белковых веществ добавляли 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования проводили количественное определение по методике, разработанной для фармацевтической субстанции исследуемого лекарственного средства. Определение изониазида в моче оценивалось методом «введено - найдено». Предел обнаружения изониазида при указанных условиях спектрофотометрического определения 0,006 г/мл. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Таким образом, разработанная методика отличается от известных методов определения изониазида [6] простотой выполнения, высокой чувствительностью, воспроизводимостью и не требует сложного оборудования и дорогих реактивов.
Экспресс-методика дает возможность определить содержание изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме.
Таблица 3. Результаты количественного определения изониазида в модельной смеси образца мочи спектрофотометрическим методом по реакции с 4-оксоурацилом
Внесено изониазида, мг/ 5 мл мочи | Найдено | Метрологическая характеристика | |
мг | % | ||
0,3 | 0,240 | 80,0 | ХсР= 769,2 |
0,3 | 0,228 | 76,0 | S= 2,21 |
0,3 | 0,243 | 81,0 | So= 0,988 |
0,3 | 0,231 | 77,0 | s= 3,5 |
0,3 | 0,240 | 80,0 | ea= 79,2±3,5 |
Чувствительность метода позволяет определять изониазид и его основной метаболитацетилизониазид в биологических жидкостях, так как определяемая концентрация находится в диапазоне концентраций экскретируемых с мочой [3], что позволяет косвенно судить об активности N-ацетилтрансферазы.
Выводы
- Разработана методика количественного определения изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости спектрофотометрическим методом в видимой области спектра.
- Показана возможность использования данной методики в дальнейших химико-токсикологических исследованиях.
Конфликт интересов отсутствует.
Список литературы
- Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия: руководство для врачей. М.: Боргес, 2002. 432 с.
- Машковский М.Д. Лекарственные средств. 15-е изд., перераб., испр. и доп. М.: РИА «Новая волна», 2007. 1206 с.
- Walubo A., Chan K., Wong C.L. Simultaneous assay for isiniazid and hydrazine metabolite in plasma and cerebrospinal fluid in the rabbit // J. Chromatogr. 1991. Vol. 567. P. 261-266.
- Государственная Фармакопея Российской Федерации. 13-е изд. Федеральная Электронная медицинская Библиотека [Электронный ресурс]. URL: http:// 193/222 /7/107/feml (дата обращения 21.10.2016).
- Государственная фармакопея Российской Федерации. 12-е изд. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. 704 с.
- Черных И.В., Щулькин А.В., Га- цанога М.В., Мыльников П.Ю. Разработка ВЭЖХ методики количественного определения этилметилгидроксипиридинасук- цината в плазме крови крыс и кроликов // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. №1. С. 62-66.
- Мелентьев А.Б., Лаврентьева А.В. Определение изониазида в трупной крови и плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодноматричным детектором // Судебно-медицинская экспертиза. 2011. №4. С. 23-27.
- Фартушный А. Ф. Хромато-спектро-фотометрическое определение производных изоникотиновой кислоты в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. 1981. №4. С. 42-44.
- Чекулаева Г.Ю., Громова З.Ф. Метод количественного определения некоторых производных пара-аминофенола в фармацевтических и химико-токсикологических исследованиях // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. №2. С. 129-133.
- Чекулаева Г.Ю., Громова З.Ф. Разработка и усовершенствование метода анализа некоторых производных изоникотиновой кислоты в фармацевтическом и химико-токсикологическом исследованиях // Успехи современного естествознания. 2015. №11. С. 98-101.