Полиморфизм генов синтаз оксида азота (NOS1 84G/A И NOS3 786C/T) у больных бронхиальной астмой и гипертонической болезнью

Полный текст

Последние годы всё большее внимание исследователей привлекает проблема коморбидности [12; 80; 87; 92]. Изучение коморбидной патологии способствует более ясному пониманию механизма развития болезней и разработке патогенетически обоснованной терапии. Представляет интерес изучение коморбидности таких важных, социально-значимых заболеваний, как бронхиальная астма (БА) и гипертоническая болезнь (ГБ). Доля пациентов с БА, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, достигает 50%. При этом основное место среди них занимают больные гипертонической болезнью, распространённость которой среди больных БА оценивается от 12,9% до 37,6% и увеличивается с возрастом [1]. На сегодняшний день многие вопросы, касающиеся клинического течения и патогенеза коморбидной патологии бронхиальной астмы и гипертонической болезни, остаются открытыми. Однако не вызывает сомнений существование патогенетических механизмов взаимного влияния этих двух заболеваний. Один из возможных механизмов – изменение физиологического синтеза оксида азота (NO), который регулирует тонус сосудов и артериальное давление; адгезию тромбоцитов и пролиферацию гладкомышечных клеток; ионный транспорт и барьерную функцию эпителия, секрецию слизи и мукоцилиарный клиренс [2, 3](5–7). Уменьшение эндотелиальной продукции оксида азота ведёт к развитию и прогрессированию эндотелиальной дисфункции и росту артериального давления [4, 5](8,9). Кроме того, NO участвует в формировании воспаления при бронхиальной астме, тормозя продукцию противовоспалительных медиаторов в эпителии и ингибируя функциональную активность Т-лимфоцитов [6](10).

В организме оксид азота синтезируется из L-аргинина группой цитохром P-450-подобных гемопротеинов – NO-синтаз, включающих три изоформы: нейрональную (nNOS), макрофагальную (iNOS) и эндотелиальную (eNOS) [7]. Эти изоформы соответственно являются продуктами экспрессии генов NOS1, NOS2 и NOS3. В физиологических условиях нейрональная и эндотелиальная синтазы оксида азота конститутивны, но при различных патологических состояниях их экспрессия индуцируется, что сопровождается повышенным образованием NO. Продуцируемый геном NOS1 оксид азота известен как нейротрансмиттер нервных синапсов, а также как регулятор физиологических процессов дыхания. Генетические данные показывают значимость гена NOS1 в патогенезе бронхиальной гиперчувствительности при астме. Оксид азота, вырабатываемый eNOS, кодируемой геном NOS3, является самым мощным из известных эндогенных вазодилататоров, и его связь с сердечно-сосудистой патологией не вызывает сомнений. Активность экспрессии NOS напрямую зависит от нуклеотидного состава, кодирующих генов. Большое количество исследований посвящены изучению различных вариантов полиморфизма генов NOS и их связи с развитием заболеваний.

Таким образом, способность NO выступать в качестве физиологического регулятора или же возможного токсического агента может быть обусловлена активностью изоформ синтазы оксида азота, которая различается при наличии тех или иных мутаций генов NOS. Среди таких мутаций интересны однонуклеотидный полиморфизм гена NOS1-84G/A и гена NOS3-786C/T. Изучение их клинико-патогенети-ческого значения в формировании коморбидной патологии бронхиальной астмы и гипертонической болезни стало целью настоящего исследования. Для этого нами были поставлены задачи изучить распространённость полиморфизмов NOS1 84G/A и NOS3 786C/T у больных с сочетанным течением бронхиальной астмой и гипертонической болезнью и оценить их связь с развитием и течением коморбидной патологии.

Материалы и методы

Исследование выполнено с 2014 по 2016 год на кафедре факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова. Проведённое исследование одобрено ЛЭК РязГМУ и соответствует требованиям Надлежащей Клинической Практики (GCP) и Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования».

В исследование был включён 71 пациент, проходивший стационарное лечение в ГБУ РО «Областная клиническая больница» (г. Рязань) по поводу бронхиальной астмы или гипертонической болезни. Все пациенты были представителями европеоидной расы, постоянно проживали на территории Рязанской области и не состояли в родстве.

В исследования были включены пациенты, отвечающие критериям включения: подписанное добровольное информированное согласие на участие в исследовании; способность понимать процедуры исследования, а также адекватно сотрудничать с исследователем; возраст пациента в диапазоне от 45 до 69 лет; диагноз «Бронхиальная астма, смешанная форма» и/или «Гипертоническая болезнь», установленный согласно требованиям глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы и рекомендаций Всероссийского научного общества кардиологов / Российского кардиологического общества соответственно.

В исследование не включались пациенты, имеющие декомпенсированную сердечно-сосудистую патологию, тяжёлые нарушения функции печени и почек в анамнезе и иные состояния, способные оказывать значимое влияние на функцию дыхательной и сердечно-сосудистой систем и исследуемые показатели.

Пациенты, включённые в исследование, среди которых мужчин – 33 (46%) и женщин – 38 (54%), были разделены на 3 группы в зависимости от заболевания. В основную группу были включены 24 пациента с коморбидной патологией бронхиальной астмы и гипертонической болезни. Группы сравнения – группа больных с изолированной бронхиальной астмой и группа больных с изолированной гипертонической болезнью включали 23 и 24 пациента соответственно. Группы были сопоставимы по полу и возрасту.

Определение генетического полиморфизма генов синтаз оксида азота NOS1 84G/A и NOS3 786C/T проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории РязГМУ. Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» фирмы ООО НПФ «Литех» (г. Москва). Анализ генетического полиморфизма осуществляли методом аллель специфичной ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов амплификации. Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом свете. Результаты анализа флуоресцентного сигнала для каждого из образцов позволяют дать ответ о наличии или отсутствии каждого аллеля в гетеро- или гомозиготной форме.

Статистическая обработка полученных результатов выполнялась с использованием ПО Microsoft Excel 2016, StatSoft Statistica 10 и DoctorStat 1.9. Оценка распределения признаков производилась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Учитывая отличное от нормального распределение исследуемых признаков, данные представлены в виде Me [Q25; Q75], где Me – медиана, а Q25 и Q75 – нижний и верхний квартили. Для сравнения групп по количественному признаку использованы критерии Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни. Сравнение относительных показателей качественных признаков (частот и долей) выполнено по критерию χ² Пирсона. Для количественной оценки зависимости вероятности исхода от наличия фактора применён показатель отношения шансов с 95% доверительным интервалом. Оценка взаимосвязи количественных признаков между собой приведена с использованием коэффициента корреляции r Спирмена. Статистически значимыми считались различия при p < 0,05.

Определение сопоставимости распределения аллелей изучаемых полиморфизмов в исследуемой выборке по отношению к популяции проводилось путем оценки соответствия равновесию Харди-Вайнберга. Для оценки связи полиморфизма с развитием заболевания использовалась общая и мультипликативная модель наследования в зависимости от соответствия равновесию Харди-Вайнберга.

Результаты и их обсуждение

Среди пациентов генетическая информация полиморфизма NOS1 84G/A распределилась следующим образом: GG-генотип – 18 человек (25%), GA-генотип – 24 человека (34%), AA-генотип – 29 человек (41%), аллель G – 42% (n=60), аллель A – 58% (n=82). Распределение не соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (χ2 = 6,71, p = 0,01). Генетическая информация полиморфизма NOS3 786C/T у исследуемых распределилась следующим образом: CC-генотип – 9 человек (12%), CT-генотип – 31 человек (44%), TT-генотип – 31 человек (44%), аллель C – 35% (n=49), аллель T – 65% (n=93), что соответствует равновесию Харди-Вайнберга (χ2 = 0,08, p = 0,77). Распределение генетической информации по исследуемым группам представлено в таблице 1.

 

Таблица 1. Распределение генетической информации полиморфизмов NOS1 84G/A и NOS3 786C/T в исследуемых группах

Генотип / Аллель	БА и ГБ	БА	ГБ	p
NOS1 84G/A
GG	0,250	0,174	0,330	χ2 = 2,13, p = 0,712
GA	0,375	0,391	0,250
AA	0,375	0,435	0,417
G	0,437	0,370	0,458	χ2 = 4,19, p = 0,123
A	0,563	0,630	0,542
Соответствие равновесию Харди-Вайнберга	χ2 = 1,36, p = 0,24	χ2 = 0,59, p = 0,44	χ2 = 5,92, p = 0,02
NOS3 786C/T
CC	0,083	0,261	0,042	χ2 = 10,49, p = 0,03
CT	0,458	0,522	0,333
TT	0,458	0,217	0,625
C	0,313	0,522	0,208	χ2 = 10,55, p = 0,005
T	0,688	0,478	0,792
Соответствие равновесию Харди-Вайнберга	χ2 = 0,11, p = 0,74	χ2 = 0,05, p = 0,83	χ2 = 0,00, p = 0,96

 

При анализе распределения генетической информации полиморфизма NOS1 84G/A в исследуемых группах не определяется достоверного отличия частот генотипов в зависимости от группы пациентов (χ2 = 2,13, p = 0,712), однако обращает на себя внимание тенденция к увеличению доли генотипа GG полиморфизма NOS1 84G/A в ряду БА<БА и ГБ<ГБ (0,174 – 0,250 – 0,330), что может указывать на его связь с исследуемой патологией.

Оценивая распределение генетической информации полиморфизма NOS3 786C/T в исследуемых группах установлено, что исследуемые группы достоверно отличаются друг от друга как по распределению аллелей (χ2 = 10,55, p = 0,005), так и по распределению отдельных генотипов (χ2 = 10,49, p = 0,03), что позволяет говорить о связи данного полиморфизма с развитием бронхиальной астмы и гипертонической болезни. Интересно, что распределение генетической информации в основной группе находится в промежуточном состоянии между больными с изолированной бронхиальной астмой и изолированной гипертонической болезнью, что позволяет предположить о том, что данный полиморфизм по-разному изменяет активность синтазы оксида азота при бронхиальной астме и гипертонической болезни. Сравнивая группу больных с коморбидной патологией БА и ГБ и группу больных с изолированной БА установлено достоверное увеличение частоты встречаемости T-аллели и снижение встречаемости C-аллели (χ2 = 4,24, p = 0,04). Рассчитывая относительный риск, установлено, что T-аллель полиморфизма NOS3 786C/T в 2,4 раза увеличивает шанс развития коморбидной патологии бронхиальной астмы и гипертонической болезни по сравнению с изолированной бронхиальной астмой (OR = 2,40, 95% CI: 1,04-5,56). Полученные результаты в целом соотносятся с описанными ранее. Так в исследовании Калинина Р.Е. показано, что генотип TT чаще встречается у пациентов с трофическими язвами и тяжёлыми трофическими нарушениями у пациентов с хронической венозной недостаточностью нижних конечностей, что так же, как и развитие артериальной гипертензии связано с уменьшением продукции оксида азота в эндотелии у пациентов с данным полиморфизмом [8]. А исследование, проведённое в Чехии, показывает, что T-аллель полиморфизма NOS3 786C/T может быть связана с развитием артериальной гипертензии [9]. Это позволяет рекомендовать оценку полиморфизма для оценки риска развития гипертонической болезни у больных бронхиальной астмой.

Для оценки клинического значения полиморфизмов NOS1 84G/A и NOS3 786C/T больные были распределены на группы по степеням тяжести и ступеням базисной терапии бронхиальной астмы, а также по стадиям и степеням гипертонической болезни. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

 

Таблица 2. Распределение генетической информации полиморфизма NOS1 84G/A в зависимости от течения БА и ГБ

	Генотип			Аллель		Соответствие равновесию Харди-Вайнберга
	GG	GA	AA	G	A
Степень тяжести БА
Среднетяжёлая БА	0,154	0,538	0,308	0,423	0,577	χ2 = 0,14, p = 0,71
Тяжёлая БА	0,235	0,324	0,441	0,397	0,603	χ2 = 3,58, p = 0,06
p	χ2 = 1,84, p = 0,40			χ2 = 0,05, p = 0,82
Ступень терапии БА
3	0,154	0,538	0,308	0,423	0,577	χ2 = 0,14, p = 0,71
4	0,190	0,330	0,476	0,357	0,643	χ2 = 1,58, p = 0,21
5	0,308	0,308	0,385	0,462	0,538	χ2 = 1,89, p = 0,17
p	χ2 = 2,54, p = 0,64			χ2 = 0,78, p = 0,68
Стадия ГБ
I	0,100	0,500	0,400	0,350	0,650	χ2 = 0,10, p = 0,75
II	0,300	0,400	0,300	0,500	0,500	χ2 = 0,40, p = 0,53
III	0,357	0,214	0,429	0,464	0,536	χ2 = 9,07, p < 0,01
p	χ2 = 4,21, p = 0,38			χ2 = 0,76, p = 0,69
Степень ГБ
I	0,333	0,500	0,167	0,583	0,417	χ2 = 0,00, p = 0,94
II	0,211	0,316	0,474	0,368	0,632	χ2 = 1,96, p = 0,16
III	0,348	0,261	0,391	0,478	0,522	χ2 = 5,24, p = 0,02
p	χ2 = 2,67, p = 0,61			χ2 = 2,00, p = 0,36

 

Таблица 3. Распределение генетической информации полиморфизма NOS3 786C/T в зависимости от течения БА и ГБ

	Генотип			Аллель		Соответствие равновесию Харди-Вайнберга
	CC	CT	TT	C	T
Степень тяжести БА
Среднетяжёлая БА	0,154	0,385	0,462	0,346	0,441	χ2 = 0,29, p = 0,59
Тяжёлая БА	0,174	0,529	0,294	0,654	0,559	χ2 = 0,18, p = 0,67
p	χ2 = 1,21, p = 0,55			χ2 = 0,70, p = 0,40
Ступень терапии БА
3	0,154	0,385	0,462	0,346	0,441	χ2 = 0,29, p = 0,59
4	0,143	0,476	0,381	0,381	0,538	χ2 = 0,00, p = 0,96
5	0,231	0,615	0,154	0,619	0,462	χ2 = 0,74, p = 0,39
p	χ2 = 3,10, p = 0,54			χ2 = 2,34, p = 0,31
Стадия ГБ
I	0,000	0,500	0,500	0,250	0,750	χ2 = 1,11, p = 0,29
II	0,100	0,400	0,500	0,300	0,700	χ2 = 0,02, p = 0,88
III	0,071	0,357	0,571	0,250	0,750	χ2 = 0,06, p = 0,80
p	χ2 = 1,38, p = 0,85			χ2 = 0,21, p = 0,90
Степень ГБ
I	0,000	0,667	0,333	0,333	0,667	χ2 = 1,50, p = 0,22
II	0,000	0,421	0,579	0,211	0,789	χ2 = 1,35, p = 0,25
III	0,130	0,304	0,565	0,283	0,717	χ2 = 1,43, p = 0,23
p	χ2 = 5,44, p = 0,24			χ2 = 0,94, p = 0,63

 

Установлено, что исследуемые полиморфизмы не оказывают влияния на течение гипертонической болезни. Кроме этого не установлено влияния полиморфизма NOS3 786C/T на тяжесть бронхиальной астмы и объём базисной терапии требуемой для поддержания контроля БА. Также определено, что полиморфизм гена NOS1 84G/A не оказывает статистически значимого влияния на течение БА, однако выявлена тенденция к увеличению частоты выявления генотипа GG как с увеличением тяжести бронхиальной астмы, так и с увеличением объёма базисной терапии, что может указывать на определённую роль этого полиморфизма в патогенезе БА.

Выводы

1. У больных с коморбидной патологией бронхиальной астмы и гипертонической болезни выше частота встречаемости T-аллели полиморфизма NOS3 786C/T и ниже частота встречаемости C-аллели по сравнению с больными с изолированной бронхиальной астмой.
2. Риск развития коморбидной патологии бронхиальной астмы и гипертонической болезни по сравнению с изолированной бронхиальной астмой в 2,4 раза выше у носителей T-аллели полиморфизма NOS3 786C/T (OR = 2,40, 95% CI: 1,04 – 5,56).
3. Для выявления больных бронхиальной астмой, у которых имеется повышенный риск развития гипертонической болезни, может быть использована оценка полиморфизма NOS3 786C/T.
4. Исследуемые полиморфизмы не оказывают влияния на течение гипертонической болезни и бронхиальной астмы

Конфликт интересов отсутствует.

Об авторах

А. В. Шаханов

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: shakhanovav@gmail.com

очный аспирант кафедры факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней

Россия, 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

А. А. Никифоров

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: shakhanovav@gmail.com

к.м.н., доцент, заведующий Центральной научно-исследовательской лабораторией

Россия, 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

О. М. Урясьев

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: shakhanovav@gmail.com

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой факультетской терапии с курсами эндокринологии, клинической фармакологии, профессиональных болезней

Россия, 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

Список литературы

Дополнительные файлы